Kayma Tahliller kullanma Biyopolimerler eğilme Katılığı Ölçümleri

Özet

Sebat uzunluğu veya biyopolimerlerin eğilme rijitliği ölçmek için bir yöntem tarif edilmiştir. Yöntem deneysel olarak bireysel mikrotübül kalıcılığı uzunluğunu belirlemek için bir kinesin tahrik mikrotübül kayma deneyi kullanmaktadır ve aktin bazlı kayma deneyleri için uyarlanabilir.

Özet

Mikrotübüller sitoskeletal hücre bölünmesinde rol polimerler, hücre mekaniği, ve hücre içi taşıma vardır. Bu fonksiyonların her biri sert ve hücre çapı önemli bir kısmını kapsayan düz yeterli mikrotübüller gerektirir. Sonuç olarak, mikrotübül kalıcılık uzunluğu, sertlik ölçüsü, aktif son yirmi yılda ¹ için incelenmiştir. Kısa mikrotübüller uzun mikrotübüller ^2-4 den 10-50 kat daha sert, ve hatta uzun mikrotübüller büyüklükte ^5-9 sipariş göre farklılık sebat uzunlukları ölçüldü: Bununla birlikte, açık sorular kalır.

Burada, mikrotübül sebat uzunluğunu ölçmek için bir yöntem mevcut. Yöntem bir kinesin tahrik mikrotübül kayma deneyi ¹⁰ dayanır. Mikrotübül bağlı bireysel floroforlar tek parçacık izleme, glidin bireysel mikrotübül seyrek floresan etiketleme birleştirerekTek mikrotübüller g yörüngeleri nanometre seviyesinde hassasiyet ile izlenir. Yörüngesel süreklilik uzunluğu ¹¹ kullanılan şartlar altında mikrotübülün kalıcılığı uzunluğu ile aynıdır. Bir otomatik izleme rutin bireysel mikrotübüller bağlı floroforlar gelen mikrotübül yörüngeleri oluşturmak için kullanılır ve bu yörünge sebat uzunluğu IDL yazılmış rutinleri kullanılarak hesaplanır.

Bu teknik hızla uygulanabilir, ve deney bir gün içinde 100 mikrotübül sebat uzunluğu ölçme yeteneğine sahiptir. Yöntem mikrotübüller boyunca uzunluğunun bir fonksiyonu olarak süreklilik uzunluk dahil çeşitli koşullar altında kalıcılık uzunluğunu ölçmek için genişletilebilir. Ayrıca, kullanılan analiz rutinleri yanı aktin filamentler sebat uzunluğunu ölçmek için, miyozin tabanlı etkili kayma deneyleri için uzatılabilir.

Giriş

Hücre iskeleti, çoğu ökaryotik hücrelerde bulunan biyopolimerlerin bir ağ, hücresel organizasyon, hücre içi ulaşım, ve hücre mekaniği bir rol oynar. Hücre iskeleti (öncelikle aktin ve mikrotübüller) ve biyopolimerlerin mekanik özellikleri de, bir bütün olarak ¹² hücre mekanik özelliklerini belirlemede önemli bir rol oynamaktadır. Tüm hücre mekaniği, sağlıklı ve hastalıklı hücrelerin ^13,14 karakterize edebilir ve hücresel motilite ¹⁵ dahil olduğundan, altta yatan sitoskeletal bileşenlerin mekanik özellikleri son yirmi yılda ¹ için çalışma aktif alan olmuştur.

Biyopolimerlerin esneklik (veya sertliği) kalıcılığı uzunluğu, ortam sıcaklığında, ısı dalgalanmaları altında yaklaşık bir radyan tarafından eğilir polimer uzunluğu ile karakterize edilir. Bir dizi teknik examp için sebat uzunluğu ^16, ölçmek için geliştirilmiştirhidrodinamik akış, optik tuzakları, ya da elektrik alanları ^4,17,18, ve çözüm ^5,6 ücretsiz polimerlerin dalgalanmaları ölçmek pasif teknikleri kullanarak polimer bükme içeren le aktif teknikleri. Aktif ölçümler, ancak özel kurulumları mikrometre ölçekte bilinen kuvvetler uygulamak gerektirir ve serbest dalgalanma ölçümleri kullanılan mikroskop odak düzlemi difüzyon dışarı nedeniyle zor olabilir.

