Fare Omurilik Koşullu Gen Manipülasyon için bir Viral Vector Stereotaksik Enjeksiyon

Özet

Viral vektörler hedefli gen manipülasyonu için izin verir. Bu arka boynuzu içine, bir viral vektör stereotaksik enjeksiyon, birincil somatosensoriyel afferentleri ve merkezi sinir sistemi nöronları arasındaki sinaptik bir temas önemli yer kullanılarak, koşullu gen ekspresyonu ya da fare omurilik ablasyonu için bir yöntem göstermektedir.

Özet

Bir viral vektörün intraparankimal enjeksiyon nöronlar ya da merkezi sinir sisteminin belirli bölgelerinde farklı popülasyonlarda şartlı gen manipülasyonu sağlar. Biz fare omurilik dorsal boynuz hedeflenen gen ekspresyonu veya susturulması sağlayan bir stereotaksik enjeksiyon tekniği göstermek. Cerrahi prosedür kısa. Bu hayvan ve omurganın uğramamış motilite hızlı kurtarma sağlayan, tek vertebra laminektomi gerektirir. Eğimli cam kanül ile mikroenjektör düşük hız ve kullanım küçük bir vektör süspansiyon hacmi Kontrollü enjeksiyonu doku lezyonu aza indirmek. Vektör lokal bağışıklık cevabında istihdam virüs içsel özelliklerine bağlıdır; bizim deneyim, bir rekombinant adeno-ilişkili virüs kullanıldığında küçük ve kısa sürelidir. Bu tür gelişmiş yeşil floresan proteini gibi bir raportör gen vektör izlenmesi uzaysal dağılımının kolaylaştırır ve etkinliği ve hücresel specitransfeksiyon özgüllük.

Giriş

Fare koşullu gen manipülasyonu Gelişmiş teknolojiler merkezi sinir sisteminde sinaptik yollar ve fonksiyonel bağlantılarının araştırılması için çok yönlü yaklaşımlar sağlar. Transgenlerin östrojen reseptör ¹ mutasyona uğramış bir ligand-bağlayıcı etki tanıyan bir repressör veya gen transkripsiyon aktivatörü veya tamoksifen gibi çalışması için dizayn edilebilir bir tetrasiklin kontrollü Transaktivatörü, hareket gibi doksisiklin gibi küçük moleküllü etkileyiciler tarafından düzenlenebilir . Tersinmez transgen değişiklik yaygın deoksiribonükleik asit (DNA) rekombinaz tarafından elde edilir. Cre (nedenleri rekombinasyon) ve FLP (flippase rekombinasyon enzim) eksizyonu, inversiyon veya sırasıyla ¹ loxP (crossing x odağı üzerinde, P1) veya Frt (flippase tanınması hedef) siteleri tarafından kuşatılmıştır DNA parçalarının translokasyon katalize. Uygulamalar gen aktivasyonu veya susturulması ve indüklenebilir ribonükleik asit (RNA) girişime dahil ^{2. Bu tür β-galaktosidaz, alkalin fosfataz ya da enzimatik olarak floresan muhabir Koşullu ifade nöronlar etiket ve bunların topikal organizasyon ve bağlantı 3 incelemek için kullanılabilir. Kuzey Amerika (Büyük ölçekli mutajenez projeler http://www.norcomm.org/index.htm ) ve Avrupa ( http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm ) ile fare embriyonik kök hücre klonlarının kütüphaneleri üretiyoruz sonunda tüm fare genomuna kapsayacak koşullu gen hedefleri ve tuzaklar. Bu klonlar elde Fare seçici gen manipülasyonu için nöronların belirli bir nüfus (özel yararlanıcılar veya lokus altında DNA rekombinaz ifade o fare hatları genişleyen bir sayı ile geçilebilir http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php ).}

