Diyabet Araştırma β-hücre Kütle Dağılımı değerlendirmelerinde Kızılötesi Optik Projeksiyon Tomografi civarında

Özet

Biz optik projeksiyon tomografisi (OPT) adaptasyonu tarif ¹ Yakın kızılötesi spektrum, ve hesaplama araçları bir dizi uygulama içinde görüntüleme için. Bu protokoller, büyük numuneler pankreas β-hücre kitlesi (BCM) değerlendirmelerini sağlayan tekniğin kanallı kapasitesini artırmak ve OPT verilerin kalitesini artırmak.

Özet

Yakın kızılötesi (NIR) spektrum görüntüleme yeteneğini eklemek için OPT adapte olarak, biz burada böyle sıçan pankreas pankreas dokusu görüntüsü daha büyük cisimlerin imkanı göstermek ve kanal sayısı (hücre tipi) olabilir artırmak için tek bir örnek olarak incelenecektir. ; Yazı için 2 / geliştirilmiş algoritmalar bir örneğinin (bizim durumumuzda pankreas) dönme ekseninde kütle merkezi (COM) (AR) ² 1 / doğru konumlandırma: Biz daha verin hesaplama araçlarını bir dizi uygulama tarif -hizalama tomografik geriçatma ² ve 3 / OPT tabanlı BCM tespitler ³ gürültü oranları sinyal artırmak için yoğunluğu dengeleme için bir protokol sırasında geometrik bozulmaları önler ayarlama. Ayrıca, görüntü edinimi sırasında numune kasıtsız hareketleri riskini en aza indiren bir numune tutucu açıklar. Birlikte, bu protokolleri BCM dağıtım ve oth değerlendirmelerini sağlamaker özellikleri, Langerhans adacıkları bireyin düzeyine çözünürlüğe sahip, sağlam pancreata veya diğer organlara (adacık nakli çalışmaları gibi) hacmi boyunca aşağı yapılmalıdır.

Giriş

Β-üreten hücrelerin insülin kan şekeri dengesini kontrol etmek için vücudun yeteneğini için anahtardır. Bu nedenle, pankreas BCM dağıtım değerlendirmeler klinik öncesi diyabet araştırma birçok alanda zorunludur. Örneğin terapötik rejimlerin değerlendirmelerde, hastalık için kemirgen modellerinde endokrin hücre farklılaşması veya diyabet etiyolojisi çalışmaları hedeflenen gen ablasyon etkisi sık sık bu tür analizler bağlıdır. Geleneksel olarak, bu tür değerlendirmeler boyut ve pankreas kompleks anatomik anayasasını dolayı yapmak zor olan zaman alıcı stereolojik yaklaşımlar yararlanmıştır. Şu anda en yüksek çözünürlüklü görüntüleme yaklaşımlar (genellikle optik), kemirgenler tüm pankreas görüntüleme için yeterli penetrasyon derinliği vermeyin. Tersine, onların penetrasyon derinliği (genellikle nükleer) ile sınırlı değildir görüntüleme yaklaşımları tam BCM dağılımı gidermek için yoksul kararlılık sağlamak ve engellenmektedir^4,5 yeterli kontrast maddelerin eksikliği.

Optik projeksiyon tomografi cm çaplı ⁶ mm biyomedikal numunelerin yüksek çözünürlüklü değerlendirmeler sağlayan bir 3D görüntüleme yöntemidir. Bu vesile ile, mekansal konumu ve Langerhans adacıkları ifade bireyin insülin hacmi hakkında bilgi normal ve diyabetik farelerde ^3,7-10 yılında pankreas hacmi boyunca elde edilebilir. Bu çalışmanın amacı, daha pankreatik β-hücrelerinin değerlendirilmesi için bu tekniğin kapasitesini artırmak için; diğer dokular, diğer pankreatik bileşenlerin (örneğin hücre tipleri infiltratif gibi) onların ilişkisi içine ve büyük aşılı kendi endojen dağılımı, önceden mümkün olandan pankreas hazırlıkları.

