Biyokütle Limit Tutarlar kullanarak Verimli Kromatin Immunoprecipitation

Özet

Biz primer T hücreleri kullanarak kromatin immunoprecipitation için bir sağlam bir yöntem tarif. Metodu standart yaklaşımlar üzerine kurulmuştur, ama hücrelerin sınırlı bir miktarda için verimliliği artırmak koşulları ve reaktifler belirli bir kümesi kullanır edilir. Önemli olarak, veriler analiz aşaması bölgesinin, bir ayrıntılı bir açıklama sunulmaktadır edilir.

Özet

Kromatin immunoprecipitation (ChIP) canlı hücrelerinin kromatin DNA ile farklı proteinlerin etkileşimleri belirlemek için bir yaygın olarak-kullanılan bir yöntemdir. Örnekleri arasında belli bir sekansa özel DNA bağlanma transkripsiyon faktörleri, histon ve onların farklı bir değişiklik Birleşik Devletleri, bu tür, RNA polimeraz ve ancillary faktörler olarak enzimler, ve DNA onarım bileşenleri yer alıyor. Onun aynı anda her yerde rağmen, malzeme her iki tezgah hazırlanması için ve etkileşim kantitatif ölçümlerini izin veren doğru analiz için kadar-to-date, ayrıntılı metodolojileri bir eksikliği vardır. Bu bilgi eksikliği nedeniyle, ve aynı zamanda herhangi bir immünopresipitasyon gibi, koşullar deneysel koşullar yeni setleri için yeniden-optimize edilmiş olmalıdır, çünkü, ChIP tahlil yanlış veya kötü kantitatif sonuçlar karşı hassastır.

Bizim protokolü sonuçta transkripsiyon faktörü üzerinde ufuklar açan işten türetilmiştir: DNA etkileşimleri ^1,2, ama sensitizasyon için bir dizi iyileştirme içerirzor-to-elde hücre tipleri için vite ve tekrarlanabilirlik. Protokol başarılı bir şekilde kullanılır olmuştur ^3,4, DNA zenginleştirme ölçmek için qPCR kullanarak, ya da altında protokolün bir yarı-nicel varyant kullanarak her iki.

PCR-amplifiye malzeme bölgesinin Bu, kantitatif analiz hesaplama açısından ısırttı, ve tahlil otelinin, bir kısıtlayıcı bir faktör temsil eder edilir. Önemli kontroller ve diğer hususlar uygulaması sonucunda oluşan değişiklikleri göster: Aile bulundunuz değil, böyle bir çalışmada altındaki bir protein (ya da beklenen edenler tarafından bağlı olmayı bulundunuz olmayacağı tahmininde bulundu, bir intergenik bir bölge olarak bir izotip-eşlemeli antikor bölgesinin kullanımı, hem de olarak kullanmak genomik DNA'nın bölgesinin, bir kontrol bölgesi bölgesinin değerlendirmesi, tüm , deneysel şartları yaratarak). Buna ek olarak, her bir ChIP örnek için giriş malzeme bölgesinin, bir standart bir eğri deneme girdileri ve materyaldeki açısından önemli ölçüde zenginleşme bölgesinin mutlak düzeyleri aç türetmek için kullanılır edilir. Standart eğrileri kullanımı ne olursa olsun onlar tasarlanmış nasıl dikkatli bir şekilde ki, primer setleri arasındaki hesabınıza farklılıkları içine almak, ve aynı zamanda verimlilik farklılık için yardımcı olurbir tek bir astar kümesi için şablon konsantrasyonlarının aralığı boyunca referanslarınıza. Bizim protokolü biz yoğun bir şekilde daha sonra, analiz aşamasında kapsayacak bu içinde ^5-8 mevcuttur diğerlerinden farklıdır.

