Cerrahi Örnekler kaynaktan İnsan pankreas adacıklarının Lazer Diseksiyon için Geliştirilmiş Protokolü

Dorothée Sturm; Lorella Marselli; Florian Ehehalt; Daniela Richter; Marius Distler; Stephan Kersting; Robert Grützmann; Krister Bokvist; Philippe Froguel; Robin Liechti; Anne Jörns; Paolo Meda; Gustavo Bruno Baretton; Hans-Detlev Saeger; Anke M. Schulte; Piero Marchetti; Michele Solimena

doi:10.3791/50231

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

Özet
Özet
Protokol
Sonuçlar
Tartışmalar
Açıklamalar
Teşekkürler
Malzemeler
Referanslar
Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Lazer mikrodisseksiyon parankiminde dakika miktarlarda seçili hücrelerin iyileşme sağlayan bir tekniktir. Burada Transkriptomik çalışmaları için kullanılacak cerrahi yöntemlerle alınan insan pankreas adacık elde etmek için bir protokol açıklar. Tüm protokol böylece toplama kolaylaştırılması insan beta hücrelerinin içsel otofloresansı, geliştirir.

Özet

Lazer mikrodisseksiyon (LMD) parankim ^1,2 dakika miktarlarda seçili hücrelerin ve dokuların iyileşme sağlayan bir tekniktir. Disseke hücreleri gibi Transkriptomik veya proteomik çalışmalar, DNA değerlendirmesi veya kromozom analizi ^2,3 gibi soruşturmaların, çeşitli için kullanılabilir. LMD ait özellikle zor bir uygulama RNA ⁴ değişkenlik nedeniyle, hücreler örneğin pankreas gibi RNaz, yönünden zengin olan dokulardan gelen parçalanmış zaman özellikle belirgin olabilir, transcriptome analizdir. Hedef hücrelerin hızlı belirlenmesi ve toplanmasını sağlayan bir mikrodisseksiyon protokol doku işleme süresini kısaltmak için ve, sonuç olarak, RNA koruma sağlamak amacıyla, bu durumda önemlidir.

Burada Transkriptomik çalışmalar ⁵ için kullanılmak üzere cerrahi örneklerden insan pankreatik beta hücreleri elde etmek için bir protokol açıklar. 0.5-1 hakkında c pankreas Küçük parçalarm ³ kesit kadar hemen 2-metilbutane soğutulmuş dondurulmuş Tissue-Tek Ekim Bileşik gömülü rezeke pankreas numunelerin sağlıklı görünen marjları, kesilmiş ve -80 ° C'de depolanan edildi. 10 mikron kalınlığında, kırk seri bölümleri 1-2 dk kriyostat içinde kurutulur ve -80 saklanan cam slaytlar, ° C için ayrı ayrı transfer, -20 ° C ayar altında kriyostat üzerine kesildi

Hemen lazer mikrodiseksiyon işlem öncesi, bölümleri buz% 100 iki bir dakikalık inkübasyonlar tarafından, buz giderilen taze 30 sn için% 70 etanol hazırlanan buz DEPC-işlenmiş su 5-6 dips ile yıkandı ve susuz edildi Etanol 4 dk için ksilen (doku kurutma için kullanılan) takip etmektedir; doku bölümleri 3-5 dakika süreyle daha sonra o zaman hava kurutuldu. Önemli olarak, bütün adımları, ksilen içinde kuluçka dışında, buz gibi soğuk reaktifler kullanılarak yapıldı - daha önce açıklanan protokol ⁶ fazla bir değişiklik. Utbuz reaktiflerin yonu beta hücrelerinin içsel otofloresans belirgin bir artışa yol açmıştır, ve bunların karşılaşılmaktadır. Mikrodisseksiyon için, dört bölümden her zaman susuz: iki nem ve ağartma gelen doku korumak için, bir folyo sarılı 50 ml tüp içine yerleştirildi, geriye kalan iki hemen microdissected edildi. Bu prosedür (AutoLPC) modu catapulting Otomatik Lazer Basınç kullanan bir PALM MicroBeam enstrüman (Zeiss) kullanılarak yapıldı. 40-60 dk daha artık gerekli dört cryosections gelen beta hücre / adacık diseksiyon tamamlanması. Hücreler bir AdhesiveCap içine toplanmış ve 10 ul lizis tamponu ile lizlendi. Transkriptomik analiz için her biri tek bir RNA örnek 10 hücre microdissected örnekleri, Pico Saf RNA izolasyon kiti (Arcturus) kullanarak, RNA ekstre bir araya getirilmesiyle elde edilmiştir. Bu protokol böylece hızlı ve doğru bir şekilde tanınmasını ve c kolaylaştırılması, insan beta hücrelerinin içsel otofloresans artırırollection. Bu prosedürü daha da iyileştirilmesi tip 2 diyabet ile ilişkili değişiklikler daha iyi anlamasını mümkün etkileri olan, fenotipik farklı beta hücrelerinin diseksiyonu sağlayabilir.

