Büyüyen Aksonlar boyunca murin Schwann Hücresi Kalkınma Analizi

Özet

Burada SC'ler uzanan aksonlar boyunca geliştirmek için mümkün olduğu bir Schwann hücresi (SC) göç tahlil tarif.

Özet

Periferik sinirlerin gelişimi ilginç bir süreçtir. Nöronlar insanlarda 100'den fazla cm uzaklıkta nöronun soma gelen genellikle belirli hedeflere, innerve aksonlar gönderir. Gelişme sırasında nöronal hayatta kalma hedef türevi büyüme faktörleri üzerinde değil, aynı zamanda Schwann hücreleri (SC'ler) bir desteğe bağlıdır. Sinaps veya nöromuskuler kavşağa nöronal soma (veya merkezi periferik sinir sistemine geçiş) bölgesinden Bu amaçla SC ensheath aksonlar için. Schwann hücreleri nöral krest türevleri ve tüm akson SC'ler ile kaplıdır kadar çıkan aksonlar boyunca habercileri olarak göç ederler. Bu periferik sinir sisteminin gelişimi için SC göçün önemini göstermektedir ve bu sürecin araştırılması gerekliliğini vurgulamaktadır. SC gelişme analiz etmek için, bir ayar da geçiş için onların fizyolojik alt tabaka, akson içeren SCs yanında olan ihtiyaç vardır. Intrauterin gelişme nedeniyle (Mus musculus) fare gibi plasental omurgalılarda mümkün değildir. Bunu aşmak için, biz üstün servikal ganglion (SCG) eksplant tekniği uyarlanmıştır. Sinir büyüme faktörü (NGF) ile tedavi üzerine SCG eksplantlar gangliyondan çevreye aksonları boyunca göç SC öncüleri takip aksonlar uzatmak. Bu sistemin güzelliği SC endojen SC bir havuz ve onlar aynı anda büyüyor kendi fizyolojik aksonlar boyunca göç ettiğini elde olmasıdır. Aksonlar boyunca SC gelişimi SC göç içgörüler kazanmak için başka imkanların açıldığı, time-lapse görüntüleme ile analiz edilebilir, çünkü bu sistem, özellikle şaşırtıcıdır.

Protokol

1. Kollajen Jeller hazırlanması

1. 455 ul 10x MEM, 112 ul% 7.5 _NaHCO3, 50 ul glutamin ve NaOH içeren bir stok ortamı hazırlayın. Konsantrasyon ve NaOH miktarı sıçan kuyruğu kolajeni hazırlanması (1.2), 1.000 ul olmak stok orta son hacmine bağlıdır.
2. Ebendal (1) 'e göre-fare kuyruk kolajeni hazırlayın. 4 ° C'de depolayın Kolajen çözeltisi Kollajen çözümün bir bozulma gözlenmemektedir. Yeni bir toplu hazırlandıktan sonra, (1.1) stok ortam için gerekli olan NaOH konsantrasyonunun tahmin. NaOH miktarı ve konsantrasyon titrasyonu için ortamın pH gösterge kullanın. 800 ul asidik fare kuyruk kolajeni stok orta 210 ul karıştığında kırmızı bir gölge çevirmek zorunda. NaOH konsantrasyonunun çok düşük ise kolajen çözeltisi ortamın pH gösterge dolayı, sarı dönecektir. Eşya olmadan ortam ve karışım için kolajen eklemekabarcıklar ucing. Buz üzerinde bu adımları uygulayın. Polimerizasyon kolajen çözeltisi ve stok orta karıştırıldıktan sonra 2 saat içinde meydana gelir ve yeni çözelti 37 ° C de kuluçkaya bırakılır Bir deneme başlamadan önce bunu sınayın. 1.3) stok orta 210 ul (1.2) ile kollajen solüsyonu 800 ul karıştırın. 8 de kamara slayt kuyularda bu çözüm yeri 100 ul. 37 slaytlar inkübe ° C,% 5 _CO2 ve bir hücre kültürü inkübatöründe nemli koşullar. Bir hücre kültür tezgah ve steril koşullar altında kolajen jellerin hazırlanması. Kollajen 2 saat içinde gelatinizes.