Bu yazıda, mikrotübül sebat uzunluğu, sitoskeletal polimer ölçmek için tamamlayıcı, pasif, tekniği açıklar. Tekniği polimer daima ¹⁹ odak düzlemi kalmasını sağlamak kayma testleri, içerir. Ayrıca, polimer boyunca belirli yerlerde de karakterize edilir, böylece ilgi polimer ile kalıcı olarak bağlanmış tek bir izleme floroforlar, içerir.

Yöntemin özel bir çizgi Figür gösterilire 1. Kinesin mikrotübül + sonuna doğru özellikle hareket, yani bir kayma tayininde mikrotübül tek yönlü tahrikli. Mikrotübül yapının önde gelen ucunu, ekli son kinesin ötesinde, çevreleyen bir çözelti termal kuvvetler altında dalgalanma serbesttir. Mikrotübül ileri itilir gibi, uç cam slayt üzerinde daha ileri bir yeni kinesin molekül bağlama kadar belirli bir dalgalanma, donar dalgalanır. Kinesin çok güçlü mikrotübüller ekler Çünkü, mikrotübül lider sonu yolunu takip sınırlıdır. Bu nedenle, mikrotübül yörünge donmuş istatistiksel dalgalanmalar mikrotübüllerin ¹¹ serbest uç bölgesinin istatistiksel dalgalanmalar aynıdır, ve bu yüzden ²⁰ göre süreklilik uzunluk hesaplamak için de kullanılabilir

l _p mikrotübülün sebat uzunluğu nerede, θ _s kontur uzunluğu s ayrılmış yörünge için teğet arasındaki açı olup, <> temsil eder bir kontur uzunluğu s ile ayrılmış pozisyonları tüm çiftleri üzerinde bir ortalama.

Kayma testi kendisi özel bir streptavidin biotin bağlantı yoluyla cam slayt bağlı coiled coil ^21'de kinesin biotinlenmiş kullanır. Bu eki motora etki bağlamak ve mikrotübüller itmek için ücretsiz sağlar. Mikrotübül yörüngeleri takip etmek için, mikrotübüller seyrek organik floroforlar ^22,23 ile etiketlenir - etiketler tek floroforlar tek bir molekül floresan mikroskobu kullanılarak çözülebilir olması yeterli seyrek olmalıdır. Tek floroforlar IDL yazılmış görüntü analiz rutinleri kullanılarak izlenir. Her fluorofor yörüngeleri belirli bir mikrofon bağlırotubule otomatik ²⁴ bileşik mikrotübül yörünge birleştirilir. Bir yörünge boyunca her noktasına θ teğet açıları hesaplanır; bu teğet açılardan s> değeri, her kontur uzunluğu ler için hesaplanır. Son olarak, bu veriler Denk sığdırılır. 1. Belirli bir mikrotübül için bir kalıcılık uzunluk elde etmek için, ya da aynı kayma tahlil içinde çok mikrotübüller için.

Yöntem koşullarının geniş bir çeşitliliği (bağlı mikrotübül ilişkili protein (MAP), ya da viskoz bir dizi çözüm ile, mikrotübül bağlı farklı stabilizasyon ajanları ya da diğer küçük moleküllerin) 'de hazırlanan mikrotübüller birlikte çalışmak için yeterince sağlamdır. Bizim laboratuvarda, teknik farklı dengeleyici maddeler ile mikrotübüllerin ve mikrotübüller boyunca uzunluğunun bir fonksiyonu olarak mikrotübül kalıcılığı uzunluk karakterize etmek için kullanılmaktadır. Ana sınırlamadır mikrotübül hala zorunluluk olduğunuupport kinesin motilitesi. Kinesin bir sağlam motor enzim olduğundan, bu oldukça gevşek bir sınırlamadır. Bir miyozin aile enzimi ile aktin ve kinesin ile mikrotübüller değiştirerek, aktin sebat uzunluğu aynı tekniği kullanılarak ölçülebilir.