Ancak, nöronların veya ilgi belirli bölgelerde ayrı nüfus gen manipülasyonu kısıtlayan genetik ilgi nöron topluluğuna özgü bir organizatörü bilinir değilse yalnız hedefleme veya bölgedeki bütün nöronlar tarafından ifade değil elde edilemez ilgi. Spinal kord, deneysel tasarımlar bir veya iki kraniokaudal kesimlerine gen manipülasyonu mekansal kısıtlanması gerekebilir. Cre veya FLP ifade eden bir viral vektör Stereotaksik enjeksiyonu floxed veya flrted alel denilen, DNA parçalarının loxP veya Frt siteleri tarafından çevrili olduğu farelerde omurilik bölgelere gen rekombinasyon sınırlanmasını sağlayan. Bünye DNA düzenlenmesi aksine, hangi Rekombinaz ifade fare ile melezleme hayvanlardan neden olur, bu strateji aynı zamanda gen aktivasyonu veya susturulması üzerinde zamansal kontrol sağlar. Kodlama Viral vektörler floxed veya transgenlerin correspo ifade farelerde gen manipülasyonu bir ters seçeneği sunuyoruz flörtBir nöron spesifik promotör Rekombinaz aşağı nding. Nöronlara afinite ile Çeşitli rekombinant vektörler ⁴ mevcuttur. Yüksek kapasiteli (korkak) adenovirüs, adeno-ilişkili virüs, herpes simpleks virüsü ve lentivirüs yaygın nörotropik vektörler kullanılır. Bir araştırma sorusu için uygun olan virüs seçilmesi deneysel tasarım çok önemli bir parçasıdır. Transgen büyüklüğü, doğum şekli, inflamatuar ve toksik yan etkileri ⁴ düşünülmesi gereken glial hücreleri, enfeksiyon etkinliği, aksine nöronlara enfeksiyon özgüllüğü.

Burada omurilik dorsal boynuz, biz ağrı nörobiyoloji üzerine araştırma koşullu gen regülasyonu için kullandıkları bir tekniktir bir viral vektör stereotaksik enjeksiyon tarif. Dorsal boynuz nosiseptif nöronlar da dahil olmak üzere birincil somatosensoriyel nöronlardan gelen afferent girdi alır. Projeksiyon nöronları onu ifade etmeden önce yerel internöron bilgi işlembeyin ⁵ dorsal boynuz. Biz yapısal olarak aktif sitomegalovirüs organizatörü altında arttırılmıştır yeşil flüoresan protein (eGFP) ifade eden bir nörotropik rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV) ile spinal segmental seviyede L4 dorsal boynuz nöron enfeksiyonu gösterir.

Protokol

Açıklanan cerrahi prosedür Columbia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Ekipman ve Virüs Parçacık Süspansiyon hazırlanması

1. Ekipmanı temizleyin ve dezenfekte edin, cerrahi aletler ve vertebra L1 düzeltmek için kullanılacak V çentik sivri sterilize.
2. Çekin ve konik cam pipetler. Biz, 40 um arasında bir uç çapı olan ve 20 ° 'lik bir açı ile eğimli olan pipetler kullanır. Cam pipetler sterilize.
3. Stereotaksik çerçeve kurma, manipülatör üzerine mikroenjektör enjektör montaj ve kontrol için enjektör bağlayın.
4. Sıkıştırma montaj takımı kullanılarak mikroenjektör için cam pipet bir takın.
5. Mikroenjektör gelen plenseri ve mineral yağ ile şırınga doldurun. Oil Red O (1 - (2,5-dimetil-4-(2,5-dimethylphenylazo) fenilazo)-2-naftol) kendi v artırmak için mineral yağ ile eklenebilirisibility. Piston takın ve ucu tüm yol kadar itin. Dikkatlice bir hava kabarcığı oluşturmaktan kaçının.
6. Bir biyogüvenlik kabine virüs parçacık süspansiyonu hazırlayın. Buz üzerinde donmuş virüs çözülme ve kullanmadan hemen önce, istenen partikül konsantrasyonu tuzlu steril fosfat-tamponlu ile seyreltin.
7. Enjektör üzerindeki yuvasına mikroenjektör yerleştirin.
8. Küçük bir plastik levha üzerine virus süspansiyonu pipetle 5 ul, örneğin Parafilm. Damla içine cam pipet indirin ve mikroenjektör doldurmak için pistonu çekiniz. Tıkanmasını önlemek için pipet ucunda küçük bir hava kabarcığı oluşturun.

