Fare Akciğer Protein Transfeksiyon

Patrick Geraghty; Robert Foronjy

doi:10.3791/50080

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

Özet
Özet
Protokol
Sonuçlar
Tartışmalar
Açıklamalar
Teşekkürler
Malzemeler
Referanslar
Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Transgenik farenin ya da viral vektörler, akciğer içinde protein ekspresyonu artırmak için kullanılmıştır. Ancak, bu teknikler teknik olarak zor, zaman alıcı ve sonuçları etkilemesi hedef dışı etkileri vardır. Bizim protein transfeksiyon protokolü bir lipid tabanlı transfeksiyon reaktif ve düzgün akciğer hücrelerine aktif bir protein sunmak için bir ultra ince Micro kullanır.

Özet

Protein ekspresyonu arttırmak araştırmacılar daha önemli biyolojik süreçlerin düzenlenmesinde ¹ o proteinin fonksiyonel rolünü anlamak için olanak sağlar. Akciğerde, bu artan gen ekspresyonu ⁴ ile proteini düzeylerini yükselten transgenik farenin ^2,3 veya viral veya non-viral vektörlerin kullanmaktadır genetik yaklaşımlar, genellikle aracılığıyla elde edilmiştir. Transgenik farenin oluşturmak için pahalı ve zaman alıcıdır ve bir transgen ya da kronik gen ifadesinin rastgele yerleştirilmesi, normal akciğer gelişimi değişmesine neden olur ve bu nedenle modelin ⁵ yardımcı sınırlayabilir. Koşullu ifade oluşturmak için kullanılır kronik gen ^6, ters tetrasiklin kontrollü transaktivatör (rtTA) fareler ile ilişkili sorunları ortadan koşullu transgenik, kendiliğinden hava sahası genişleme ⁷ geliştirmek iken. Transgenik olduğu gibi, viral ve non-viral vektörlerin kullanımı ⁸ pahalı ve doz-D provoke edebilirBu ependent inflamatuar yanıtları sonuçları ⁹ yıkmak ve ifade ¹⁰ engel. Ayrıca, tekrarlı dozların etkinlik vektör ^11,12 geliştirilmiş bağışıklık tepkileri ile sınırlıdır. Araştırmacılar daha az inflamasyon kışkırtmak ve akciğer ¹³ içinde uzun ifade var adeno-ilişkili viral (AAV) vektörleri geliştiriyoruz.

Β-galaktosidaz kullanarak, doğrudan bir proteini transfeksiyon tekniği kullanılarak, akciğer içinde hızla ve etkin biçimde artıran protein ekspresyonu için bir yöntem sunulmaktadır. Bu protokol, akciğer dokusu, kendisi içine penetrasyon sağlamak için, bir lipid-bazlı transfeksiyon reaktifi 20 ul (Pro-Ject, Bio Pierce) ile saflaştırılmış protein sabit tutar karışımları. Lipozomal proteini karışımı daha sonra, bir Micro (Penn Century, Philadelphia, PA) kullanılarak, trakea ile farelerin akciğerleri içine enjekte edilir. Micro akciğerler boyunca sıvı aerosol güzel bir tüy üretir. Tekniği kullanarakBu hava ve fareler ^14. alveoller boyunca enjekte proteinin homojen birikimi göstermiştir. Lipid transfeksiyon teknik etki elde etmek için protein küçük bir miktarının kullanımına olanak sağlamaktadır. Bu aksi takdirde yüksek protein idare tarafından provoke olacağını inflamatuvar yanıt sınırlar. Gerçekten de, bu tekniği kullanarak biz önemli ölçüde akciğer lavajı hücreli ¹⁵ etkilemeden akciğerde PP2A etkinliği artırmak mümkün olduğunu yayınladı. Cebine 24 saat sonra alınan hücreli akciğer lavaj kontroller ile karşılaştırılabilir olmuştur (27 ± 31 genel 4 kontrol ± 5 albümin transfekte edilmiş, her grupta N = 6). Ayrıca, transgenik bir model oluşabilir akciğer gelişimsel değişimlerin veya yapısal değişiklikler neden olmadan proteini düzeylerini artırır. Ancak, tekrar yönetimlerin ihtiyacını protein ifadesinde uzun vadeli artar etkilerini inceleyen çalışmalar için bu tekniği daha az elverişli hale getirebilir. Bu durum, özellikle tru olacaktırkısa yarı ömürlü proteinler için e.

Protokol

1. Protein Transfeksiyon Reaktif hazırlanması

Kuru film içeren tüp metanol ya da kloroform içinde 250 ul ekleyerek Pro-Ject Reaktif çözülür.
En yüksek hızda 10-20 saniye girdap.
Ayrı bir mikrosantrifüj tüpü içine Pro-Ject reaktif Pipet 20 ul.
Oda sıcaklığında 6 saat arasında, en az bir laminar akış başlığı altında Pro-Ject Reaktif içeren mikrosantrifüj tüpleri yerleştirerek çözücü buharlaşır. Bu tamamen kuru olmalıdır. Alternatif olarak, vakum kurutma cihazı kullanılarak Pro-Ject reaktif kurutun.
-20 ° C'de saklayın tüpleri Bunlar, bu sıcaklıkta bir yıl için iyidir.

2. Pro-Ject Reaktif Protein ekleme

Kurutuldu Pro-Ject transfeksiyon reaktifi 20 ul içeren bir tüp içine, ilgilenilen proteinin 2.0 mg ihtiva eden PBS Pipet 50 ul.
Protein ilave edildikten sonra, düşük hızda F vorteks çözüm karıştırmakya da 3-5 saniye oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kuluçkaya izledi.

3. Protein içine tatbik

Ketamin / ksilazin intraperitoneal (100 mg / kg ve 10 mg / kg) ile farenin anestezisi.
Sedasyon elde edildikten sonra, fareler, özel olarak tasarlanmış bir platform (Şekil 1) kullanılarak üst kesici dişler asılmıştır.
Forseps ve bir laringoskop gibi bir ataş kullanarak, orofarenks kateter (Şekil 2) tanıtılacak böylece açılır. Ses telleri fare trakea karşı bir ışık kaynağı koyarak görüntülenmiştir.
Protein / ProJect reaktif karışımı (50 ul) bir Penn Yüzyıl Micro kullanarak trakea yoluyla enjekte edilir.