Yara Şifa murin Modeli

Özet

Fizyolojik ve patofizyolojik ortamlarda terapötik bileşiklerini değerlendirmek için de kullanılabilir deri yara iyileşmesinin Bir murin modeli.

Özet

Yara iyileşmesi ve onarım insan hayatta meydana gelen en karmaşık biyolojik süreçleri bulunmaktadır. Yaralanma sonrası, birden fazla biyolojik yollar aktif hale gelir. Örneğin diyabetli hastalarda görülür Engelli yara iyileşmesi, bu amputasyon gibi ciddi olumsuz sonuçlara yol açabilir. Yara onarımı teşvik yeni ilaçlar geliştirmek için giderek artan bir ivme nedenle, var. Bunların test gibi genellikle pratik değildir domuz gibi büyük hayvan modellerinde sınırlı kalmıştır. Bu ekonomik ve mekanik soruşturma için izin verir genetik manipülasyon, mükellef olarak fareler, ideal klinik öncesi modeli temsil eder. Ancak, öncelikle daralma yoluyla gerçekleşir olarak bir fare iyileşme insanlarınkine temelden farklıdır sarılır. Bizim fare modeli yara etrafında bir atel dahil ederek bu üstesinden gelir. Yara splintleme olarak, onarım işlemi yakından ayna epitelizasyon, hücre çoğalması ve anjiyogenez, ardından bağlıdırinsan yara iyileşmesinin biyolojik prosesler. Tutarlılık ve bakım gerektiren iken, bu fare modeli karmaşık cerrahi teknikleri içerir ve örneğin, damar gelişimini inhibe edebilir ya da iltihap umut vaat eden maddelerin güçlü bir test edilmesine izin vermektedir. Iki yara hazırlanır Dahası, her bir fare, test bileşiği ve aynı hayvan üzerinde araç kontrolü, hem de uygulama sağlayan, kendi kontrolü olarak görev yapar. Sonuç olarak, biz insanların bu karşılaştırılabilir yara iyileşmesi, pratik bir,-öğrenmek için kolay ve güçlü modeli göstermektedir.

Giriş

Bozulmuş yara iyileşmesi önemli morbidite ve tüm dünyada ölüm sorumludur, bu diyabet ^1,2 olanlar için geçerlidir. İnsanlarda, yara iyileşmesi ³ örtüşen önemli var olduğu, süreçlerin bir süreklilik olduğunu. Hemen sonra yaralama, inflamatuvar süreçleri başlatılır. Inflamatuar hücreler hücre çoğalması, göç ve anjiyogenez süreçleri teşvik faktörler bırakın. Reepitelizasyon ve yeni doku oluşumu sonra bu kollajen gibi matriks proteinlerinin apoptoz ve yeniden organizasyon hem de gerektirir yeniden bir aşaması vardır.

Yara iyileşmesinin karmaşıklığı şu in vitro çoğaltılması ve bu hayvan modellerinin kullanılması gerekmektedir edilemez. Bugüne kadar, yara iyileşmesi çalışmaları iyileşme süreçleri eşdeğer ve insanlar için benzer olmasını sağlamak için, bu tür domuz gibi büyük hayvan modelleri ile sınırlı kalmıştır. Ancak, büyük anima kullanarakbu tür çalışmalar için ls evine zor ve her zaman pratik ⁴ değildir olabilir. Laboratuvar fare kolayca genetik ^5-7 mekanik soruşturma için manipüle edilebilir ekonomik bir hayvan modeli temsil eder. Ancak, fare yaralar daralma ⁸ sürecinde öncelikle nedeniyle, insan için farklı iyileşir. Bu da, kısmen, insanlarda büyük ölçüde eksik olan istemsiz carnosus adlandırılan geniş bir deri altı çizgili kas tabakası kaynaklanmaktadır. Farelerde, bu kas tabakası deriye bağımsız olarak derin kas hareket etmesine olanak sağlar ve cilt aşağıdaki yaralama hızlı daralma sorumludur.

Bu sınırlamayı aşmak için, sıçangil yara iyileşmesi bir splintin kullanımı (Şekil 1) ^8,9 insan yara iyileşmesi çoğaltmak için adapte edilebilir. Bu videoda yeniden epithelializa insan süreçleri yara daralma ortadan kaldırır ve daha yakından yaklaşık olarak atel fare yara modeli göstermektion ve yeni doku oluşumu. Bu modelde panniculus carnosus içeren iki tam kat eksizyon fare orta hat her iki tarafında sırtı, bir oluşturulur. Bir silikon atel yapıştırıcı yardımı ile yara etrafına yerleştirilen ve atel sonra kesilen dikişlerle sabitlenir. Her fare böylece hayvan sayısını azaltarak, bir yara tedavi ve diğer araç kontrol alma ile, kendi kontrol gibi davranır. Topikal uygulama sonrası, şeffaf bir kapalı pansuman uygulanır. Daha da topikal uygulamalar ve / veya yara bölgesinde ^10,11 ölçümü için gerekli zaman sargı kaldırılabilir. De deneylerin tamamlanması, yara kapama, morfolojik mimari ve neovaskülarizasyon derecesi immünohistokimyasal olarak değerlendirilebilir. Bu ekonomik ve model yapmak kolay da diyabet veya diğer patofizyolojilere bağlamında yara iyileşmesi değerlendirmek için kullanılabilir.