Protokol

1. Mikrotubul Kayma Testi Stok Çözümleri

Öncesinde kayma testin hazırlayın.

1. Seyrek parlak organik fluorofor ²² ile etiketlenmiş 0.5 mg mikrotübüller Polimerize. Hedef etiketi konsantrasyonu 1 mikrotübülün mikrometre başına fluorofor veya 1.500 tübülin dimerleri başına yaklaşık 1 fluorofor bir etiketleme yoğunluğudur. Oda sıcaklığında, ışık saklayın kadar iki hafta için alüminyum folyo ile korunmaktadır.
2. Yaklaşık 1 mcM az biotin kinesin ²¹ arındırın. -80 ° C'de saklayın ayrı deneylerde kullanılmak için 5 ul alikotları.
3. 50 mM imidiazole ve deney tamponu (AB), 50 mM potasyum klorid (KCl), 4 mM magnezyum klorür _(MgCI2), 2 mM etilen glikol tetraasetik asit (EGTA), pH 6.7 hazırlayın. 4 at Steril filtre ve mağaza ° C
4. 2 mg / AB içinde ml biotinlenmiş sığır serum albumini (biotin-BSA) çözülür. 0.2 mikron şırınga filtresi ile filtre.-80 Store 4 de uzun süreler için 100 ul alikotları ° C, ° C kadar bir ay için.
5. 10 mg / AB ml için streptavidin (SA) çözülür. 0.2 mikron şırınga filtresi ile filtre. -80 Mağazası kadar iki hafta için 4 ° de uzun süreler için 20 ul alikotları C, ° C.
6. 5 AB mg / ml 'ye α-kazein eritilir. 0.2 mikron şırınga filtresi ile filtre. -80 Store 4 de uzun süreler için 100 ul alikotları ° C, ° C iki hafta için.
7. 200 mM deiyonize su ditiyotretol (DTT) çözülür. 100 ul alikotları -20 ° C'de saklayın, çözdürme 8 saat içerisinde tüketilmelidir. Tekrar dondurulmamalıdır olabilir.
8. 4 mM HPLC-grade dimetil sülfoksit (DMSO) içinde paklitaksel (PT) eritilir. -80 10 ul alikotları Mağaza ° C Uzun süreli, -20 ° C kısa süreli. Çözdürme 8 saat içinde kullanın. Tekrar dondurulmamalıdır olabilir.
9. 120 mg / ml 'de deiyonize su içinde çözülür glikoz. -20 ° C'de 100 ul alikotları Mağazası Tekrar dondurulmamalıdır olabilir.
10. Dis150 mM, pH 7.0 deiyonize su adenozin trifosfat (ATP) çözmek. -80 5 ul alikotları Mağaza ° C, çözdürme 8 saat içerisinde tüketilmelidir.
11. 600 ul toplam analiz tampon katalaz 10.000 adet glukoz oksidaz ve 156,000 adet eriterek 100x oksijen süpürücü stokta ²⁵ hazırlayın. Pelet katı bir mikrosantrifüj kısaca santrifüjleyin; 0,2 mikron şırınga filtresi ile filtre süpernatant. -80 Deposu 4 de uzun bir süre için 10 ul hacimde ° C, ° C ila bir hafta için.

2. Mikrotubul Kayma Testi, Aynı Gün Çözelti Hazırlama

Deney gününde 2,1-2,6 içinde çözüm hazırlayın. Birlikte uygulama, çözeltiler 2,2-2,6 akış hücresi yıkama sırasında hazırlanabilir. Aksi belirtilmediği sürece, buz üzerinde stok solüsyonları tutmak.