Protokol

1. Fare Splenik Naïve CD4 İzolasyonu Hücreleri T

1. Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (IACUC) protokolleri ile tutarlı insani bir bir şekilde fareyi Kurban. Dalak parçalara ayır ve 10% FBS ile DMEM 10 ml içeren Petri kabındaki yerleştirin.
2. Splenositlerin serbest bırakmak için iki cam slaytlar buzlu uçları kullanarak dalak Crush. , Bir 15 ml konik tüp otelinin hücre süspansiyonu aktarın.
3. 4 az 5 dakika Ülke: boyunca 200 xg'de (, bir tipik bir rotor çapına sahip, bir klinik santrifüj cihazında için ~ 1.200 rpm ile) okuyun santrifüj edenler tarafından hücreleri toplayın ° ° C.
4. 2 mi ACK tamponu otelinin Pastör pipetiyle hücrelerin kırmızı kan hücreleri, oda sıcaklığında (RT) deki akışkanın 1 dakika Ülke: lyse bulundunuz. FBS ile DMEM bölgesinin 8 ml eklenerek edenler tarafından reaksiyon, durdurun.
5. 4 az 5 dakika Ülke: boyunca 200 x g'de okuyun santrifüj edenler tarafından hücreleri toplayın ° ° C.
6. DMEM içeren FBS 5 ml içinde hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin ve bir 70 mikron gözenekli filtre (BD Falcon, Cat # 352.350) geçmesine. Hücreleri sayın ve devam edinnaif CD4 bölgesinin izolasyonu bulundunuz kayıtlı üreticiler ait Kullanıcı yönergeleri kullanarak,, bir CD4 izolasyon kiti (Miltenyi, Kedi # 130-095-248) kullanılarak hücreler, T. 4 az 5 dakika Ülke: boyunca 200 x g'de okuyun santrifüj edenler tarafından naif bir CD4-T-hücrelerinde toplayın ° ° C. FBS ile DMEM bölgesinin 10 ml 'otelinin hücrelerin yeniden süspanse edin.

2. Kromatin bölgesinin Preparasyon

1. DMEM içinde hücre süspansiyonu, ile 1 ve% bölgesinin bir nihai konsantrasyonda bulundunuz% 37 formaldehit ekleyin ve hafifçe bulundunuz çapraz-linki DNA'nın 15 dakika Ülke: için oda sıcaklığında (ör:, bir Nutator kullanarak) okuyun kaya: Protein kompleksleri üzerinde bulunurlar.
2. 125 mM bölgesinin, bir nihai konsantrasyon ile 1 ve M glisin ekleyerek edenler tarafından çapraz bağlama durdurun. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca kaya için devam edin.
3. 4 az 5 dakika Ülke: boyunca 200 x g'de okuyun santrifüj edenler tarafından hücreleri toplayın ° ° C.
4. Buz-gibi soğuk PBS ihtiva eden proteaz inhibitörlerinin, 5 ml si içinde yeniden asılı edenler tarafından hücreleri yıkayın. 3 kez, toplam buz-gibi soğuk PBS ihtiva eden proteaz inhibitörlerini otelinin yıkayın ve 4 ° de santrifüjleme edenler tarafından hücreleri toplamak ° ° C.
5. , 1 ml otelinin hücrelerin yeniden süspanse edinproteaz inhibitörleri ile içeren buz gibi-soğuk bir hücre lizis tamponu. 15 dakika Ülke: boyunca buz ilgili sayısız inkübe edin. Hücre parçalama bölgesinin verimliliği,% 0.4 'ü tripan mavi bir çözelti otelinin hücrelerin bölgesinin, küçük bir alikotu yeniden süspansiyon haline getirilmesini (Sigma, Kedi # T8154) ve bir mikroskop ile birlikte gözlemleyerek edenler tarafından tespit edilebilir.
6. 4 az 5 dakika Ülke: boyunca 200 xg'de (tipik olarak ~ 1.200 rpm ile) okuyun santrifüj edenler tarafından çekirdeklerin toplayın ° ° C. Dikkatlice supernatant atın.
7. Proteaz inhibitörleri ile ihtiva eden, nükleer lizis tamponu ile bölgesinin 500 ul otelinin çekirdekleri yeniden süspanse edin. 15 dakika Ülke: boyunca buz ilgili sayısız inkübe edin.
8. Çıkış seviyesi 4, 15 sn patlama, buz üzerinde 4 kez: bir Misonix sonikatör 3.000, prob boyutu 1.6 mm kullanarak hücrelerin sonikasyon. Her bir numune, numuneler bölgesinin aşırı ısınmasını önlemek için tekrar bunu sonicating başlamadan önce 1-2 dakika Ülke: boyunca buz ilgili sayısız soğutuldu, olması gerekir. Aşırı ısınma çapraz bağlantıların ters neden olabilir.
9. 4 az 5 dakika Ülke: için 16.000 x g'de (bir mikrosantrifüj içinde ~ 13,200 Devri) okuyun sonike edilmiş kromatin santrifüjleyin ° C Her
10. Net bir supern bir 20 ul alikotu alınatant, DNA yükleme boya ekleyebilir ve bir 2% agaroz jel (çoğu uygulama için sonike DNA ideal boyuttadır 200-500 bp) yoluyla elektroforezi ile sonike DNA kontrol edin.
11. Bir UV spektrofotometre kullanılarak DNA konsantrasyonu belirleyin. Makaslanmış kromatin kromatin immunoprecipitation reaksiyon kurmak için derhal kullanılabilir veya -80 saklanabilir ° C Genelde biz fare başına düşen 2-3 X-10 ⁶ arıtılmış, CD4-T-hücrelerinde 7,5-10 mg DNA edinin.