Yakın kızılötesi optik projeksiyon tomografi (NUR-OPT) kurulumu

Protokoller, yukarı Sharpe tarafından tanımlanan orijinal kümesine dayanan OPT tarayıcının altında ise ¹ ve diğerleri, açıklanan ve kullanılmaktadır. Fare pankreas (BCM gibi) tek bir kanal değerlendirilmesi için, SkyScan 3001 (Bioptonics) tarayıcı kullanılabilir.

650nm Yukarıdaki dalga boylarında bir civa ark lambası daha yüksek uyarma enerjisi sağlayan metal halide lamba, eksitasyon ışığı sağlar. Işık sıvı ışık kılavuzu ile aktarılır. Florokromlar ve NIR floresan görüntüleme ve kanal ayırma için bant geçiş filtresi yararlı bir kombinasyon Şekil 3 'de gösterilmiştir. Yayılan ışık NUR spektrumunda yüksek kuantum verimliliği ile, arka aydınlatmalı CCD kamera ile tespit edilir. OPT tarama bir kamerayı kontrol LabView platformu ve step motor kullanılarak otomatik olarak yapılır. Bozulmamış sıçan pancreata, korunmuş bir gümüş kaplı ayna ve bir küvet büyük boyutu olarak örnek desteklemek için kullanılır. Son olarak, bir numune tutucu istenmeyen dikey movemen ortadan kaldırırTarama sırasında numunenin ts tasarlanmıştır.

Protokol

1. Numune Hazırlama ve Tarama

1.1 Numune hazırlama

^7. Daha önce tarif edildiği gibi Aşağıdaki prosedür, temelde gerçekleştirilir.

1. Pankreas Harvest. Proteolitik degradasyona önlemek için buz gibi soğuk PBS kullanın.
2. 2-3 saat için buz üzerinde PBS içinde% 4 PFA doku düzeltildi. Loblar fiksasyon sırasında "yayılmış" olduğundan emin olun. Bu rekonstrüksiyon sonrası anatomik yerlerinden belirlenmesini kolaylaştıracaktır.
3. 30 dakika boyunca ilave PBS içinde yıkanır.
4. Metanol içinde kademeli olarak pankreas (33,% 66,% 100), 15 dakika / adım kurutmak. Bu (adım 5) bleaching sırasında kabarcık oluşumunu en aza indirir ve (bkz: adım 7) donma-çözülme sırasında hücre tahribatını önler.
5. _{H2O: 2:} DMSO endojen doku floresan gidermek için 24 saat oda sıcaklığında bir 02:01:03 oranında tampon ağartma taze hazırlanmış MeOH içinde doku inkübe edin. Yeni bleachi daha büyük örnekler, değişim içinBaşka bir 24 saat için ng tampon ve inkübe.
6. ON, aşırı MeOH içinde yıkayın.
7. -80 En az 5 döngü için donma-çözülme ° C - RT antikor penetrasyon kolaylaştırmak için.
8. TBST (33,% 66,% 100), 15 dak / adıma geri adım adım rehidrate.
9. Oda sıcaklığında 12-24 saat boyunca% 10 serum (tercihen ikincil antikor oluşturulduğu aynı türden),% 5 DMSO ve% 0.01 Naaz ile TBST içinde Blok
10. RT, 48 saat süreyle tampon engelleme primer antikorlar ile inkübe, daha geniş örneklem (Burada kullanılan antikorların reaktiflerin tabloda listelenmiştir) için 72 saat kadar uzanır.
11. ON, aşırı TBST yıkayın.
12. 48 saat boyunca floresan konjuge sekonder antikor ile inkübe, RT, büyük numuneler için 72 saat kadar uzanır.
13. ON, aşırı TBST yıkayın.

1.2

Aşağıdaki yordam (bkz. Şekil 7 agaroz örneklem mount ve özel yapılmış numune tutucu takmanız açıklamaktadır) Tarama OPT öncesinde.