2. Embriyonik SCGs diseksiyonu

1. Kez hamile rahim fareler (E16-18) ve daha fazla ihtiyaç kadar PBS saklayın Harvest embriyolar.
2. Amniyon itibaren bir embriyo teşrih. Klavikula düzeyinde kaudal embriyo başını kesmek. "Böcek-iğne" ile Silikon alt yemeğin üzerine başını düzelt. Başın ventral tarafında bir size karşı karşıya bulunmaktadırEğer submandibuler bölgede görmek olurdu. Fiksasyon daha kolay hazırlanmasını sağlar.
3. Sol ve sağ submandibular bölgedeki cilt çıkarın ve deri altı bağ dokusu ile.
4. Hyoid, infrahyoidal kas ve SKM kas üzerine görünümünü temizlemek için kendi konumdan submandibular tükrük bezleri çıkarın.
5. Gırtlak ve nefes borusu üzerine görünümünü temizlemek için dikkatle bu kaslar çıkarın. Trakea ve larinks çıkarın. Karotis arterler sonra prevertebral kaslar üzerinde her iki tarafta görülür. SCG karotid arterlerin çatallanma bulunan ve oval bir şekil vardır. Dikkatlice ganglionlar kaldırmak ve PBS koyun. Onları yapışmasını iseniz diseksiyon araçları yavaşça ganglionlarda çıkarın. Bu forseps hem de SCG çıkarılması için bir "böcek iğne" ile monte edilmiş bir iğne tutucuya kullanmak için faydalıdır.
6. Eğer enou parçalara kadar bir kez PBS içinde, PBS içinde oda sıcaklığında saklayın gangliyongh ganglionlarda. Sonra kan damarları ve bağ dokusundan ganglionlarda temizleyin. Bir laminer akış tezgah altına yerleştirilen bir diseksiyon mikroskobu altında SCG diseksiyonu ve temizlik yapın.
7. Son olarak, daha kolay kullanım için şırınga üzerine monte şırınga iğne yardımıyla jelatinize kollajen jeller üzerine eksplante ganglionlarda yerleştirin.
8. _% 5 CO2 ile nemli koşullar ile, 37 ° C 'de bir hücre kültürü kuluçka makinesi içinde jelatinleştirilmiş kollajen SCG eksplantlar inkübe edin.

3. SCG Eksplantlarından Tedavisi

1. 1-2 saat inkübasyondan sonra, B27 takviyesi, glutamin ve antibiyotik içeren 100 ul Neurobasal hücre kültür ortamı ile SCG eksplant içeren kollajen kapsamaktadır. Artık oda slaytların kuyular 200 ul (100 ul ve 100 ul jel orta) bir hacmi içerir. , Besiyerinin bir 200 ul ekle ancak şimdi akson büyümesini kolaylaştırmak için NGF (60 ng / ml) içeren. Buna uygun olarak, NGF, nihai konsantrasyon 30 ng / ml 'dir.
2. 1. SC göç başlangıçlı araştırmak için, in vitro 0 (DIV0) gün doğrudan ek faktörler ekleyin. Gerekli olan çift konsantrasyonu (2) 'de NGF içeren medyumda faktörler çözülür.
   2. Zaten aksonlar boyunca göç başladı SC'ler, üzerindeki etkisini analiz etmek amacıyla, DIV4 (deney potansiyel durağı) kadar DIV3 ilave faktörler ekleyin. Bu amaçla, dikkatlice DIV3 de çözelti 180 ul kaldırmak ve 200 ul yeni ortamı içeren NGF ve çift konsantrasyonu (2) çıkar ve ek faktörler ekleyin.