3. Kromatin Immunoprecipitation (Tüm Adımlar 0-4 de Yaptırmış Olduğu olmalı ° C)

1. Protease inhibitörleri ile ChIP seyreltme tamponu otelinin ug / ml '5-10 bölgesinin bir DNA, konsantrasyonu (İndir Toplam hacim = 1 mi) çözündürüldü için sonicated kromatin sulandırınız.
2. Girdi olarak 100 ul (10%) kaydedin. Buz üzerinde saklayın.
3. Kısım 450 ul izotip kontrol (fare veya tavşan IgG) ve faiz antikor olarak etiketli iki 1.7 ml mikrofuge'de tüpler içine her biri. , Aynı izotip bölgesinin birden çok antikorları ikinci el vardır ise, bir kez izotip Control Bu analiz gerçekleştirmek için yeterli olacaktır. Bir farklı bir hayvan kaynağı ya da izotip bir antikorlar kullanılması durumunda Sen birden fazla izotip kontrolleri gerekir.
4. 2-5 ikinci el, antikorun seçiciliği ya da özgüllüğü ilgili sayısız bağlı olarak belirli bir antikor bölgesinin ug,,, veya ilgili elektrik tüpleri bulundunuz izotip denetimi ekleyin.
5. ° C kromatin-antikor komplekslerinin bölgesinin oluşumuna izin vermek için 4 okuyun bir gecede bir Nutator kullanarak tüpleri rock.
6. , Yukarıda bulunan karışım, bulundunuz, protein G manyetik boncuk (askıya alındı ​​boncuk bölgesinin 01:01 harç madde) bölgesinin 25 ul ekleyin ve 4 okuyun en az 2 saat boyunca rock müzikle sarsılmaya her izin ° C Ise bizim satıcı adlı işletmeye Boncuklar direkt olarak ikinci el edilebilir.
7. , Bir manyetik bir stand ile ilgili en mikrofüj tüpleri yerleştirin ve taneler; daha manyetize edilmiş tarafında ilgili sayısız toplamak için izin verir.
8. Dikkatli bir şekilde boncuklar bozmadan Aspirasyon ile çözüm kaldırmak.
9. , Düşük tuz yıkama çözeltisi bölgesinin 1 ml ekleyin ve hafifçe bir Nutator ilgili sayısız 5 dakika Ülke: için kaya gibi için izin verir. Bir manyetik standı kullanarak boncuk toplayın ve yıkama çözeltisi tortularını çıkarmak. Bir kez tekrarlayın.
10. , Yüksek tuz yıkama çözeltisi bölgesinin 1 ml ekleyin ve, bir Nutator ilgili sayısız 5 dakika Ülke: için kaya gibi için izin verir. Manyetik standı kullanarak boncuk toplayın ve yıkama çözeltisi tortularını çıkarmak. Bir kez tekrarlayın.
11. Lityum klorür yıkama çözeltisi bölgesinin 1 ml ekleyin ve, bir Nutator ilgili sayısız 5 dakika Ülke: için kaya gibi için izin verir. Manyetik standı kullanarak boncuk toplayın ve yıkama çözeltisi tortularını çıkarmak. Bir kez tekrarlayın. LiCl çözeltileri hazırlanarak bölgesinin kullanımı, boncuklar ile non-spesifik kromatin etkileşimleri bölgesinin etkin bir şekilde çıkarımını artıran.
12. TE solüsyonu bölgesinin 1 ml ekleyin ve, bir Nutator ilgili sayısız 5 dakika Ülke: için kaya gibi için izin verir. Manyetik standı kullanarak boncuk toplayın ve yıkama çözeltisi tortularını çıkarmak.
13. Elüsyon tampon bölgesinin 250 ul ekleyerek edenler tarafından boncuk adlı işletmeye DNA biçimde, ayrıştırmak. , Oda sıcaklığında az 15 dakika Ülke: için kaya gibi. Eluat kapalı Pipet ve bir yeni bir 1,7 ml mikrofuge'de tüp içinde bu malzeme kaydedin. Bir kez daha tekrarlayın ve elutions hem de birleştirmek. Boncuk atın.
14. Çapraz-bağlantıları nihai bir 0.3 M konsantrasyonu ve RNaz A 1 ul (20 m için 5 M NaCl eklemek tersine çevirmek için Yıkanarak ayrılan DNA ilk bulundunuz gr / ml) eklenmiştir. Hacmi 500 ul yapmak için adım 3.2, en son kaydedilen girişlere elüsyon tampon 400 ul ekleyin. Girişler etmek için 0.3 M olan,, RNaz A, 0,5 M EDTA, ardından 1 M Tris-HCl pH: 6.5 'bölgesinin 20 ul ve proteinaz K (20 mg / ml) bölgesinin 1 ul bölgesinin 10 ul bölgesinin 1 ul' lik NaCl ekleyin.
15. , Bir kuru bir ısıtma bloğu otelinin 65 'de bir gece elektrik tüpleri ° C inkübe edin. Örnekleri, mühür buharlaşma önlemek ya da açılış onları tutmak için tüpler üzerinde bir ağırlık yerleştirmek için. , Bir hibridizasyon fırın, aynı zamanda ikinci el edilebilir.
16. , Oda sıcaklığına kadar serin bir elektrik tüpleri izin ver. 1 ml 100% etanol ekleyin ve -80 2 hr-gece inkübe edin ° C çökelti DNA için.
17. Pelet için 15 dakika DNA için 16.000 xg'de tüpler santrifüjleyin. 70% etanol ve hava-kuru pelet ile bir kez DNA pelet yıkayın. Otoklavlanmış distile su 100 ul en DNA pelet tekrar süspansiyon haline getirin.
18. Elüsyon tampon bölgesinin to 50 ul bölgesinin toplam hacmi otelinin QIAquick spin sütunları ve elüsyona uğrayarak, kullanılarak analizi, DNA Purify. Bu, DNA PCR çalışılmış; kullanıma hazır ve hazır hale gelir.

