Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

Özet

Nöronlarda deneyim-bağımlı moleküler değişiklikler davranışsal sorunlara yanıt olarak adapte beyin yeteneği için gereklidir. An In vivo Iki foton görüntüleme yöntemi genetik olarak kodlanmış gazetecilere yoluyla bireysel kortikal nöronların bu tür moleküler değişiklikleri izleme sağlayan burada tanımlanmıştır.

Özet

Deneyimi yanıt olarak değiştirmek için beyin yeteneği sağlıklı beyin fonksiyonu için önemlidir ve bu süreçte anormallikler beyin bozuklukları ^1,2 çeşitli katkıda. Iyi beyin devrelerinin bir hayvanın deneyimi tepki hangi mekanizmalar anlamak için canlı hayvan, zaman uzun bir süre boyunca, nöronların belirli bir set deneyimi bağımlı moleküler değişiklikleri izlemek için yeteneği gerektirir. Deneyim ve ilişkili nöral aktivitenin nöronlar ^1,2 gen ekspresyon değişiklikleri tetiklemek için bilinen ^iken, yöntemlerin çoğu bu değişiklikleri algılamak için birden fazla gün içinde aynı nöronların tekrar gözlem izin vermez ya da bireysel nöronlar ³ gözlemlemek için yeterli çözünürlüğe sahip değilsiniz ^{, 4.} Burada, üzerinde bireysel kortikal nöronların deneyim-bağımlı gen ekspresyon değişiklikleri izlemek için genetik olarak kodlanmış floresan muhabiri olan iki foton mikroskopi vivo birleştiren bir yöntem tarif gün-gün deneyim tabii.

Köklü deneyimi bağımlı genlerden biri Aktivite regüle sitoskeletal ilişkili protein (Arc) ^5,6 olduğunu. Arc transkripsiyon hızla ve son derece yoğunlaştırılmış nöronal aktivitenin ³ ile ^tetiklenen, ve onun protein ürünü glutamat reseptörleri ve uzun vadeli sinaptik plastisite ⁷ endositoz düzenler. Arc ifadesi yaygın ³ özel davranış katılan nöral devrelerin eşlemek için bir moleküler belirteç olarak kullanılmıştır. Bu çalışmaların çoğunda, Arc ifadesi sabit beyin bölümlerinde situ hibridizasyon veya immünohistokimya saptandı. Bu yöntemleri Arc ifade Arc ifade hücresel desenleri gün boyunca tekrarlanan ya da farklı deneyimler çoklu atakları ile değişebilir incelenmiştir değildi nasıl davranışsal deneyim, sonra eksitatör nöronların bir alt kümesi lokalize olduğunu göstermiştir rağmen. ntent "> in vivo iki foton mikroskopi canlı beyin ^8,9 deneyim bağımlı hücresel değişiklikleri incelemek için güçlü bir yol sunar. iki foton mikroskopi ile canlı nöronlar Arc ifade muayene etkinleştirmek için, önceden oluşturulan bir knock- fare doğrultusunda bir GFP muhabiri endojen Arc organizatörü ¹⁰ kontrolü altında yerleştirilir. hangi Bu protokol cerrahi hazırlıkları ve canlı hayvan nöronal toplulukları deneyim-bağımlı Arc-GFP ifade desenleri izlemek için görüntüleme yöntemleri anlatılmaktadır. Bu yöntemde , kronik kranial pencereler ilk ilgi kortikal bölgeler üzerinde Arc-GFP fareler implante edildi. Bu hayvanlar daha sonra art arda birkaç gün boyunca istenilen davranış paradigmaları sonra iki foton mikroskopi ile görüntülenmiştir. Bu yöntem taşıyan hayvanların genel olarak uygulanabilir olabilir diğer floresan gazetecilere deneyim-bağımlı moleküler değişikliklere ^4.

Protokol

Aşağıda açıklanan deneysel prosedürleri Ruh Sağlığı Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Ulusal Enstitüsü tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes göre idi.

1. Pre-operatif Hazırlama

1. Aseptik cerrahi öncesi sıcak boncuk sterilizatör tüm araçları temizleyin,% 70 etanol ile cerrahi alan temiz ve temiz açılan bezler indirdi. Steril eldiven giyin. Ml / g, intraperitonially 0.02 verilen taze hazırlanmış% 1.2 avertin çözeltisi ile hayvan anestetize. Alternatif olarak, pasif bir çöpçü devreli bir burun konisi, indüksiyon için% 5, bakım için% 1.5, izofluran ile gaz ile uyutmak. Tam sedasyon sağlamak için kuyruk veya ayak tutam kullanarak anestezi seviyesini kontrol edin.
2. Steril oftalmik merhem ile hayvanın göz kapağı ve taze hazırlanmış deksametazon enjekte edilir (0.2 mg / kg) ve karprofen (5 mg / kg) subcutaneouslBeyin şişme ve iltihaplanmayı önlemek için ¹¹ y. Kulakları arasındaki kafatası üzerinde saç Tıraş ve betadin fırçalayın ve% 70 etanol üç alternatif bezlerle cildi sterilize.
3. 37 hayvan seti altında bir su sirkülasyon ısıtma pedi ile, earbars olan bir stereotaksik cerrahi aşamasında hayvan monte ° C. Düzenli hayvanın anestezi düzeyleri kontrol etmek ve gerektiğinde orijinal anestezik dozu tamamlamak.
4. Alan uyuşturmak için kafa derisi deri altına% 0.5 marcain 200 ul enjekte edilir. Cilt kesilirken ve kafatası üzerinde flep kaldırmak. Periost çıkarın ve temiz pamuklu çubukla kurulayın.

