Beyin Dokusu Kronik Optogenetic uyarılması için Fiber-optik İmplantasyon

Özet

Optogenetics gelişimi artık kesin tanımlı genetik nöronlar ve devreler uyarmak için araç, hem de sağlar In vitro Ve In vivo. Burada beyin dokusunun kronik photostimulation için optik fiber montaj ve implantasyon açıklar.

Özet

Sinirsel bağlantıda durulaştırmada desenleri klinik ve temel hem nörobilim için bir meydan okuma olmuştur. Elektrofizyoloji sinaptik bağlantı desenleri analiz etmek için altın standart olmuştur, ama eşleştirilmiş elektrofizyolojik kayıtlar hantal ve deneysel sınırlayıcı hem de olabilir. Optogenetics gelişimi in vitro ve in vivo ^{1 2,3} hem de nöronlar ve devreler uyarmak için zarif bir yöntem tanıttı. Ayrık nöronal popülasyonlarda opsin ifade sürücü hücre tipi spesifik promotor aktivitesi istismar ederek, tek bir doğrusu farklı devreleri ^4-6 tanımlı genetik nöronal alt uyarabilir. Elektrik stimülasyonu ve / veya farmakolojik manipülasyonlar dahil nöronlar, teşvik etmek de anlatılan yöntemlerin sık sık invaziv hücre tipi ayrım vardır ve çevre dokulara zarar verebilir. Bu sınırlamalar, normal sinaptik fonksiyon ve / veya devrenin davranışını değiştirebilir. Bunlara ilave olarak,manipülasyon doğası, mevcut yöntemleri sıklıkla akut ve terminal vardır. Optogenetics nispeten zararsız bir şekilde nöronları uyarır, ve genetik olarak hedeflenen nöronlarda olanağı tanıyor. In vivo olarak optogenetics içeren çalışmaların çoğu şu anda bir kanül implant ^6,7 yönlendirilirler bir optik fiber kullanmak, ancak bu yöntem sınırlamalar bir optik fiber tekrarlanan ekleme ile hasarlı beyin dokusu, ve kanül içinde fiberin kırılma potansiyeli vardır. Optogenetics arasında gelişen alanda göz önüne alındığında, kronik stimülasyon daha güvenilir bir yöntemle daha az teminat doku hasarı ile uzun vadeli çalışmalar kolaylaştırmak için gereklidir. Burada, etkili ve şık bir Sparta ve ark anlatılan yönteme tamamlamak için bir video madde olarak modifiye protokol sağlar. ⁸ anestetize farelerin kafatası üzerine bir fiber optik implant ve kalıcı tespit üretiminde, hem de in tertibatı için lifoptik bağlantı elemanı bir ışık kaynağına implant bağlayan. Bir katı hal lazer fiber optik ile bağlı implant, kronik az doku hasarı ⁹ küçük, çıkarılabilir, iplerini kullanarak işlevsel nöronal devreler photostimulate için etkili bir yöntem sağlar. Fiber optik implantlar Daimi fiksasyon sağlar tutarlı, minimal doku hasarı olan ¹⁰ uyanık, davranmasıyla farelerde nöronal devrelerin vivo optogenetic çalışmalarda uzun vadeli.

Protokol

Ilgili üretici ve / veya satıcıları ile birlikte * Bütün malzemeler protokolü aşağıda listelenmiştir.