PCR Reaksiyon (Tüm Adımlar on Ice Yaptırmış Olduğu olmalı) of "> 4. Hazırlık

1. ChIP ve karşılık gelen giriş örneklerinden tüm DNA örnekleri toplayın. Şunlara da, PCR reaktifler ve hedeflenen bir bölgedir için, primerler olarak sıra,, bir kontrol bölgesi toplamak tüm-. , Bir "HotStart" Taq DNA polimeraz kullanın. Biz bu yordamda DNA amplifikasyon ölçmek için bir SYBR Green-bazlı analiz kullanacaktır, ancak qPCR master kitleri gerekirse kullanılabilir.
2. QPCR analizinde otelinin, bir standart bir eğri oluşturmak için giriş DNA bölgesinin, bir seri bir şekilde seyreltilmesinden Yap Örneğin,: 10,% 1,,% 0.1,% ve elüsyon için, tampon otelinin işlemi Toplam 0.01% (adım 3.18 'de edilen QIAquick spin sütunları adlı işletmeye) Şunun için. Bu standart eğriden şablon resim grubu bölgesinin konsantrasyonu, sınıfı için ve artım ChIP zenginleşme kuralları bulunmadığında öne beklenen düzeyde ilgili sayısız göre farklılık gösterir yapabilirsiniz,, vb (Genemate, kedi # uzayı T '-3.182-1, bir 96-iyi plaka bölgesinin, ilgili deliklerdeki otelinin giriş DNA örnekleri, bölgesinin 10 ul dağıtın ), yinelenen yılında.
3. Ilgili yılında 10 ml ChIP izotip kumandadan gelen DNA yanı sıra spesifik antikor dağıtmakkuyu, üç kopya halinde.
4. Hedef astarlar veya kontrol astarlar (her astar 0.1 mcM son konsantrasyon) ya içeren bir "ana karışımı" olun ve ilgili kuyu içine 10 ul dağıtmak. Örneğin, aşağıdaki şablonda mix-içeren kuyu içine hedeflenen primerleri yeşil işaretlenmiş yüksek lisans dağıtmak ve kırmızı işaretlenmiş kuyu içine kontrolü primerleri ile ana karışımı dağıtmak.
5. Kuyunun dibinde her şeyi toplamak için oda sıcaklığında 1 dakika için bir klinik santrifüj (~ 1.200 rpm) içinde 500 xg'de optik plastik sızdırmazlık film ve santrifüj ile PCR plaka satın al için Kapak.
6. PCR reaksiyon başlatın. Biz bu örnekte qPCR çalıştırmak için LightCycler 480 II (Roche) işletim LightCycler 480SW 1.5 yazılımı kullanın olacaktır.

Ön kuluçka: 1 döngüsü: 95 ° C / 5 dk.

Amplifikasyon: 40-45 devir: 94 ° C / 5 saniye, 60 ° C / 5 saniye, 72 ° C/10 sn (sıcaklık erime sıcaklık daha az 2-3 ° C olmalıdır tavlamaprimerler e).

Erime eğrisi: 1 döngü.

Soğutma: 1 çevrim.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Bir

10% Giriş

10% Giriş

Izotipi

Belirli

B

1% Giriş

1% Giriş

Izotipi

Belirli

C

0.1% Giriş

0.1% Giriş

Izotipi

Belirli

D

0.01% Giriş

0.01% Giriş

E

10% Giriş

10% Giriş

Izotipi

Belirli

F

1% Giriş

1% Giriş

Izotipi

Belirli

G

0.1% Giriş

0.1% Giriş

Izotipi

Belirli

H

0.01% Giriş

0.01% Giriş

Yeşil: hedeflenen bölge astarlar kullanın.

Kırmızı: kontrol bölgesi astarlar kullanın.