4. Time-lapse Görüntüleme

Analizler için bir inverted mikroskop kullanın. Çeşitli amaçları görünümü ve büyütme alanını tanımlayarak, kullanılabilir. SCG eksplant görüntüleme cam slayt ve kollajen ile gerçekleştirilir olarak önemli bir yönü ise, ikinci amacı çalışma mesafesijel. 1/10-30 dakika kayıt kare hızı iyi sonuçlar (2) gösterdi. Bununla birlikte, bu görünüş bilimsel soruya ayarlanmak zorundadır. Normal bir CCD kamera ile görüntü elde etmek için de kullanılabilir. Zaman atlamalı görüntüleme için bir hücre kültürü inkübasyon odası mikroskop aşamasına bağlı olmak zorundadır. _% 5 CO2 ile nemli koşullar ile, 37 ° C de görüntüleme sırasında doku inkübe edin. Görüntüleme başlamadan önce kuluçka sistemi bir saat başlatın. Bu odaya slayt dahil mikroskop parçaları (örneğin objektif) sıcaklığa ayarlamanızı sağlar ve sıcaklık kaynaklı sürüklenir önler. Mikroskop yazılım yardımı ve SCG eksplantlar farklı uygulanan koşulların eşzamanlı analizleri için bir yazılım kontrollü motorize aşaması (Çok pozisyonlu ayar) ile analizler belirli alanlarda (eksplant üzerinde olan ve farklı eksplant arasında) tanımlayın. Kullanılabilir hızlandırılmış görüntüleme yabani-tip doku hem de transjenik hayvanlardan elde edilen doku için(3): SC'ler (GFP S100B) markalama. Görüntüleme floroforlar için bir floresan ışık kaynağı micropscope kurulum uygulanacak vardır. Standart filtreleri kullanın.

5. SC göç mesafeleri kantifikasyonu

1. Son nokta (örneğin DIV4) az, 3-4 saat boyunca odasında slayt% 4 PFA ile kollajen jeller sabitleyin. Ardışık olarak PBS ile 10 dakika için kolajen jellerin 5 kez yıkayın. Immünsitokimya (2) için standart protokoller uygulayın. Eğer SCGs hazırlanması için yeni iseniz, tirozin hidroksilaz karşı immünohistokimyasal tarafından sempatik ganglion (TH) katekolaminerjik hücreler için ortak bir belirteç olarak ganglion kimliğini doğrulamak. Immünohistokimya sırasında (birincil antikor sonra), jeller yıkama için yararlı olan daha büyük bir hacimde sahip 24 gözlü levhalar için eksplant ihtiva eden kolajen jellerin aktarın.
2. Immünhistokimya sonra, cam slaytlar kollajen jel dikkatlice yerleştirin. DikkatliceKalan çözüm kaldırmak ve kollajen kurulayın / iki boyut için küçültmek sağlar. Bu mesafe (2) kolayca ölçümleri sağlar. Bundan sonra, örnekleri monte.
3. Nihayet, Fiji (NIH) yazılımı yardımıyla göç mesafeleri ölçmek. Hiçbir özel eklentileri bu amaçla ihtiyaç vardır. Um içinde doğru ölçümler sağlamak için, doğru görüntüleme metadata ve Fiji altındaki ayarları, görüntü ve ölçek kontrol edin. Hücrelerin ölçümü için de Fiji kullanın.

Sonuçlar

Aksonal büyüme NGF (4) (film düzeni S1 Şekil 1 düzeni) ile muamele üzerine ikinci eksplantlar SCG kolaylaştırılır. Bu işlem herhangi bir inverted mikroskop ile görülebilen ve time-lapse görüntüleme (film S2) takip edilebilir. Bir bilim adamı fare embriyoları SCG diseksiyon için yeni ise şiddetle basit bir anti-tirozin hidroksilaz (TH) immünohistokimyasal olarak tekniğin bir doğrulama öneririz. TH etiketi aksonlar (Şekil 2B) katekolaminerjik nör...

Tartışmalar

Periferik sinir sisteminin gelişimi heyecan verici bir süreçtir. Gelişimi tamamlandıktan sonra, aksonların, insanlarda, sık sık, 100 cm olabilir tüm uzunluğu boyunca, SKS ile ensheathed edilir. Bu amaca yönelik olarak, gerekli SCs sayısı doğru gelişme sırasında oluşturulmalıdır ve SCs da tam kapsamı sağlamak aksonal için çevre uzanan akson boyunca hareket etmek zorunda. Bu miyelinli hem de için unmeylinated aksonlar için de geçerlidir. Her iki durumda da tüm aksonların SCs ile temas halinde ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif / Malzeme Adı	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar
10x MEM	Gibco	21430
Sodyum Bikarbonat (% 7.5)	Gibco	25080
Glutamin	Gibco	25030
NaOH	Merck	109137
NGF	Roche	1058231	ARGE # 556-NG-100
Neurobasal Orta	Gibco	21103
B27 Supplement	Gibco	17504
antibiyotikler	Gibco	15640
d-PBS	Gibco	14040
Böcek iğneleri	FST	26002-20
şırınga iğnesi	Braun		BD # 300013
8 de kamara slayt	Lab tek	177402