1. DTT stok 10 ul (2 mM DTT ile AB) ile AB, tahlil tampon 1 ml hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayınız.
2. Biyo-BSA tampon, 40 & Mu hazırlayın, Biyotin-BSA stok ve AB bir 1:1 karışımından l. Oda sıcaklığında saklayınız.
3. 5.5 ul BSA (AB içinde 1 mg / ml BSA) ile AB 645 ul karıştırma BSA tamponu hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayınız.
4. 3 ul streptavidin stoku (AB içinde 0.5 mg / ml streptavidin) ile AB arasında 57 ul karıştırma, SA tamponu hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayınız.
5. BSA tamponu, 50 ul stok kazein, 15 uM ATP (1 mg / ml α-kazein, 0.8 mg / ml BSA, AB içinde 50 nM ATP) 0.8 ul 200 ul, karıştırma, α-kazein tampon hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayınız.
6. 95 ul α-kazein tampon, 2.5 ul glukoz stok, 1 ul 100x oksijen süpürücü karışımı, 1 ul paklitaksel stok, 1 ul 2-merkaptoetanol (βME) karıştırılması, floresan anti-bleach tamponu hazırlayın. Davlumbaz altında βME ekleyin. Hazırlık 1 saat içinde floresan anti-bleach tampon kullanın DİKKAT:. ΒME son derece zehirlidir ve kötü kokuyor. Sadece davlumbaz altında açmak için emin olun. Mağaza şişeışığın olmaması; ışık βME ve photobleaching azaltmak kabiliyetini düşürür.

3. Mikrotubul Gliding Assay

1. Bir boşluk gibi bir pipet ile bir şırınga sıkılan vakum yağ kullanarak 24 x 60 mm lamel ve 22 x 22 mm lamel arasında dört akışı şerit, yaklaşık Construct. Her akış şeritte hacmi yaklaşık 10 ul (ölçek izleyen birimler buna göre) olmalıdır.
2. Her şeride biyo-BSA tampon 10 ul yıkayın. BSA kat cam yüzeyleri sağlamak için 5 dakika inkübe edin.
3. Kızak yüzeyi bloke etmeye devam ederken, biyotin-BSA ücretsiz kaldırmak için 15 ul BSA tamponu ile her kulvarın üç kez yıkayın. Hava kabarcıkları akışı odasına gitmek için izin vermemek için emin olmak, akış odasının ters tarafına tampon kaldırmak için bir Kimwipe veya filtre kağıdı kullanın.
4. Her şeride 15 ul SA-tampon yıkayın. 10 dakika, ya da en fazla 2 saat bekleyin. Streptavidin yüzey-bağlı biyotin-BSA bağlanır.
5. Kızak yüzeyi bloke etmeye devam ederken serbest SA kaldırmak için 15 ul BSA tamponu ile her kulvarın üç kez yıkayın.
6. 15 ul α-kazein tamponu ile her kulvarın yıkayın. α-kazein daha cama spesifik olmayan kinesin bağlayıcı ve mikrotübüller engellenmesine yardımcı olur.
7. Α-kazein tamponunda 10 nM kinesin seyreltin ve bu kinesin 15 ul her kulvarın yıkayın - α-kazein çözüm. Yüzeye bağlı streptavidin özellikle bağlamak biotinlenmiş kinesin için 15 dakika (veya bir saat kadar) bekleyin. Kinesin motor alanlarla bind mikrotübüle serbest kalacak.
8. Oda sıcaklığında 40 uM α-kazein arabelleğe paklitaksel seyreltin ve ücretsiz kinesin yıkayın ve depolimerizasyon gelen mikrotübüller önlemek için paklitaksel çözümü ile her bir akış odasının ön-yüklemek için bu çözüm 15 ul her kulvarın yıkayın. Soğuk ayrıca mikrotübüller depolymerizes, böylece oda sıcaklıkları ile oda sıcaklığında bu adımları ortaya emin olunçözümleri yeniden.
9. Floresan 1 mM ATP ile floresan anti-bleach tampon mikrotübüllerinde 1:100-1:1,000 etiketli seyreltin. Tek şeride 15 ul yıkayın ve 30 dakika içinde gözlemlemek.

4. Veri Toplama

1. Floresan mikroskobu kullanarak mikrotübül kayma gözlemleyin; böyle bir ticari veya ev-yapı TIRF ayar olarak tek floroforlar çözebileceklerdirler mikroskop ²⁶ (Şekil 2) gereklidir.
   Mikrotübüller sıcaklığına bağlı olarak, yaklaşık 0.5 um / s de alt tabaka üzerinde kinesin motoru tarafından tahrik edilebilir olmalıdır. Mikroskop alanında-of-view 50 mikron ise, bireysel mikrotübüller yaklaşık 100 saniye boyunca görünür olmalıdır. Tek floroforlar daha hızlı 100 sn'den photobleach kalmamak aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın. Lazer uyarma kullanıyorsanız, yaklaşık 3-5 mW güç ayarı uygundur.
2. Analiz için görüntü dizilerini toplayın. 600 görüntüleri5 Hz (2 dk toplam) iyi çalışıyor. Yeterince uzun mikrotübüller tüm alan-of-view geçiş olduğunu dizilerini kullanın.