1. Hörnblad ve ark ³ Şekil 3A'ya uygun olarak, dalak duodenum ve mide loblar ayırın. Loblar arasındaki ilişki ileri Hörnblad ark ^11'de açıklanmıştır.
2. % 1.5 (w / v) dH ₂ O, filtre, düşük erime sıcaklığına agaroz hazırlayın, 37 soğumasını bekleyin ° C ve deterjan aşındırmak ve buz üzerinde agaroz-gömmeden önce kabarcıkları dH ₂ O doku durulayın.
3. Senin örnek parça bir agaroz bloğu kesip ve numune ve agaroz tabanı arasında bir ~ 1 cm boşluk bırakın. Işık saçılması azaltmak için agaroz blok keskin kenarları (≤ 90 °) kesin.
4. Her bir zaman adım arasında denge sağlaması için izin MeOH (33, 66%,% 100) kademeli olarak örnek kurutmak. Örnek lavabolar zaman dengelenmiş olarak kabul edilir.
5. Benzil Benz: benzil alkol 1:2 çözelti içinde örnek temizlemeOATE (Babb) şeffaf hale gelinceye kadar. Ek 12 saat için Exchange Babb çözümü ve inkübe.
6. Numune tutucuya temizlenmiş numune konumlandırın ve tutucu flanş delinmiş delikler aracılığıyla agaroz boşluk ile 2 iğneler takarak sabitleyin.
7. Babb temizleme çözeltisi ile doldurulmuş bir küvet içine daldırın ve tarayıcı içinde örnek yerleştirin. Pancreata bir dizi karşılaştırarak aynı büyütme her tarama için kullanılmalıdır. Büyütme serisinin en büyük numune için optimize edilmelidir.

AR at örneğinin 1.3 Konumlandırma

Aşağıdaki protokolü tam COM-AR algoritması kullanılarak bir örnek yerleştirmek için prosedürü açıklar. ROI tüm numune bulunduğunda bu prosedür geçerlidir. Algoritmalar ayrıntılı açıklamaları için, Cheddad ark ² bakın.

1. Bot için iki pozisyonda örnek görüntülerini Edinmeh anatomisi ve sinyal kanalları. En büyük projeksiyon alanı, ve 90 ° (Z ekseni ile ilişkili olan) konum ₂ de sergileyen 0 ° (X-ekseni ile ilişkili), at Pozisyon _1. Biz anatomi görselleştirmek için GFP kanalı kullanıyor.
2. Eşik ROI'ye anatomi görüntüleri beklenti-maksimizasyonu (EM) algoritması uygulayın.
3. 0 ° ve 90 ° projeksiyonları için 2. adımda elde ikili görüntülerin COM noktaları (x-koordinatları) hesaplayın.
4. 0 ° ve sinyal kanalı 90 ° görüntüleri Adım 3'te hesaplanan tanımlanan COM noktadan geçen dikey bir çizgi Superimpose.
5. Referanslar View Saha merkez çizgisinin örnek bulundu COM puan geçer böylece örnek hareket olarak 4. adımda elde edilen görüntüleri kullanın.

1.4 Tarama

1. Satürasyonu olmadan mümkün gürültü oranı en yüksek sinyal elde etmek için etki süreleri ayarlamaprojeksiyon görüntüleri ting herhangi bir yerlerde. Taranacak tüm kanallar için tekrarlayın.
2. Taranacak ilk floresans kanal için filtre ayarı seçin. Kısa λ floroforlar gelen salma uzun λ florofor ile tahrik ve böylece resim ağartma neden olabilir. Bu olasılığı en aza indirmek için, ilk uzun uyarma λ ile fluorofor tarayın.
3. Örnek aydınlatmak ve her kanal için dikey eksen boyunca örnek dönen, 360 ° 'den fazla floresan sinyal toplamak için deklanşör açın. NUR-OPT kurulumu için kullanılan adım açısı 0,9 ° ve Bioptonics 3001 tarayıcı 0,45 ° için.
4. Sonraki kanal için uygun filtreyi seçin ve yukarıdaki işlemleri.

2. Hesaplamalı İşleme ve Yeniden Yapılanma

2.1 Post-edinimi kayma algılama ve düzeltme (A-değeri ayarlama)

Projeksiyon tomografide, genel olarak gerekliöncesinde yeniden dönme ekseni boyunca ince ayar görüntülerin konumuna projeksiyonlarına bir post-hizalama değerini atamak. Bununla birlikte, optik eksen yönünde kamera açısını küçük bir sapma numune uzunluğu boyunca düzgün olmayan A-değerlerine neden olabilir ve böylece geometrik bozulma meydana getirir. Bu tür bozulmayı önlemek için, tüm numune boyunca doğru ve birleşik sonrası uyum değeri (A-değeri) bulmak için bir hesaplama yöntemi ² uygulanabilir.