1. İmplant Meclisi

1. 1 g reçine ile sertleştirici 100 mg eklenmesi ile ısı ile sertleşen fiber optik epoksi oluşan bir karışım hazırlayın.
2. Ölçün ve bir kama uçlu karbür kâtip ile puanlama ile 100 mikron çekirdek ile optik 125 mikron fiber yaklaşık 35 mm kesti. Tek, tek yönlü hareket fiber optik ve skoru katip dik yerleştirin. Fiber Kesme tamamen fiber çekirdek zarar verecektir.
3. Yardımcısı içine taşıyan bir 127 mikron olan yüksük bir LC seramik yerleştirin, dışbükey tarafı aşağı çekti.
4. Halka içine optik lif yerleştirin. Optik lif sorunsuz slayt ve marjinal halka (Şekil 1a) konveks sonunu çıkıntı yapmalıdır.
5. Epoksi siyah olana kadar ısı tabancası ile düz ucunu ve ısı ısı kurutmalı fiber optik epoksi bir damla uygulayın. Epoksi gerekirısıtılan ve daha önce kür olarak halka doldurun. Epoksi sabit ısı uygulaması ~ 1 dk içinde tedavi edilmelidir.
6. Bu bağlantı elemanı ile arabirim engelleyici olarak, halka yanları boyunca herhangi bir epoksi temizleyin.
7. Parlatma pedi üzerine alüminyum oksit parlatma yaprak (Şekil 1b) bir LC fiber optik parlatma diski (FOPD) kullanarak halka ve dışbükey sonuna Lehçe. Dairesel dönme desenleri olun ve aşağıdaki sırayla dört sınıflarda lehçe: 5, 3, 1 0.3 mikron kum.
8. İlgilenilen bölge hedef alan bu gibi uygun uzunlukta düz sonunda optik fiber kesin. Uzunluk, stereotaksik atlası kullanılarak tespit edilebilir.
9. Aşağıda açıklanan bağlayıcı kablosu üzerinden lazer bağlayarak implant sınayın. İmplantın cilalı ucu manşonun kol takılan ve karşıt halka ile doğrudan temas yapmak gerekir. İmplant inci ucunda ölçülen ışık çıkışı 10 mW korumak gerekire implant lif. Kötü bir implant optik fiber ucuna yakın bir zayıf bir odak noktası olacaktır.
10. Kullanıma kadar köpük içinde bitmiş implantlar (Şekil 1c) saklayın.

2. Fiber Optik çoğaltıcı Kordon Meclisi

1. Yukarıdaki gibi ısı ile sertleşen fiber optik epoksi oluşan bir karışım hazırlayın.
2. Ölçün ve bir kama uçlu karbür kâtip ile puanlama 200 mikron çekirdek ile optik 220 mikron fiber uygun uzunlukta kesilir. Lif uzunluğu fare gövde etrafında serbestçe hareket etmesine izin verir ama fare elyaf ile çiğnemek izin verilmemelidir.
3. Optik lif uzunluğu biraz daha uzun dallanma borusunun bir uzunluk içine optik fiber ekler. Tüp optik fiber biraz daha büyük bir iç çapa sahip olmalıdır.
4. Şerit ~ 25mm optik fiber bir ucunda ve Multimode FC MM metal uç takın durana kadar 230 mikron deliği ile Meclis Yüksük. Optik fiber ferru dışarı sopa gerekirle sonu (Şekil 2a).
5. Metal sonunda (süper yapıştırıcı) siyanoakrilat ile bağlantıyı sabitleyin. Bağlayıcı Boot ile bağlantı örtün ve FC FOPD ile halka sonuna parlatın. 5, 3, 1, 0.3 mikron grit (Şekil 2b): dairesel dönme desen ve aşağıdaki sırayla dört sınıflarda lehçe olun.
6. Distal konveks uç ile bir LC seramik halka (230 um id oyuğu) içine optik fiber diğer ucunu soyun ve yerleştirin. Kürlenmeden düz uç ısı ve epoksi bir damla uygulayın.
7. Yukarıda tarif edildiği gibi alüminyum oksit parlatma levhalar üzerinde bir YP FOPD kullanarak halka ve dışbükey uç parlatmak.
8. Kol orta noktası kadar halka ve dışbükey ucu üzerinde bir LC halkalı kol getirin.
9. Sıra ısı shrink furkasyon boru ve bağlantı (Şekil 2c) güvenliğini sağlamak ve korumak için kol ve ateşte tüp.
10. Lazer kaynağı bağlayarak ve ışığı outp ölçerek bağlayıcı sınayınbir spektrofotometre ile bağlantı yoluyla ut. Lazer çıkışı ve ölçülen coupler çıkış arasındaki ışık kaybı% 30 geçmemelidir.