5. Veri Analizi

Bir IDL rutin get_lp.pro ektedir. Bu rutin belirli bir görüntü dizisi tüm mikrotübüller kayma dayalı bir sebat uzunluğu değeri döndürür. Ya sizin özel mikroskop kurulum bağlı olarak yoğunluğu parametrelerini değiştirerek, her bir görüntü dizisi bu rutin çalıştırmak veya aşağıdakileri yapın:

1. Fluorofor yörüngeleri oluşturmak için bir mikrotübül bağlı her fluorofor izleyin.
2. Görüntü dizisi içinde her bir mikrotübül (Şekil 3) için tekrar; genel bir mikrotübül yörünge içine belirli bir mikrotübül üzerinde florofor tüm yörüngeleri birleştirin.
3. Yörünge boyunca her noktasına teğet açısı (Şekil 4) hesaplayınVe hesaplama θ _s> Denk. (Şekil 5) bir yol uzunluğu s noktalar ile ayrılan her çifti için açı farkı kosinüs ortalaması alınarak 1. Θ _s> Eşitlik uydurma θ _s, bağımsız değerlerin sayısı ile uyum içinde ayrı veri noktaları.

Sonuçlar

Bir kayma testte bir anlık Şekil 2 'de gösterilmiştir. İyi bir mikrotübül yoğunluk görüş alanı başına 1-10 mikrotübüller olduğunu; mikrotübüller birbirlerine çapraz olarak önemli ölçüde daha mistracking neden olacaktır. Şekil 2 'de kayma testte 11 mikrotübül yörüngesel bir grafiği Şekil 3' de gösterilmiştir. Tipik yörüngeleri 10 ila 30 mikron uzunluğunda; tek mikrotübül başka kestiği yerlerde bazı yörüngeleri boşl...

Tartışmalar

Sebat uzunluk ölçümleri bireysel biyopolimerlerin mekanik özelliklerinin iyi bir karakterizasyon vardır. Bu yazıda, mikrotübül sebat uzunluk ölçüm yöntemi tanımlamışlardır. Girişte belirtildiği gibi, bu yöntem, sadece kolayca kayma deneyi, 3.9, en son adım olarak, reaktiflerin, sıcaklık veya viskozite değiştirmek sureti ile polimerize etmek veya mikrotübüller, adım 1.1, tarafından çeşitli koşullar mikrotübül mekanik özelliklerinin incelenmesi için genişletilmiştir farklı koşullar a...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imidazol	Sigma-Aldrich	I2399
Potasyum klorür	Sigma-Aldrich	P9541
Magnezyum klorid	Sigma-Aldrich	M8266
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
BSA	Calbiochem	126.615
Biotinlenmiş BSA	Thermo Scientific	29130
Α-kazein	Sigma-Aldrich	C6780
Streptavidin	Thermo Scientific	21125
Ditiyotretol	Sigma-Aldrich	D0632
Paklitaksel	LC Laboratuvarları	P-9600
Glukoz oksidaz	Sigma-Aldrich	G2133
Katalaz	Sigma-Aldrich	C100
Glukoz	Sigma-Aldrich	G8270
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
2-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148	Zehirlidir. Az miktarda satın alın.
24X60 mm No 1 1/2 cam kapak	VWR	48393-252
22x22 mm No 1 cam kapak	Altın Mühür	3306
Yüksek Vakum Gresi	Dow-Corning	NA
TIRF mikroskop	Birçok	NA	Bu yöntemde kullanılan TIRF mikroskop ev yapımı.
IDL (yazılım)	Exelis	NA	MATLAB, ImageJ veya diğer görüntü analiz yazılımı yerine olabilir.