1. 8 piksel yüksekliğinde blok içine 0 azından belirli bir sinyal projeksiyon ° ve 180 ° bölmek ve her blok arasındaki x-ekseni boyunca kayması (A-değeri) hesaplamak için dönüşümü bir ayrık Fourier kullanın.
2. Numune uzunluğu boyunca x-ekseni-shift eğimi tanımlayan açısı θ ', hesaplamak yardım etmek ve bir dönme merkez noktası bulmak için doğrusal en küçük kareler regresyon uygulayın.
3. Tüm Proje çevirerek tarama sırasında uzaklaşmaları için düzeltindönme merkez noktası etrafında ctions θ '/ 2.

2.2 Kontrast sınırlı adaptif histogram eşitleme (CLAHE)

Rekonstrüksiyon ve / veya kantitatif değerlendirmeler için segmentasyon sırasında "üzerinden eşiklenir" için risk altındadırlar çok zayıf sinyaller, sergilenmesi nesneleri (adacık) tespiti ve segmentasyonu kolaylaştırmak için, bir CLAHE algoritma projeksiyon görüntüleri uygulanabilir. CLAHE işlem iki ana yoğunluk dönüşümleri ile gerçekleştirilir:

1. Lokal kontrast tahmin ve projeksiyon görüntü örtüşmeyen blok içinde dengelenir.
2. Şiddetleri sonra bilinear enterpolasyon yoluyla bloklar arasındaki sınır bölgelerinde normalize edilmiştir.

Adı kontrast sınırlı görüntüde doyurarak piksel önlemek için ayarlanır klibi limiti ifade eder. Bu protokolde, MATLAB yerleşik işlevi "adapthisteq" varsayılan c ile kullanılan ve uygulanan 0,01 dudak sınırı ve 256 boyutunda döşeme. Not, optimum döşeme boyutunu ampirik olarak test edilmesi ve analiz örneğinin bağlı olarak değişebilir ihtiyacı var. Algoritması ve örnekler ile ilgili daha fazla detay Hörnblad ve ark ³ bulunabilir.

Not! Yukarıdaki hesaplama işlem adımlarını standart algoritmalar üzerine inşa edilir ve MATLAB (Mathworks) yürütülür (COM-AR, A-Değer tuning ve CLAHE dahil 1,3-2,2 bakınız).

2.3 tomografi yapılandırma ve iso-yüzey işleme

1. Süzülmüş bir arka projeksiyon algoritması kullanarak, düzeltilmiş ve normalleştirilmiş görüntüler şimdi birleşik kayma kompanzasyonu ve dinamik aralık optimizasyonu için asgari gerekliliktir yeniden inşa edilebilir. Bu protokol, tüm yeniden inşa NRecon yazılımı (Skyscan), sürüm 1.6.8 (mevcut süzülmüş geri projeksiyon yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmektedir= "_blank"> Http://www.skyscan.be/products/downloads.htm). Paralel ışın geometrisinde görüntüleme kurulum uygulanan sürece Not resimli bir nesnenin büyütme objektifin odak noktası uzaklığı bağlıdır. Bu nedenle, NRecon yazılım için bir projeksiyon dataset alırken bunun beraberindeki kaynak mesafesi (mm) ve tarayıcı dönme yönünü (saat yönünün tersine girdi "cc" için ve saat girişi "cw" için) doğru nesne dahil etmek önemlidir yeniden yapılanma sırasında koni ışın kaynaklı eserler önlemek için, günlük dosyası.
2. Elde edilen sanal bölümler yığınını görselleştirmek ve ölçmek için, Imaris veya Volocity gibi uygun görüntü işleme yazılımı kullanarak 3D iso-yüzeyler oluşturur.