2. Kronik Kranial Pencere Cerrahisi

1. Yavaşça ilgi beyin bölgesi üzerinde 3-5 mm çaplı daire özetledi 0,5 mm çapak ile yüksek hızlı bir diş matkap kullanın. Düzenli, temiz pamuklu çubukla steril% 0.9 salin ve uzak net kemik tozu ile sondaj sahasını ıslak. Kemik kanamaları, g kullanınelfoam taşma kurulayın ve bunu durdurmak için beklemek steril serum fizyolojik ile çimlendirilmiş.
2. Son kemik tabakası ulaşıldığında, ince uçlu forseps ile kemik ada kaldırın ve çıkarın. Penceresinde bir kemik sütür geçerse kemiğin alt rafa Dura ekleri karşılaştı olabilir. Kemik kapak kaldırıldığında gibi Bu nazikçe kaldırılması gerekir.
3. Rulo yüzeyi temizlemek ve durdurmak için herhangi dural kanama için beklemek maruz dura üzerinde hafifçe jel köpük nemlendirilmiş Kritik adım:. Tüm dural kanama durana kadar devam etmeyin. Kraniyal pencere içine hapsolur Kan genellikle opak bir pencere açar.
4. Dura yukarıda dura kaldırarak, özellikle kalın olduğu ilgi bölgesi bir yer altında ise, gerekli olabilir. Bu durumda, hafifçe çok ince forseps ile aşağıdaki pia gelen dura ayırmak, ince forseps bir çift ile kaldırdı dura küçük bir kesi yapmak, sonra kesik kenarları kavrayın ve yavaşçadura bölünmüş. Dura ince fakat kuvvetli, yani dura sağlam kenarları ile beyin dilim için dikkatli olun.
5. Steril ACSF veya steril serum fizyolojik ile alanı durulayın.
6. . Dura veya pia üzerinde steril bir cam lamel (3-5 mm) Kritik adım Lay: çevreleyen kafatası eğrileri önemli ölçüde ise, dura veya pia bölgelerde lamel ile yakın temas yapmazdım yerleri doldurmak için Kwiksil ¹² yapıştırıcı kullanın bilgidir olmayacaktır.
7. Elastomer yapıştırıcı ve cam lamel kenarlarını kaplayacak şekilde Siyanoakrilat jeli kullanın. . Herhangi bir siyanoakrilat jel beyin yüzeyine temas etmesine izin vermeyin: siyanoakrilat jel veya krazyglue ve diş çimento karışımı ile tüm maruz kafatası Kritik adım örtün.
8. Kafatasının karşı ucuna bir ısmarlama metal kafa sabitleme çubuğu gömün.
9. Ketoprofen bir İntraperitoneal enjeksiyon, 5 mg / kg fo sonra, sıcak bir iyileşme odasına hayvan Dönüşr ağrı yönetimi. İki gün daha operasyon sonrası için analjezik devam edin.
10. Ameliyat sonrası iyileşme iki hafta sonra, (indüksiyon için% 5, bakım için% 1.5) izofluran ile hayvan uyutmak, bir baş-fiksasyon çerçeve ile ısmarlama bir mikroskop aşamasında monte ve optik netlik için kraniyal penceresini kontrol edin mavi ışık ile aydınlatma altında. Beyin yüzeyi damar netlik kraniyal pencere kalitesi önemli bir göstergesidir. Damar kenarları keskin olarak tanımlanmış ise, pencereyi kullanılabilir olması muhtemeldir. Iki hafta ameliyat sonrası iyileşme süresi cerrahi kurtarmak için hayvan için yeterli zaman tanımak için tavsiye edilir. Kraniyal pencereler genellikle temizlemek ve iyileştirmek bu süre içinde, ve dura kafatası veya kalınlaşma büyütme penceresi kalitesini düşürür kadar ay ek hafta optik saydam kalır.