5. Analiz

1. DNA mutlak miktarı ölçümü için Programı qPCR yazılımı. Önemli olarak, tanınmıyor belirli bir ve izotipine örneklerinde otelinin enterpolasyonu yapmak DNA'nın tutarlar bulundunuz, bir standart bir eğri 'kavramının kullanılması, değerlendirilmesi ve tüm astar bölgesinin kalite ve verimliliğini bölgesinin eşleşen örneklerinde otelinin bulunan konsantrasyonları ile ilgili sınıfı için den fazla ayarlar fiyatları karşılaştırın. Ayrıca, aynı zamanda, bir mor sağlarE usingΔΔCq ve ilgili yöntemlere göre son göreli kat zenginleştirme sonuçlarına Cq (C _t veya C _p) değerleri dönüştürmek için güvenilir bir yöntemdir.
2. Örnek editörü sayfasına git ve bunların standart bir eğri değerleri, ile birlikte, çeşitli seyreltileri bölgesinin girişi örnekleri (10,% 1,,% 0.1,% ve% 0.01) ayrı ayrı içeren kuyu işaretleyin. Ayrıca PCR plate dışarı yatırılır tam olarak, bilinmeyen ChIP örnekleri ile kuyu etiket. Diğer qPCR makinelerinde kullanılan eşdeğer yazılımında, her bir primer çifti, standart eğri değeri ve buna göre deneysel ve izotip kontrol örneği için reaksiyonları karşılık gelen alt kümeleri tayin.
3. LightCycler yazılımında, alt kümesi editörü gidin ve giriş örnekleri ile kuyu yanı sıra bilinmeyen ChIP örnekleri de dahil olmak üzere alt kümeleri işaretleyin. Tanınmıyor numuneleri analize için girdi örneklerin bölgesinin, konsantrasyonu bilinen serum adlı işletmeye oluşturulan, standart eğri kullanarak sayısallaştırılabilmektedir edilecek doyurmaya. Diğer qPCR makinelerinde kullanılan eşdeğer yazılım, adayı alt corresp olarakHer bir primer çiftleri için tüm reaksiyonlar onding.
4. PCR amplifikasyon tamamlandıktan sonra, "Abs Quant/2nd Türev Max" ile analizi gerçekleştirmek ve analiz ve Tamam tuşuna basın için alt kümesini seçin. Diğer qPCR makinelerinde kullanılan eşdeğer yazılımında, her alt kümedeki DNA miktarına Cq değeri dönüştürmek.
5. Giriş numunelerin bilinen konsantrasyonları kullanarak standart eğri üretecektir ve bilinmeyen örneklerinde DNA mevcut mutlak miktarını görüntülemek hangi "hesaplayın" tuşuna basın.
6. Makaslanmış DNA kalitesi iyi ise primerler hedeflenen bölgeye özel olarak bağlamak eğer, ve, PCR verimlilik yakın 2 için olmalıdır.
7. Varsa, aynı alt kümesi için "Tm arama" ile bir erime eğrisi analizi gerçekleştirin. Bir tek tepe noktasının, sadece bir tanesidir belirli bir ürün amplifiye edildi olduğunu gösterir. Spesifik DNA bölgesinin Amplifikasyon, aynı zamanda bir agaroz jeli içinden DNA ladder 'le ile birlikte, PCR ürünü electrophoresing edenler tarafından olarak test edilebilir.