Protokol

1. İnsan Pankreas Doku Dondurucu

Yağ dokusu, kan damarları, sinirler ve neşterin ve cımbız ile non-parankimal doku çıkarın ve parçaları (~ 0,5-1 cm'lik küpler) içine pankreatik doku kesti.
Bir Cryomold merkezinde tek pankreas dokusu parça yerleştirin ve soğuk Tissue-Tek Ekim bileşiği ile tamamen kapsamaktadır. Kimin altında sıvı azot içinde önceden soğutulmuş 2-metilbutane ve ek dondurma ile kaplı bir kavanoza Cryomold koyun. -80 ° C'de dondurulmuş numune depolamak

2. Dondurulmuş Bölümler hazırlanması

RNA denatürasyon önlemek için tüm adımları boyunca eldiven giyin.
Dışarda soğuk% 100 etanol ve RNaz ile kriyostat bıçak, Numune tutucu ve fırça temizleyin. Kriyostat içindeki dondurulmuş doku yerleştirin.
Doku, bıçak ve fırça -20 ° C'ye ulaşıncaya kadar bekleyin Beklerken kriyostat odası içinde SuperFrost Plus slaytlar ve pre-serin bunları etiketleyindoku -20 ° C'ye ulaşması için
Numune tutucu üzerindeki Tissue-Tek Ekim Bileşik sürün ve üstüne dondurulmuş doku yerleştirin.
Tissue-Tek Ekim Bileşik dondurulur kez cryoblock Döşeme ve bir jilet ile Tissue-Tek Ekim Bileşik herhangi bir aşırı kaldırın.
Pankreatik doku bloğundan 40 ardışık 10 mikron dilim toplam kesin. Ayrıca biz mikrodiseksiyon sürecinde dilimleri içinde adacıklar belirlenmesini kolaylaştıracak pankreatik kısmın genel çizimler için kaydedilmek üzere ilk ve orta dilim kesmek tavsiye.
Bıçak bıçak bölümüne uyacaktır sadece bölgeyi ısıtmak için parmağınızı (bir eldiven ile kaplı) ile slayt arka dokunarak SuperFrost Plus slayt merkezine bölümleri aktarın.
-20 Kriyostat içindeki bölümlerde 1-2 dk ° C, kuru buz üzerinde yerleştirilen bir slayt kutunun içine koyun sonra kurulayın. Bölümlerini depolamak-80 ° C
Gerekirse, kağıt havlu ve soğuk% 100 etanol ile bıçak temizleyin.

3. Dondurulmuş Bölümler Dehidrasyon

Reaktifler hazırlayın: 30 ml taze hazırlanmış% 70 etanol, 30 ml DEPC işlenmiş su, 2x30 ml% 100 etanol ve 50 ml Cellstar borular (Şahinleri) içine 30 ml ksilen dökmek, soğuk ve buz üzerinde tüm reaktifler (ksilen hariç) tutmak.
% 100 etanol ve RNaseZAP ile kaputun altında çalışma alanı temizleyin.
Şöyle Süreç iki cryosections: buz DEPC-işlenmiş su 5-6 hızlı dips ile yıkayın, 30 saniye boyunca buz gibi soğuk% 70 etanol içinde düzeltmek, ksilen 4 dakika inkübe edilir, buz% 100 etanol içinde 1 dakika boyunca iki kez kurutmak oda sıcaklığında (25 ° C), ve 3-5 dakika boyunca kuru hava at. Cryosections başka bir çift ile bu adımı yineleyin.
Işık ve nemden korumak için alüminyum folyo ile sarılmış bir 50 ml Cellstar tüp içine sırt sırta iki kurutulmuş cryosections yerleştirin.

4. PALM MicroBeam, Zeiss ile Beta-hücreleri Lazer Diseksiyon

RNaseZAP ile mikroskop temizleyin ve RoboMover yılında Yapıştırıcı Cap monte.
Filtre seti 09 (uyartım: 450-490 nm, emisyon> 515nm), AutoLPC modu,% 50 lazer enerjisi,% 65 lazer odak,% 100 lazer hız, AutoLPC çekim arasında 5 mm mesafe, 6 mikron mesafe aşağıdaki ayarları belirleyin -10100: hattına Çalışma yüksekliği.
Aşamasında içine bir slayt yerleştirin.
Mikroskopik (5x veya 10x objektif) altında autofluorescent beta hücreleri bulun.
40x lense geçiş, "Freehand" seçim aracı ile beta hücreleri seçin ve lazer kullanarak bunları microdissect.
Tek AdhesiveCap içine dört susuz cryosections dokusu yakalayın.
1 Yorum: Bir susuz cryosection ve beta hücreleri incelemek için zaman neden olacaktır doku bölümleri rehidrasyon önlemek için 10-20 dakikadan uzun olmamalıdırBozulması RNA.
2 Yorum: kapısına kadar sahne taşıdıktan sonra görsel inceleme ile başarılı mikrodisseksiyon işlemi doğrulayın.

5. Microdissected Beta Hücre Zenginleştirilmiş Doku parçalanması

RoboMover dan AdhesiveCap çıkarın.
AdhesiveCap bir kapak ve 42 de ters inkübe ° C 30 dakika boyunca içine Pipet 10 ul ekstraksiyon tamponu (XB, PicoPure RNA İzolasyonu Takımı, Arcturus).
10,000 xg'de aşağı spin ve kuru buz üzerinde lizat koydu. RNA ekstraksiyonu yapılır kadar -80 ° C'de saklayın.
Tekrar 3. adımları yineleyin.) 5.) Diğer tüm bölümler.

6. RNA Ekstraksiyon

Tüm on 10 ul lizatları birleştirin
% 70 Etanol (DNaz Tedavi dahil) 1:1 oranında Ekstraksiyon Tamponu (XB) kullanarak, PicoPure RNA İzolasyonu Takımı, Arcturus protokole göre oda sıcaklığında çalışarak RNA izolasyonu ile devam edin.

7. RNA Analizi

Bir Agilent 2100 Bioanalyser (picoChip'in) kullanarak kalite ve miktar analizi için 1 ul RNA kullanın. Kantitatif değerlendirme çip üzerinde paralel olarak yüklü bir RNA için referans standart olarak yapılır.