3. İki foton Mikroskobu, Taramalı Davranış Protokolü ve Lazer

1. Net c Hayvanlarranial pencere çevresel bir uyarıcı maruz kalan ya da bir davranış antrenman tabi tutuldu ve daha sonra maksimal Arc-GFP tanımının o zaman sonra yansıma olacaktır. Bir davranış protokolü başlamadan önce, hayvan bazal Arc-GFP ifade düzeylerinde gün-gün varyasyonu azaltmak için tutarlı bir ev kafes ortamında tutulmalıdır.
2. Ilgi beyin bölgesine bağlı olarak, davranışsal eğitim veya çevresel stimülasyon paradigmaları başlayın. Örneğin, hayvanlar ardışık gün içinde farklı görsel ortamlara maruz kalabileceği ve görsel korteks ¹⁰ uyarıcı-özel yanıtlar tanımlamak için görsel uyarı sonrasında her gün görüntülenmiş.
3. Nöronlarda Arc-GFP floresan genellikle iki saat stimülasyonu sonrası doruk düzeyine ulaşır. Deneysel çizelgesi doruğa floresan seviyelerde nöronlarda Arc-GFP tanımının algılama için optimize edilebilir.
4. Davranışsal bir antrenmandan ya environmenta sonral uyarım tamamlandığında, (indüksiyonu için% 5, bakım için% 1.5), izofluran ile hayvan anestetize ve iki-fotonlu mikroskop altında kafa tespit çerçeve ile ısmarlama mikroskop aşamasında hayvan monte edin.
5. Hayvanın baş pozisyonu kafatası üzerinde implante metal çubuk kullanarak, sahne doğrudan bağlanan kafa fiksasyon çerçeveye sabitlenir. Isoflurane ve oksijen kesintisiz bir burun yoluyla fare için temin edilir. Vücut sıcaklığı bir ısıtma yastığı kullanılarak korunur.
6. Mikroskop dedektörler karanlık bir odada iki foton lazer tarama yaparak ortam ışığı korunur emin olun. Görüntüleme için bir 20x veya 25x (1.05 sayısal diyafram) suya daldırma objektifi kullanın. Birincisi, epi-floresan aydınlatma altında, gelecekte görüntü uyum için bir CCD kamera ile ilgi beyin bölgesi üzerinde yüzey damar desenleri bir görüntü kazanır.
7. 3-D görüntü yığını elde etmek için tarama iki foton lazer başlatın. Bir Olympus FV1000MPE çoklu foton mikroskop bizim kurulum kullanılmaktadır. Iki-fotonlu lazer uyarma dalga uzunluğu 920 nm 'de yer almaktadır, ve objektif yayılan lazer gücü yaklaşık 50 mW ayarlanır. Yayılan floresans eşzamanlı örneği yakın yerleştirilmiş harici iki kanallı photomutiplier algılama sistemi kullanılarak yeşil ve kırmızı kanalları (570 nm'de dikroik ayna, 495-540 nm ve 570-625 nm bariyer filtreler), tespit edilmiştir. Doku oto-floresans kanal ^{13, 14} hem görünür, oysa Arc-GFP floresan sadece yeşil kanal görünür.
8. Tipik görüntü yığınlarını yaklaşık 320x320x100 mikron boyutları (en x boy x derinlik), 0,5 mikron / piksel yatay çözünürlük ve 3 mikron / piksel dikey çözünürlüğe sahip.
9. Görüntü yığını aldıktan sonra, onun ev kafesine hayvan dönün. Sonraki davranış ve görüntüleme oturuma kadar hayvan rahatsız etmeyin. Desir olarak gün boyunca davranış ve görüntüleme işlemi tekrarlayıned. Geri aynı görüntüleme konuma yönlendirmek için önceden edinilmiş beyin yüzeyinde kan damarı resmi kullanın.

Sonuçlar

Bu protokol canlı hayvanların bireysel kortikal nöronların deneyim-bağımlı moleküler değişiklikleri izlemek için bir yöntem açıklanır. Kronik bir kraniyal pencere ilk gen floresan muhabiri taşıyan bir fare bir ilgi kortikal bölge üzerinde oluşturulur. İki foton mikroskopi sonra tek tek nöronların davranışsal indüklenmiş moleküler değişiklikleri gözlemlemek ve birden fazla gün içinde nöronların aynı setleri tür değişiklikler (Şekil 1) izlemek için çeşitli ...

Tartışmalar

In vivo görüntüleme yöntemi burada açıklanan canlı hayvan birden fazla gün içinde nöronların aynı setleri Arc gen ekspresyon değişiklikleri tekrar muayene sağlar. Çeşitli davranışsal deneyimler yanıt bireysel nöronların nöral plastisite ile ilgili moleküler dinamiği hakkında bilgi edinmek için etkin ve çok yönlü bir yöntemdir. Böyle situ hibridizasyon ve immün olarak Standart histokimyasal yöntemler çözünürlüğü ³ tek hücreli ^ul...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ekipman Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
FV1000 çoklu foton lazer tarama mikroskobu	Olimpos	FV1000MPE	Görüntüleme
Diseksiyon mikroskobu	Omano	555V107	Cerrahlık
Fareler için Stereotaktik cerrahi aşamasında	Harvard Apparatus	726335	Cerrahlık
20X veya 25X su immersiyon objektif	Olimpos	XLPL25XWMP	Görüntüleme
Baş-fiksasyon çerçeve Mikroskop sahnede	Özel yapılmış	N / A	Görüntüleme
Güzel forseps	Güzel Bilim Araçları	11251-20	Cerrahlık
Diş matkap çapak	Güzel Bilim Araçları	19007-05	Cerrahlık
CCD kamera	QImaging	QICAM 12-bit	Görüntüleme