Protokol

1. Ateller ve Tıkayıcı Pansuman hazırlanması

1. 0.5 mm kalınlığında silikon kaplama ve kullanım makas veya silikon diskler oluşturmak için bir biyopsi yumruk 10 mm daireler Anahat.
2. Merkezi 10 mm dairenin ortasında bir 5 mm biyopsi yumruk ve bir atel olarak kullanılacak disk gibi-bir "halka" oluşturmak için bir delik oluşturmak için sıkıca bastırın.
3. Bu Opsite ve dairesel pansuman oluşturmak için kullanımı makas gibi şeffaf bir kapalı pansuman 10 mm daireler Anahat.

2. Deney Hayvanları

1. Yapılacak tüm deneyler için Hayvan Etik Kurulu onayı alın.
2. Ticari bir damızlık (örneğin Jackson Laboratories) 8 haftalık (22-26 gram) erkek C57BL/6J fareler kullanın.
3. 21 standart koşullar altında farenin Ol ° C ve yiyecek ve suya serbest erişim ile, 12 saat ışık-karanlık çevrimi.
4. (İsteğe bağlı): Diyabet bir bolus intraperitoneal inje tarafından 6 ila 7 haftalık farelerde neden olabilirDüzenli kan şekeri izleme (AccuChek glucometer) ile teyit hiperglisemi ile 165 mg / kg streptozotosin (sitrat tamponu, pH 4,5) bir ction,. Diyabetik farelerde poliüri olabilir ve böylece yatak ıslaklık ortadan kaldırmak için ve ağırlıkları yakından izlenmelidir daha sık değiştirilmesi gerekebilir.

3. Anestezi ve Operatif Hazırlık

1. % 100 oksijen izofluran% 5 (akış hızı 1 L / dk) ile genel anestezi neden ve izofluran% 1-3 ile anestezi korumak.
2. Bastırılır fare derin pedal refleksleri olun ve yüzüstü pozisyonda fare yerleştirin.
3. Daha da geri ve iki kürek kemikleri arasında 3 cm boyun tabanından kesme makineleri ile kürk kaldırarak ameliyat bölgesi hazırlayın.
4. Tüy dökücü krem ​​hafif bir uygulama 2 dakika daha uzun süre uygulanabilir. Islak gazlı bezlerden tüm krem ​​sağlamak için kullanılabilir ve kalan kürk kaldırılır.
5. Bir ile cilt silinalkol sürüntü ve% 10 iki uygulama povidon-iyot (Betadine) ve fare asmak.

4. Eksizyon ve Yara splintleme

1. Fare yara iyileşme modeli şematik gösterimi Şekil 1'de sunulmuştur.
2. (Şekil 2A-2B) omuz hizasında fare orta hattın her iki tarafında yara için iki adet dairesel model anahat steril bir 4 mm biyopsi yumruk kullanın.
3. Anahat ve istemsiz, carnosus (Şekil 2e) de dahil olmak üzere deri altı doku (Şekil 2c-2d), boyunca devam eden tam kat yara oluşturmak için iris makası ortasında cilt kaldırmak için dişli forseps kullanın ve tüketim dairesel parça doku.
4. Orta hat (Şekil 2f) diğer tarafında yara için işlemi tekrarlayın.
5. Silikon atel her taraftan plastik koruyucu kaplama çıkarın.
6. Cyanoacryla uygulayınte yapıştırıcı (örneğin Super Glue veya Krazy Tutkal) bir silikon atel bir tarafa.
7. Merkezi yara üzerinde atel (Şekil 2g) ve çapa konumlandırma (Şekil 2 saat) sağlamak için kesintiye 6-0 naylon sütür ile atel.
8. Diğer yara üzerindeki splintleme işlemi tekrarlayın.
9. Bu zaman noktasında gerekli ise, bir yara (Şekil 2i) ve diğer araç kontrolü için, test edilecek olan tedavi edici bileşik (100 ul) uygulanır.
10. Şeffaf bir oklüzif sargı (örneğin, OpSite) (Şekil 2J-2k) ile yara kapsamaktadır.
11. Bir cetvel atel altına yerleştirilir ve bir fotomikrograf (2l Şekil) alınır.