Mürin adacık izolasyonu ve transplantasyonu yorumlanan protokol çerçevesinde Diyabet Araştırma Enstitüsü'nün Preklinik Hücre İşleme ve Translasyonel Model Çekirdek gerçekleştirilen ve Miam Üniversitesi tarafından onaylanmışi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu. Hayvanlar üzerinde yapılan araştırmalar için etik kurul, Kuzey İsveç, hayvanları kapsayan diğer tüm deneyler onayladı.

Sonuçlar

Geçerli yazıda ekstraksiyon ve NUR-OPT (Şekil 1) kullanarak kemirgen pancreata BCM veri (ve diğer dokular) hesaplama işlem için bir protokol açıklar. Şekil 2 de gösterildiği gibi, pankreas dokusu numunesi autofluorescense olarak belirgin bir NIR spektrum azalmıştır beklenmektedir. Langerhans insülin etiketli adacıklar değerlendirme oranı: Bu gürültü ortalama sinyal önemli bir artış (N S) yol açar. Olarak burada tarif spektrum, NUR bölümünde görüntüleme için OPT uyarlamalarına göre, en az üç belirli kanalları yeterli S ile görüntülendi olabilir: N oranı farklı olan fare pankreas hacmi boyunca antikor etiketli hücre tipleri değerlendirmelerini sağlamak için kanal ayırma (Şekil 3 ve 4'e bakınız). Diyabetojenik süreçler ve / veya genel olarak BCM değerlendirmelerin görüntüleme için uygulanan tekniğin böylece bir görselleştirme ve ölçümü için izin verirÇevre ve / veya hücre tipleri (bkz. Şekil 4) etkileşim göre insülin pozitif alanlar. Bu tür değerlendirmeler onun fare muadili (bkz. Şekil 5) 3-5 kat daha büyük olan sıçan pankreas da dahil olmak üzere daha önce çok daha büyük numuneler, gerçekleştirmek mümkün NUR aralığında elde artan doku penetrasyon derinliği sayesinde vardır. Ne olursa olsun görünür veya NIR dalgaboyu kullanılmaktadır olsun, CLAHE uygulanması önemli ölçüde tekniğin algılama hassasiyetini (bkz. Şekil 6) artırarak farklı genetik ve fizyolojik koşullar sırasında BCM temelli değerlendirmeler OPT kolaylaştırabilir. Gelişmiş numune tutucusu için bir plan Şekil 7 'de gösterilmiştir.

Şekil 1. Akış mur içinde BCM OPT bazlı analizler için kritik adımları gösterenine pankreas. tipik bir fare pankreas değerlendirmek için gereken süre 13-14 gündür. Tarama uzunluğu gerekli pozlama süresi (normalde yaklaşık 1 saat) bağlı iken zamanın çoğunluğu doku işleme ve immünohistokimyasal boyama (10 gün) boyunca tüketilen, doku temizleme yaklaşık 2 gün gerektirir. Daha sonraki sayısal işlem tipik olarak bir gün içinde gerçekleştirilir. Not, nispeten uzundur boyama protokolü ideal örneklerinin büyük miktarlarda toplu işlem için uygundur.

Şekil 2. Farklı dalga boylarında BCM değerlendirmeler için gürültü oranı Sinyal. Insülin ve florokrom-konjuge sekonder antikor kokteyli (Alexa 488, 594, 680 ve lekeli bir fare duodenum pankreas lob,Farklı dalga boylarında N oranı: 750), S belirlemek için kullanılmıştır. A Görüntüler her sinyal kanal için ilk projeksiyon karesini göstermek. Her bir sinyal kanal için N: ortalama S gösteren B, Grafik. Oranları plan yoğunluğu (ekzokrin doku endojen doku floresan) bölünmesiyle ortalama adacık yoğunluğu (215 adacık üzerine dayalı) olarak belirlendi. C, S gösteren Grafik: Yok Alexa 594 kanal için elde: S normalize her kanalda ayrı adacıklar N oranları. Tek yönlü varyans analizi kullanılmıştır. Anlamlılık seviyesi ** p <0.01 'e karşılık gelir göstermiştir. (A) 1 mm karşılık gelir Ölçek çubuğu. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil3. Kanal ayırma. A, tabloda listelenen Alexafluor boyalarla konjuge sekonder antikor proteinG-Sepharose boncuklar üzerinde ayrı immobilize edildi. B, floresan boncuklar daha sonra bir agaroz fantom farklı düzeylerde gömülü ve belirtilen filtreler kullanılarak görüntülendi.