3. Cerrahi implantasyon

* Bu bir ipucu, yalnızca bir işlemdir. Aletleri steril ama eldiven alet ve ekipmanlar arasında sürekli manipülasyon nedeniyle olması gerekmez.

1. Intraperitoneal enjeksiyon Ketamin / Ksilazin karışım, 100 ve 30-gauge iğne kullanılarak sırasıyla 10 mg / kg ile fare anestetize.
2. Makası ile kafa derisi Tıraş. Betasept kez tekrarlayarak, iki dakika süreyle (% 4 çözelti Klorheksidin) mendil, ardından% 70 izopropil alkol ile kafa derisi temizleyin.
3. Sterotaxic teçhizat fare yerleştirin ve kafatası düzeyde olmasını sağlamak, kafa sabitleyin. Kuruluk ve postoperatif ağrıyı önlemek için gözleri oftalmik merhem uygulayın. Oksijen mou fizyolojik durumuna bağlı olarak seyreltildi buharlaşmasına izofluran (% 1-3 ile anestezi koruyunsürekli bir kuyruk tutam yanıt takip edilmelidir se,).
4. Lambda göz yörüngede kafatası açığa derisi orta hat boyunca bir kesi olun. Gerektiği gibi bağ dokusu bir kenara itin.
5. Cilt geri tutmak için Serafin kelepçeleri kullanın ve kafatası (Şekil 3a) bir erişim sağlamak.
6. Bir diş çekme ile kafatası yüzeyi boyunca etch bir damalı deseni. Steril serum fizyolojik ile pislikleri dışarı yıkayın. Iyice kurulayın.
7. Mikrogözenekler oluşturmak için ~ 2-3 saniye için bir pamuklu bezle maruz kafatasına hidrojen peroksit (% 3) uygulayın. Birden çok kez yıkayın ve iyice kurulayın. Sparta ve ark tarif edildiği gibi Alternatif olarak, ankraj, kafatası içine vidalanabilir. (2012).
8. Yine, etch bir kareli bir diş çekme ile kafatası boyunca desen ve salin ile enkaz yıkayacak. Iyice kurulayın.
9. Döner aracını kullanarak, steril bir matkap ucu ile küçük bir burr hole kraniotomi (çapı <1 mm) yapmak(Otoklav) Yukarıdaki bregma ve lambda kalibre stereotaksik atlas tarafından belirlenen faiz bölge. Dura kırmak veya herhangi bir dokuya zarar vermemek için dikkatli olun. Enkaz uzak yıkayın ve iyice kurulayın.
10. Prob tutucu içine fiber optik halka (implant) takın ve stereotaksik koluna bağlayın.
11. Doğrudan doğruya stereotaksik kol (Şekil 3b) kullanılarak ilgi bölgesi üzerinde yerinde implant yerleştirin. Beyin dokusu içinde optik fiber ekleme, fiber ~ 2 mm / dak 'lık bir hızla ağır ağır geliştirilmesi gerekmektedir. Ferrül kalan kafatası dayanması gerektiğini.
12. Diş çimento karışımı hazırlayın. Karışım kolayca kafatası boyunca uygulamak için yeterince düşük bir viskoziteye sahip olmalıdır. Karışım 2-4 dakika için kullanılabilecektir.
13. Steril bir kürdan kullanarak, kafatası boyunca ve implantın alt kısmı üzerine diş çimentosu, bir ince, düz bir tabaka uygulanır. Olarak diş çimento temel tabakası kafada kadar yüzey alanı kapsamalıdırmümkündür. Fare deri ile temas diş çimento izin vermeyin. Bu artan dikilmesi zorluk hem de fare tahrişe yol açacaktır. Diş çimento deri ile temas etmezse, kısmen çimento Tüm katmanı ayarı önce kapalı soyulmuş olabilir böyle kurutun.
14. Tamamen kurumasını bekleyin.
15. Her katmanın (Şekil 3c) tamamen kurumasını sağlayan, kafatası üzerinde ve implant çevresindeki küçük bir höyük oluşturmak için diş çimento bile kat kat uygulayın. Pürüzsüz, engelsiz bağlantı sağlamak için çimento temiz halka ve dışbükey sonu ~ 3-5 mm bırakın.
16. Diş çimento höyük üzerinde ve C22 iğne ile steril, tek kullanımlık ipek örgülü sütür (6-0) kullanarak implant çevresindeki derisi dikin. 7 gün sonra çıkarın. İsteğe bağlı: sütür sonra ek bağlama için kullanın Vet Bond. Minimal Vet Bond kullandığınızdan emin olun. Aşırı kaşıma nedeniyle ciddi cilt hasarına yol açabilir.
17. Immediatelameliyat sonrası y, fare deri altından sonrası ağrıyı azaltmak Ketprophen (5 mg / kg) ile enjekte edilmelidir. Bu 24 saat sonra tekrarlanmalıdır. Implantın tabanı sütüre cilde ve çevresinde topikal analjezikler (bupivakain) ve antibiyotik (Neosporin) uygulayın.
18. Derlenme için ısıtma battaniye üzerinde bir kafes içinde fare yerleştirin. Steril, ameliyat sonrası iyileşme kafesteki fare yerleştirin. Kurtarma kafes ısısını korumak ve boğulma önlemek için herhangi bir çarşaf içermemelidir. Fare orijinal kafes veya bir kez uyanık, yeni bir kafes iade edilebilir.