6. Ameliyat sonrası Yönetimi

1. Carprofen (5 mg / kg) ameliyat sonrası ağrı kesici için alt deri enjeksiyon yoluyla günde bir kez uygulanır.
2. Ameliyat hayvan ayrı ayrı kafeslerde tutuldu ve ısı m muhafaza edildikten sonraats tamamen iyileşti kadar.
3. Ağrı ve kilo kaybı bulguları için günde iki kez hayvan izleyin. Biz ağrı veya kilo kaybı hiçbir brüt davranış görüntüler görülmektedir.

7. Yara Ölçme ve Tedavi

1. Yara, günlük olarak ölçülebilir.
2. % 5 izofluran gaz (akış hızı 1 L / dk) ile genel anestezi neden, ve sonra fare derin duyu refleksleri sağlamak% 1-3 izofluran kullanılarak bastırılır.
3. Forseps ile yavaşça geri kabuğu tıkayıcı pansuman.
4. Yara çapının ölçülmesi için cerrahi kumpas kullanarak. Biz X, Y ve Z ekseni (Şekil 2m-2o) yanı sıra ileride (Şekil 2 p) için bir fotomikrograf boyunca üç ölçümün ortalama almak.
5. İsteğe bağlı: Şu anda hayvan bir lazer Doppler görüntüleme (Şekil 2q) kullanarak kan perfüzyon için değerlendirilebilir.
6. Tedavi edici bileşik ve araç kontrolü arasında yeniden uygulama performans olabilir,Bu noktada med.
7. Temiz bir şeffaf kapalı pansuman sonra yeniden uygulanır ve tamamen iyileşti kadar hayvanların sıcak tutulur.
8. Not: atel düzgün güvenli değilse yara kolayca sözleşme olacaktır (Şekil 2r).

8. Histolojik Analizi

1. Anestezi aşırı dozda 10 gün sonra fareler Euthanize.
2. Forseps kullanarak ve bir neşter bıçak sıyırın dikkatle atel dikişler çıkarın ve.
3. Çevresinde ve yara alanı altında geniş bir tam eksizyon oluşturmak ve fosfat içinde% 4 paraformaldehit içinde doku inkübe iris makası kullanarak 4 ° C'da gece boyunca (PBS), tamponlu tuzlu su.
4. ° C sonra -80 Ekim bileşik ve dondurularak doku ve yerine dikkatle dabbing aşırı çözeltinin ayrılması 4 ° C de 24 saat daha süreyle PBS çözeltisi içinde% 17 sukroz doku transferi
5. Hematoksilin ve eozin boyama, yara yapısı ve epitel boşluğu görselleştirmek için kullanılabilir. Neovascularisation kılcal sayısı (Von Willebrand faktörü kullanılarak) belirlemek için immünohistokimyasal analizleri ile tespit edilebilir.

Sonuçlar

(Gün 0 çap / gün x çap) - bir yara kapatma kısmının eğri yaranın ortalama çapının hesaplanması ve bir yüzde, yani, 100 gibi sonuçlar ifade ile belirlenir. Bu deneyde, bir tedavi bileşiği (veya taşıyıcı ortam kontrol) yaraya günlük olarak uygulandı. Terapötik bileşim büyük ölçüde hızlandırılmış yara kapatma kısmının (Şekil 3). Bu atel çıkarıldıktan hızlı yara daralma (Şekil 2r) yol ve insanlarda görülen yara iyileşmesinin desen u...

Tartışmalar

Bu deri yara iyileşmesinin deneysel fare modelidir. Bu modelin önemli bir özelliği, insanlarda oluşan işlemi için benzer hale reepitelizasyon ve yeni doku oluşumu meydana gelebilir, böylece yara büzülmesini önlemek için silikon splintlerin kullanılmasıdır. Bu model, çok yönlü ve fizyolojik ve patofizyolojik (örneğin, diyabet) ortamlarda yara iyileşmesi değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu model aynı zamanda ekonomik bir ortamda potansiyel yara iyileşmesi veya anjiyojenez tedavi d...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Press-to-seal silicone sheeting 0.5 mm thick	Invitrogen	P18178	Cut into "donuts" with external diameter of 1cm external, 0.5 cm internal diameter
Biopsy punch 5 mm	Steifel	BC-B1-0500	To outline wound area to be excised
Vannas scissors 8.5 cm curved	World Precision Instruments	501232	For wound incision and excision
Dumonte #7b forceps, 11 cm	World Precision Instruments	501302	To grip skin when creating incision and excising skin
Graefe forceps, serrated 10cm	World Precision Instruments	14142	To help attach silicone splint to skin
Needle holder, smooth jaws, curved, 12.5 cm	World Precision Instruments	14132
Malis forceps, smooth, straight, 12 cm	Codman and Shurtleff, Inc (J&J)	80-1500	To suture the silicon rings to the skin
Ruler, 0.5 mm gradation	n/a
Calipers 0.25 mm gradation	Duckworth and Kent	9-653	To measure wound area
Opsite FlexiFix transparent adhesive film. 10 cm x 1 m	Smith & Nephew	66030570
Rimadyl (Carprofen)	Pfizer	462986