Şekil 4. Diyabet araştırma tabanlı çok kanallı görüntüleme OPT. A, OPT Sigara Obez Diyabetik (NOD) tip 1 diyabet için model bir pankreas (12 hafta, duodenal lob) iso-yüzey rekonstrüksiyonu dayanır. Düz kas α-aktin (kan damarları, kırmızı) ve CD3 (T-lenfositler infiltre, yeşil); örnek insülin (adacık β-hücrelerinin, sözde renkli mavi) için lekeli. Kullanılan ilgili ikincil antikorlar vardı; Cy3, IRDye-680 ve sırasıyla DyeLight-750.parçalar (A'-A'' ') bireysel sinyal kanallarıyla gösterir. B, syngenic adacıkları ile aşılı ve transplantasyon sonrası NUR-OPT iki hafta ile görüntülenebilir bir fare karaciğer lob (lobus sinister lateralis) ve OPT görüntüsü (görünüm blow up). Insülin ifade adacıklar mavi pseuodocolored ve düz kas α-aktin pozitif gemileri kırmızı vardır. Yaklaşım damar ağı içinde adacık greft dağılım değerlendirmelerini sağlar. Ölçek çubuklar 1 mm karşılık gelir.

Şekil 5,. NUR-OPT büyük numunelerin görüntüleme kolaylaştırır. Tip 2 diyabet (9 ay dalak lob) için Zucker Yağ modelinden bir sıçan pankreas BCM dağılımının, Iso-yüzey işleme, sıçan görüntü numune olasılığı örnekleyen NUR-OPT tarafından pankreas ölçek. Olarak belirlendiBu teknik ile gösterilen lob onun fare muadili göre (v / v) ~ 6 kat daha büyüktür ve β-hücre hacmi toplam lobular hacminin% 1.32 oluşturan Langerhans adacıkları ifade 10139 ensülin barındırır. B, (A), doku ve her derinliklerinden adacıkları tespit edildiği gösteren de kırık çizgilerle gösterilen hat karşılık gelen tomografik bölümü. C, bir boyut referans olarak gösterilen bir fare pankreası (8 hafta için dalak lob) içinde BCM dağıtım Iso-yüzey görüntüleme. Görüntülenen lob olan β-hücre hacmi toplam lobüler hacminin% 0,89 oluşturan 2.490 insülin ifade adacık barındırır. Alexa594 pancreata konjuge keçi anti-GP (fare) ve sırasıyla IRDye 680 Konjuge eşek anti-GP (sıçan) antikorları tarafından takip GP anti-insülin ile boyanmış. In örnekleri (AC) (C) 2 mm karşılık ölçek ve ölçek bar betimlenmiştir.

Şekil 6. CLAHE OPT görüntüleme ile fare pankreas adacık tespitini kolaylaştırır. Ac, C57BL / 6 fare pankreas (8 hafta splenik lob) Temsilcisi iso-yüzey render OPT görüntüleri insülin için etiketli. OPT görüntülerin Iso-yüzey rekonstrüksiyonlar önce yapıldı (A, sözde yeşil renkli) ve CLAHE protokolünden sonra (B, sözde kırmızı renkli) uygulandı. C,-olmayan normalize veri Kaplama (A) ve (B) 'de CLAHE işlenmiş verileri. C'-C kırmızı-sadece "adacıklar", (A) non-normalize ve CLAHE işlenmiş (B) görüntüleri Temsilcisi yüksek büyütme kaplaması. Olarak varlığını gösterdiği ", CLAHE komut küçük ve düşük sinyal tespiti kolaylaştırır yoğunluğu adacıklar. Geçerli örnekte tasvir numune (CLAHE işlem sonrası) gelen işlenmemiş projeksiyon verilerine dayanarak Numaraları 1057 adacıktan wi oldu 1.74 mm ³ (hacminde 2419 adacıktan harbored1.77 mm ³⁾ bir hacme inci. D ve E, kontrol (D) ve CLAHE protokol uygulanması 6 ay sonra, tip 2 diyabet ¹² (e) için ob / ob fare modeli Örnek veri. Ob / ob pankreas (E) adacık boyutu genel olarak büyük bir artış not edin. (D) ve (E) pankreas dış hat (gri) doku otofloresans gelen sinyale bağlıdır. C Ölçek çubuğu AC 500 mikron. C Ölçek çubuğu "C" ve C''. Ölçek çubuğu E ile 1 mm karşılık olarak 200 mikron karşılık gelir (D) ve (AC) Hörnblad ve diğerleri ³ adapte edilmiştir olarak (E). Görüntü ve kullanılarak oluşturuldu Bioptonics 3001 tarayıcı.

