LeafJ: Yarı otomatik Yaprak Shape Ölçüm için bir ImageJ Plugin

Özet

Yüksek verimlilik yaprak ölçümler için anahtar yöntemleri gösterilmesi. Bu yöntemler, yaprak fenotip ile pek çok bitki mutant ya da başka tarama bitki incelenirken yaprak fenotipleme hızlandırmak için kullanılabilir.

Özet

Yüksek verim fenotipleme (phenomics) (yorum ¹ ve yeni örnekler ^2-4 bakın) işlevlerine genleri bağlantı için güçlü bir araçtır. Yapraklar birincil fotosentetik organı vardır, ve boyutu ve şekli, bir bitki içinde gelişimsel olarak ve çevresel olarak değişir. Bu nedenlerden dolayı yaprak morfolojisi üzerine çalışmaları iyi yarı otomatik phenomics araçlar ^5,6 yapılır sayısız yaprakları, birden fazla parametre ölçüm gerektirir. Canopy gölge bitki mimarisi ve yaşam öyküsü etkileyen önemli bir çevresel işaret olduğunu; yanıtların paketi topluca gölgede kaçınma sendromu (SAS) ⁷ denir. SAS yanıtları arasında, gölge uyarılmış yaprak sapı uzama ve bıçak alan değişiklikleri indeksleri ⁸ olarak özellikle yararlı olmaktadır. Bugüne kadar, yaprak şekli programlar (örn. SHAPE ^9, LAMINA ^10, LeafAnalyzer ^11, LEAFPROCESSOR ¹²⁾ yaprak anahatları ölçmek ve yaprak şekilleri kategorilere ayırabilirsinizAma yaprak sapı uzunluğu çıkışını alamazsınız. Yaprak sapı büyük ölçekli ölçüm sistemlerinin eksikliği SAS araştırma phenomics yaklaşımlar inhibe etmiştir. Bu yazıda, hızla model bitki Arabidopsis thaliana sapı uzunluğu ve yaprak ayası parametreleri ölçebilen LeafJ adlandırılan, yeni geliştirilmiş ImageJ eklentisi, tarif. Sapı / yaprak ayası sınır gerekli manuel düzeltme biz bir dokunmatik ekranlı tablet kullanılan sıra yaprak için. Ayrıca, yaprak hücre şekli ve yaprak hücre sayıları yaprak boyutu ¹³ önemli belirleyicileri. LeafJ ayırın biz de hücre şekli, alanı ve boyutunu ölçmek için bir dokunmatik ekranlı tablet kullanmak için bir protokol mevcut. Bizim yaprak sürekli ölçüm sistemi gölge-kaçınma araştırma ile sınırlı değildir ve yaprak fenotipleme tarafından birçok mutantlar ve tarama bitkilerin yaprak fenotipleme hızlandıracaktır.

Protokol

1. Bitki Materyalleri

Bu bitki büyüme protokolü gölge kaçınma yanıtını tespit için amaçlanmıştır unutmayın. En sevdiğiniz koşul altında bitkiler büyüyebilir.

1. Karanlıkta dört gün boyunca 4 az 9 cm Petri kapları ve mağaza (tabakalandırmak) onları ° C filtre kağıtları batırılmış su Arabidopsis thaliana tohumu serpin.
2. Simüle güneş koşulları bu petri aktarın: 1.86 FR oranı: 80-100 μE fotosentetik aktif radyasyon (PAR) ve uzak-kırmızı takviyesi R getirmek. Uzun bir günün koşullarında (16 saat aydınlık / 8 saat karanlık) ve 22 sabit sıcaklık ° C kullanın Tohumların çimlenmeye izin vermek üzere üç gün için bu durum içinde inkübe edin.
3. Toprağa çimlenmiş tohum aktarın ve güneş koşullarında bitkiler tutmak. Büyük ölçekli deneyler için, etiket yapmak için Microsoft Word 2004 (veya üstü) olarak birleştirme Yöneticisi Veri kullanarak her bitki etiketleme için küçük etiketler hazırlamak öneririz.
4. Onbir gün sonra trToprağa ansfer, gölge durumuna bitkilerin yarısı hareket: güneş gibi ama 0.52 ile R / FR oranı getirmek için ek uzak kırmızı ışık ile aynı.
5. Ek bir on iki gün sonra, bitkilerin yaprak görüntüleme için hazırdır. Eğer bir gelişme anlık yakalamak böylece genç yapraklar hala genişleyen ise bu aşamada büyük yaprakları tamamen olgunlaşmıştır. İhtiyaçlarınıza bağlı olarak, farklı bir gelişme süresini seçmek isteyebilirsiniz.