8. Bir olarak veri ihracat sekmedaha fazla analiz için Microsoft Excel'de açılabilir ayrılmış metin dosyası,.
9. Microsoft, Excel programını kullanarak, hedefli bir astar boyalar için izotip kontrol ile ilgili belirli kullanıma uyarlanmış antikor için DNA miktarı bölün. Kontrol bölgesi primerleri için bu adımı yineleyin. , Aynı izotip bölgesinin birden çok antikorlarının farklı asyonlar için ikinci el yapıyorsanız,, aynı izotip kontrol adlı işletmeye bulunan değerlerle, bu bölgesinin her biri normalleştirmek. Birden çok hedefli primer çiftleri, ikinci el arıyorsunuz Ayrıca, eğer, bir tek bir kontrol bir primer çifti resim grubu adlı işletmeye, DNA miktarlar, her hedef için (Şekiller 1 ve 2) bölgesinin normale dönmesi için ikinci el edilmelidir. Çıkış değerleri, non-spesifik bir antikor arka plan immüno-çökeltme bulundunuz göreli her bir Yer okuyun spesifik bir antikor immüno-çökeltme kat zenginleştirme temsil eder.
10. Bir göre zenginleştirme elde etmek için kontrol bölgesi astar için kat zenginleştirme (kontrol izotipe) ile hedeflenen astar için kat zenginleştirme (kontrol izotipe) bölünİlişkisiz kontrol bölgesi (Şekil 1). Önemli olarak,, çünkü her bir örnek için İndir Toplam giriş DNA, ile birlikte standart eğrileri bölgesinin nesil bölgesinin, yukarıda bulunan immüno-çökeltme değerleri, bölgesinin her bir, standart eğrileri adlı işletmeye zaten bulundunuz normalize edilir enterpolasyonlu bir, ve benzeri gibi ifade edilen olduğunu lütfen unutmayın, makine yazılımı, edenler tarafından İndir Toplam giriş bölgesinin fraksiyonu ölçülür.
11. Immüno-çökeltme ya da yıkama için ikinci el arabellekleri bölgesinin sıkılığının ayarlanması çok yüksek olduğunu ise, bu izotip kontrol adlı işletmeye amplifikasyon numuneleri gözlenen uygulanmaz değil, doyurmaya immünopresipitasyon işleminden, sağlarken özel antikorlar, ile immünopresipitasyon işleminden örnekleri adlı işletmeye sağlam bir amplifikasyon, dikkat edilmesi doyurmaya ki mümkündür olduğunu. Böyle bir senaryoda yılında, bu, hedeflenen bölge ve ilişkisiz bir bölgeye her ikisi için de spesifik bir antikor ChIP adlı işletmeye İzotip; Eş tip kontrol çipi bölgesinin miktar n artt rp bulundunuz daha da güzelleşir olduğunu. Bağıl zenginleştirme ilişkisiz bölgesi (Şekil 3) için fark tarafından hedeflenen bölge için fark bölünmesi ile hesaplanabilir.