Şekil 7. OPT örneklerin eki için örnek tutucu. Numune flanş önceden delinmiş delikler aracılığıyla agaroz boşluk aracılığıyla iğneler takarak sabitlenir. Tutucu via step motor menteşeliGüçlü mıknatıs tabanı bulunmaktadır. Bu kurulum kararsız tutkal kullanımı atlar ve tarama sırasında numune istenmeyen hareketleri önler.

Tartışmalar

OPT görüntüleme için anlatılan teknikleri fare pankreas hacmi boyunca mekansal ve niceliksel parametreler ekstraksiyon sağlar. Mezoskopik görüntüleme, bu tür için ulaşılabilir çözünürlük sınırlamaları nedeniyle belirtmek gerekir ki en görüntüleme yöntemlerinin yanı, daha büyük numune düşük çözünürlük (daha yüksek çözünürlüklü CCD kullanımı OPT tarama çözünürlüğünü artırmak gerekir rağmen) . Dolayısıyla, sağlam pankreas fare lobların değerlendirilmesi için, şu anda teknik olmasına rağmen yakın (yaklaşık 15-20 mikron) ⁷ Tek hücre çözümü sağlamaz. Yine, fare pankreas BCM dağılımının çıkarılması için protokollerinin tam morfometri ^3,13 sayma örneğin noktası elde eşleşen fazla Unutulmamalıdır ki veri sağladıklarını CLAHE protokolün uygulanması önemli ölçüde daha fazla adacıktan tespiti için izin verir ancak bu adacıklar genellikle daha küçük ve katkısı yokte büyük ölçüde tüm β-hücre hacmine.

Katılan immünohistokimyasal protokolleri (en fazla iki hafta) nispeten uzundur, ancak numune hazırlama için zaman gerçek eller kısa ve dolayısıyla tekniği de hayvanların ⁹ büyük kohort çalışması için uygun olmasıdır. Heterojen dağılımları potansiyel soruşturma için bir odak noktası ise, bakım fiksasyon ilgilendiren ve pankreatik doku olumsuz bir şekilde sabit hale gelir ve düz ("yaymak" olduğunu önlemek için montaj adımları alınması gerektiği vurgulanmalıdır doku) bağlama bu değerlendirmede kolaylaştırmak için çaba olmalıdır.

OPT gerçekleştirerek önemli bir konu da örnek COM dönme ekseni sabit ve tarama işlemi sırasında, yatay veya dikey, hareket etmediğinden olmasıdır. Bu nedenle attachi için istikrarlı mekanik kurulum ve iyi işleyen bir sisteme sahip olmak esastırng örnek. Biz yeni bir bağlama (Şekil 7) oluşturarak bu sorunu çözdü.

Paralel geometri bizim NUR-OPT veya sırt ve kaydedilen projeksiyon görüntüleri periferik nesnelerin önünde pozisyon arasındaki dikey bir kayma olduğu tespit edildi Bioptonics 3001 tarayıcı için doğru değildi. (2.3.1 bakınız) ilgili tarayıcının log dosyasına kaynak mesafe nesnesi ayarlayarak önemli ölçüde bizim veri kalitesini artırmak olabilir ve belirli bir öneme sahiptir projeksiyon görüntüleri en uzak kenarlarında geometrik bozulmaları düzeltmek zaman Daha büyük numuneler değerlendirilmesi.