2. Dissected Yaprak Görüntü Yakalama

1. Beş dikdörtgen çerçeveli bitki genotipi ve büyüme durumu ile etiketlenmiş şeffaflık yaprak hazırlayın. Bir frame bir bitki yaprakları karşılık gelir. Microsoft Excel etiket ile tutarlı bir ızgara baskı için de kullanılabilir.
2. Yirmi altı gün eski bitkilerin yaprakları teşrih.
3. Tarama düz yataklı tarayıcıya 600 dpi bırakır. Bir bitkinin yaprakları Not şeffaf tabaka arasında bir sandviç siyah bir pencere içinde dikey olarak yerleştirilmelidir. Dokunmaktan yaprakları kaçınınAşağıdaki yordamlar hataları verecektir siyah bir pencere çerçevesi ve örtüşen yaprakları için.

3. LeafJ tarafından Yaprak Görüntü Analizi

1. İndir ImageJ ImageJ ve plugins klasörüne LeafJ.jar dosya sürükleyin.
2. ImageJ 1.45s veya sonraki ¹⁴ bir resim dosyası açın.
3. "> Split Kanallar Görüntü> Renk" üç renk kanalları (kırmızı, yeşil ve mavi) içine görüntü Split ve mavi kanalda görüntüye eşik uygulayın.
4. Bir dikdörtgen aracı (Şekil 1A) tek bitki yapraklarının tümünü seçin.
5. Eklenti menüsünden "LeafJ" seçeneğini seçin.
6. Görüntülenen iletişim kutusunda bu bitki için açıklama bilgisini seçin. You can"Bu düzenleme seçenekleri" buraya tıklayarak görüntülenen varsayılan değerleri düzenlemek.
7. LeafJ eklenti çalıştırdıktan sonra ve "OK" butonuna tıklamadan önce, faiz (ROI) yöneticisi penceresi (; Şekil 1B gerekirse) bölgesinden takip hatları düzenleyin. Bir dokunmatik ekranlı tablet (örneğin bir iPad gibi) bu işlem için yararlıdır. iPad'ler Air Display yazılımı kullanarak harici bir monitör olarak bir bilgisayara bağlanabilir.
8. Ölçüm sonuçları ve Microsoft Excel veya eşdeğer yazılım ilişkili bilgileri (dosya adları, çiçekli zamanı ile disseke, ölçülen, vb) aktarın.

4. ImageJ Yaprak Hücre Görüntü Analizi

1. Disseke Fix olarak (adım 2) taramadan sonra referans ^15'te açıklandığı bırakır. FAA sabit yaprakları en az 6 ay süreyle 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
2. Mikroskobik gözlem ¹⁵ önce 1 ~ 2 saat süreyle kloral hidrat çözeltisi ve inkübe yaprakları FAA fiksatif değiştirerek yaprakları temizleyin.
3. Dağı mil üzerinde bırakırmikroskop tüyler yukarı bakacak şekilde kayar. Tüyler veya damar yakın hücre kaçınarak, ana damar her iki tarafında her bir yaprak merkezinin bir bileşik mikroskop, görüntü mezofil tabaka üzerinde 40x büyütme kullanılması.
4. Trace yaprak hücresindeki dokunmatik ekranlı tablet ve bir kalemle (olarak 3. adımda açıklandığı gibi) yardımı ile ImageJ ROI yöneticisi aracı tarafından özetliyor. Hücre görüntü analizi ImageJ ve yerleşik özellikler kullanır ama LeafJ gerektirmez.

Sonuçlar

1. Yaprak sapı ve Yaprak Blade Sınır tahminleri gösteriliyor Yaprak Görüntü ve Bunları Ölçme Pencere

LeafJ en kullanışlı özelliklerinden biri yaprak ayası / sapı sınır (Şekil 1) otomatik algılama olduğunu. Aşağıdaki gibi LeafJ algoritması çalışır: yerleşik ImageJ ParticleAnalyzer özelliğe kullanıcının seçim içinde yaprakların yönlendirme bulmak ve belirlemek için kullanılır. Her yaprak için yaprak genişliği yaprağın tüm eksen boyu...

Tartışmalar

Bizim "LeafJ" eklentisi manuel ölçüm fazla verim yaklaşık 6 kat artarak, yarı-otomatik sapı uzunluğu ölçüm sağlar. Yaprak sapı uzunluğu SAS önemli bir göstergesi ve aynı zamanda batıklık direnci ve hyponastic büyüme ¹⁷ gibi diğer olayların, bir dönüm noktası olduğunu. Bu nedenle, bu eklenti bitki araştırmacılar geniş bir yararlı olabilir.

Bizim eklentisi köklü bir java tabanlı ücretsiz yazılım, ImageJ uygulanmaktadır. Bu kolay çapr...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası
far-kırmızı LED ışığı	Orbitec	ısmarlama
şeffaflık	İKON	HSCA / 5
tarayıcı	Epson	Epson Perfection V700 PHOTO
Görüntü J	NIH		http://rsbweb.nih.gov/ij/
LeafJ	görenek		http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab
Hava Ekran	Avatron Software Inc		blank "> http://avatron.com/
iPad2	Apple Inc		http://www.apple.com/