Işık kaynağı ve ilgi bölgesi içinde optik fiber uç arasında en az foton kaybı fiber optik implant ve manşon sonuç Uygun montaj. İyi cilalanmış fiber optik bir üniforma, konsantrik dairenin (Şekil 2d) ışık iletimi gerekir. Dikkatli implantasyon ve sütür ile implant gözle görülür hiçbir tahrişe nedenfare ve optik fiber veya iletilen ışık miktarının önemli bir bozulma olmadan uzun vadeli çalışmalar (Şekil 3d,> 1 ay, yayınlanmamış gözlemler) yerinde kalabilir. Uygun olmayan emplantasyon ya da dikişin tahriş olmasına neden olabilir ve nedeniyle sürekli manipülasyon diş çimentosu, çimento veya diş olan halka kırılması ortaya çıkaracak olan kafa derisi ile kazıma fare neden olabilir. Birleştirilen sisteminin şematik bir diyagramı Şekil 4'te görülebilir.

Şekil 1. Implante fiber optik Meclisi. (A) optik elyaf marjinal ok başı ile gösterilen uç ötesinde çıkıntı yapan dışbükey, yüksük içine yerleştirilir. (B) halka ve dışbükey sonu parlatma yaprak kademeli ince sınıflarda bir FOPD kullanılarak parlatılır. (C) mamul implante lif optic. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2. Implanta tether fiber optik döner eklem için kullanılan fiber optik bağlantı elemanı montajı. Halkalı montaj yoluyla (a) Fiber optik yapışıyor. (B) grubunun halkalı yan parlatma kağıdı kullanılarak FOPD ve parlak kademeli ince dereceleri içine yerleştirilir. (C) halka kovanı halka üzeri ve ısı shrink boru ile güvence altına alınır. (D) bitmiş fiber optik bağlantı elemanı minimum foton kaybı ile eşmerkezli bir ışık üretmek olmalıdır.

Şekil 3. Cerrahi implantasyon fiber optik. Craniu (a) tüm yüzeyim maruz kalmakta ve bağ dokusu temizlenir. (B) optik fiber implant steryotaksik bir kol ile bir konumda tutulur. (C) Diş çimento kafatasına fiber optik implant sabitleme uygulanır. (D) implantasyonu sonrası> 1 ay, cilt implant çevresindeki iyileştikten ve irritasyon bulguları vardır.