Geçerli protokol, biz üç farklı belirli kanallar ve sağlam pankreas hazırlıkları değerlendirmelerinde bir "anatomisi" kanal görüntülenmesine izin filtre setleri bir öneri sunmak. Açıkçası bu ayarları floresan tüm formları olduğu gibi, daha iyi olmasına rağmen, belirli bir çalışma için kullanılan florokromlar uygun modüle olabiliryüzde mikroskopi, sinyal sızdırma-yoluyla potansiyel tehlike dikkatle değerlendirilmelidir. 750 nm ve üzeri heyecanlıyız florokromlar ile insülin etiketli adacık çalışma henüz bizim set up kullandığı metal halide lamba kullanarak bize mümkün olmamıştır. Bu alternatif ışık kaynağının (örneğin diyot lazerler) ile birlikte uygun dalga boylarında da yüksek kuantum verimliliği sahip bir kamera daha NIR-OPT potansiyelini artırmak ve daha yüksek dalga boylarında görüntüleme için izin verebilecek mümkündür.

OPT görüntüleme mm-cm ölçekte biyomedikal numune mekansal ve niceliksel olarak değerlendirilmesi için oldukça çok yönlü bir tekniktir. Burada sunulan protokol pankreas / diyabet araştırma amacı için geliştirilmiş olmasına rağmen, diğer türler, örnek tipine ve belirteçleri üzerine araştırma çevirmek mümkün olmalıdır. NUR-OPT görüntüleme f, sağlam pankreas hazırlıkları birkaç farklı kanallar görselleştirmek için potansiyel olarakurther sürece bu kontrast ajanlar da OPT tarafından algılanamaz bir fluorofor taşımak için tasarlanmış olabilir gibi diğer görüntüleme yöntemleri ile non-invaziv değerlendirme amaçlı kontrast maddelerin alımını özgüllüğünü değerlendirmek için bir araç olarak bir potansiyele sahiptir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif / Malzeme Adı	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar
Metanol	Scharlau	ME03162500
% 30 H2O 2	Scharlau	HI01362500
Benzil Alkol	Scharlau	AL01611000
Benzil Benzoat	Scharlau	BE01851000
Düşük meltingpoint agaroz	Lonza	50100
Paraformaldehid (PFA)	Sigma-Aldrich	158127
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787
Fare anti-ASMA-Cy3	Sigma-Aldrich	C6198	Primer antikor
Tavşan anti-CD3	Sigma-Aldrich	C7930	Primer antikor
Guinea Pig anti-Ins	DAKO	A0564	Primer antikor
Eşek karşıtı GP-IRDye680	LI-COR Biosciences	926-32421	İkincil antikor
Keçi anti Rb-DyeLight750	Thermo Scientific	35570	İkincil antikor
Keçi anti GP-Alexa594	Molecular Probes	A-11076	İkincil antikor
Keçi anti GP-Alexa488	Molecular Probes	A-11008	İkincil antikor
Keçi antiGP-Alexa594	Molecular Probes	A-11012	İkincil antikor
Keçi anti GP-Alexa680	Molecular Probes	A-21076	İkincil antikor
Keçi anti GP-Alexa750	Molecular Probes	A-21039	İkincil antikor
OPT Skyscan 3001	Bioptonics		OPT-Tarayıcı
Leica MZ FLIII	Leica Microsystems		Stereomikroskopta
Leica Amaç 0.5x	Leica Microsystems	10446157
Leica Camera adaptörü 1.0x	Leica Microsystems	10445930
Halide EL6000 Metal		11504115	Lightsource
Sıvı Işık Kılavuzu		11504116
Cuvette	Hellma Analytics	6030-OG	55 x 55 x 52.5 mm
Ayna	Edmund Optik	F68-334	50 x 50 mm
Andor Ikon-M	Andor Teknoloji	DU934N-BV	Arka aydınlatmalı CCD
Filterset	Chroma Teknoloji	41021-MZFLIII	TXR, Alexa-594, Cy3
Filterset	Chroma Teknoloji	41022-MZFLIII	IRDye680, Alexa-680
Filterset	Chroma Teknoloji	49037-MZFLIII	Dylight750, Alexa-750
ProteinG-Sefaroz boncukları	GE Healthcare	17-0618-01	Protein G Sepharose Fast Flow 4
Sodyum Azid	Sigma-Aldrich	08591	Sodyum azid 0.1 M çözelti