Sonuçlar

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü böylece bir "yükleme kontrol" olarak hizmet veren, genomun bir ilişkisiz bölge güçlendirir bir primer çifti kullanımı yoluyla PCR içinde kullanılan DNA miktarında, herhangi bir eğer, farklar için burada kontrolleri sundu. Şekil 3, otelinin ve gösterilen örnekte de, biz hedef bölge olarak seçilmesi fare il2 promoteri ilgili sayısız Faiz ve olan transkripsiyon faktör olan NFAT bağlayıcı bir Alanı bölgesinin Bizim ...

Tartışmalar

Protokol Yukarıdaki doğru bir şekilde ChIP kullanarak birincil Lenfositlerden elde DNA zenginleştirme miktarının bir sağlam bir yöntem sağlar. Bu protokolde sağlamlık için bir önemli nedeni biyolojik çoğaltır dahil edilmesi. , Yukarıda bulunan iletişim kuralı üç, bağımsız bir şekilde hesaplanır, hangi için en zenginleştirme çoğaltır kullanır. Çıkışlar daha sonra zenginleşme, ve değişkenliği bölgesinin sağlamak için bir önlem hesaplanan standart sapma daha bölgesinin bir ölç...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F-8775	Store at RT
Phosphate Buffered Saline	Hyclone	SH30256.01	Store at 4 °C
Protease Inhibitor tablets	Roche	04693116001	Store at 4 °C
Protein G magnetic beads	Active Motif	101945	Store at 4 °C
RNase A (20 mg/ml)	EMD Millipore	556746	Store at -20 °C
Proteinase K (20 mg/ml)	Roche	03115879001	Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0
Platinum Taq DNA Polymerase	Invitrogen	10966-034	Store at -20 °C
SYBR Green I	Invitrogen	S7567	Store at -20 °C
1 M Glycine			Store at RT
Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)			Store at 4 °C
Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS)			Store at RT
ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)			Store at 4 °C
Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl)			Store at 4 °C
High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl)			Store at 4 °C
LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0)			Store at 4 °C
TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)			Store at 4 °C
Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3)			Prepare fresh
5 M NaCl			Store at RT
0.5 M EDTA			Store at RT
1 M Tris-HCl, pH 6.5			Store at RT
Table of Specific Reagents
Clay Adams Brand Nutator	Becton Dickinson	Model: 421105
Magnetic Stand	Promega	Z5342
Qiaquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Masonix Sonicator 3000	QSonica	Model: S3000
UV Spectrophotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000
Heating Block	VWR	13259-030
Rotator	VWR	80085-692
Refrigerated bench top centrifuge	Beckman Coulter	Model: Allegra X-12R
Microcentrifuge	Eppendorf	5415 D
Table of Equipment