Şekil 4. Fonksiyonel sisteminin şematik diyagramı

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Optogenetics spesifik nöronal alt üzerinde benzersiz kontrol sağlayan yeni ve güçlü bir tekniktir. Bir elektrot aracılığıyla hücre tipi gelişigüzel ve elektriksel stimülasyon invaziv etkilerden kaçınarak Bu, anatomik ve zamansal hassas sinir devreleri modüle istismar edilebilir. Fiber optik İmplantasyonu dokuya en az zarar ile farelerin davranmak, uyanık birden fazla seans nöral devrelerin tutarlı, kronik stimülasyon sağlar. Bu sistem, aslında Sparta ark tarafından öncülük etmiştir....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif veya Ekipman Adı	Şirket	Katalog #	Yorumlar
LC Yüksük Kol	Hassas Fiber Ürünler (PFP)	SM-CS125S	1.25 mm ID
FC, MM ön montajlı Konnektör	PFP	MM-CON2004-2300	230 mikron Yüksük
Miller FOPD-LC Disk	PFP	M1-80754	LC yüksükler için
Furkasyon boru	PFP	FF9-250	900 mikron od, 250 mikron id
MM LC Stik 1,25 mm Yüksük	PFP	MM-FER2007C-1270	127 mikron ID Çap
MM LC Stik 1,25 mm Yüksük	PFP	MM-FER2007C-2300	230 mikronKimliği Çap
Isı ile sertleşen epoksi, sertleştirici ve reçine	PFP	ET-353ND-16oz
FC / PC ve SC / PC Bağlayıcı Parlatma Diski	ThorLabs	D50-YP	FC yüksükler için
Dijital optik güç ve Enerji Ölçer	ThorLabs	PM100D	Spektrofotometre
Parlatma Pad	ThorLabs	NRS913	9 "x 13" 50 Durometre
0.3, 1, 3, 5 mikron irmik: (Parlatma) Levhalar Lepleme Alüminyum oksit	ThorLabs	LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P
Standart Sert Kaplama Multimode Fiber	ThorLabs	BFL37-200	Düşük OH, 200 mikron Çekirdek, 0.37 NA
Fiber kablo sıyırma aleti	ThorLabs	T10S13	Kaplı / Coat: 200 mikron / 300 mikron
SİLİKA / SİLİKA Fiber Optik	Polymicro Teknolojileri	FVP100110125	Yüksek-OH, UV Geliştirilmiş, 0.22 NA
1x1 Fiberoptik Rotary Ortak	Dorik lensler	FRJ_FC-YP
Mono Fiberoptik Patchcord	Dorik lensler	MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC
Tüp, 1/8 inç küçültmek Isı	Müttefik Elektronik	689-0267
Isı tabancası	Müttefik Elektronik	972-6966	250 W; 750-800 ° F
Pamuk aplikatörler uçlu	Püriten Tıbbi Ürünler Şirketi	806-WC
VetBond doku yapıştırıcısı	Fischer Scientific	19-027136
Flaş protez kaide akrilik	Yates Motloid	ColdPourPowder + Liq
BONN Minyatür Iris Makas	Integra Miltex	18-1392	3-1/2 "(8.9cm), düz, 15 mm bıçaklar
Johns Hopkins Bulldog Kelepçe	Integra Miltex	7-290	Kavisli 1-1/2 "(3,8 cm),
MEGA-Tork Elektrik Lab Motoru	Vektör	EL-S
Panther Frezleri-Ball # 1	Clarkson Laboratuvarı	77.1006
Mor Mavi Lazer Sistemi	CrystaLaser	CK473-050-O	Dalga boyu: 473 nm
Lazer Güç Kaynağı	CrystaLaser	CL-2005
Dumont # 2 Laminektomi Forseps	Fine Bilim Araçları	11223-20
Sonda	Güzel Bilim Araçları	10140-02
5 "Düz Hemostat	EXCELTA	35-PH
Ağırlıklı taban ile Mengene	Altex Elektronik	PAN381