2. Laminektomi

1. Tezgah ve dezenfektan ile ısıtma pedi silerek ameliyat alanı hazırlayın.
2. Fare anestetize. Biz izofluran ile inhalasyon anestezi kullanmak (% 3 indüksiyon, bakım sırasında% 2 -3% sırasında).
3. Sırasında kurumasını gözleri korumak için her gözün üzerine yağ koyunişlem.
4. Alt arka fare boyun kürk Tıraş ve böyle klorheksidin veya povidon-iyot ve% 70 etanol gibi bir topikal antiseptik mendil alternatif ile cildi dezenfekte edin. Cerrahi örtü ile aseptik hazırlanmış sitede ayırın ve bupivakain (% 0.25, serum fizyolojik ile sulandırılmış 1:10) ile kesi yeri sızmak.
5. Orta hat (2-3 cm) boyunca göğüs kafesinin kaudal sonunda cilt kesilirken ve omurga kapsayan fasya ayırın.
6. Omurilik vertebral kolon daha postnatal gelişimi sırasında önce büyümesini durdurur Çünkü, spinal segmentin L4 İlk lomber vertebra (L1) altında yatıyor. Vertebra L1 kaburga son çifti tutan vertebra kaudal yer almaktadır. Belirleyin ve küçük spinal kas ve dorsal yüzeyine yapışan ligament kaldırarak vertebra L1 maruz kalmaktadır.
7. Hafif bir Adson forsepsi ile vertebra L1 kaldırın ve tutun. Dorsal Portio kaldırmak için özel bir laminektomi forseps kullanınn vertebra (omurga ve lamina) ve spinal kord teşhir. Omurilik zarar vermekten kaçının.
8. Stereotaksik çerçevesinde ısıtma plakası üzerine fare aktarın. Müteakip çalışma esnasında fare sıcaklığı izleyin.

3. Enjeksiyon

1. V çentik sivri vertebra L1 Fix. Omur solunum sırasında hareket etmez, böylece ani omurga stabilize olmalıdır.
2. Yakın böylece pipet laminektomi sitenin üstünde olduğunu mikroenjektör getir. Eğer pipet çıkmadan virüs süspansiyonu görene kadar pistonu aşağı indirin. Steril pamuk uçlu damlacık çıkarın.
3. Maruz omurilik rostral en kısmında pipet ucu yerleştirin. Merkezi posterior median sulkus üzerinde pipet, daha sonra 500 mikron yanal ucu hareket ettirin. Kablosunu ve delinme duramater yüzeyine ucu indirin veya bir unbeveled cam pipet ile çalışıyorsanız, d ponksiyon için eğimli çelik kanül kullanınura. Omurilik içine cam pipet 300 um uç alçaltın.
4. 200 nl / dak 'lık bir hızla virüs süspansiyonu 1 ul enjekte edilir.
5. Enjeksiyonun sonunda, yavaş yavaş geri çekme pipet önce en az 2 dakika bekleyin.
6. Spinal segmentin L4 viral vektör tam dağılımı elde etmek için maruz omurilik kuyruk kısmının en az 3.5 kadar olan adımları 3.3 tekrarlayın. Iki enjeksiyon siteleri hedef bölgede doku hasarı önlemek için rostral ve L4 segment kaudal bulunmaktadır.

4. Yara Kapatma

1. Yayın omur V çentik kelepçelerden L1 ve stereotaksik çerçeveden fareyi çıkarın.
2. 5.0 vikril ile fasya dikin. Kapalı fasya laminektomi site için kapak sağlar.
3. Naylon sütür veya cerrahi zımba ile cildi kapatın.

5. Postoperatif Bakım

1. Yumuşak, nonparticular yatak ile bir kurtarma kafes fare aktarın. T yerleştirino rahat nefes için yan. Bu yürüyebilen, tamamen uyanık ve içme başlayana kadar hayvan izleyin.
2. Biz, carprofen günlük subkutan enjeksiyon (5.0 mg / kg) ile 72 saat için cerrahi sonrası analjezi sağlar.
3. Ilk olarak 3 gün için günlük olarak kontrol cerrahi sonrası iyileşme izleyin, sonra deney kadar her gün ya da 3 gün haftada tamamlandı.
4. Yara iyileşmesi tamamlandığında, 7 ila 10 gün operasyon sonrası deri sütürler veya zımbaları çıkarın.
5. Deneyin tamamlanmasından sonra, hayvanın Euthanize.

Sonuçlar

Başarılı transfeksiyon getirileri karşı tarafa, ventral boynuz ve dorsal kök gangliyon dorsal boynuz koruyucu enjekte dorsal boynuz (Şekil 1) nöronlar, sağlam gen ekspresyonu.

Şekil 1. Dorsal boynuz nöron transfeksiyonu. (A) L4 omurilik, rAAV-EGFP bir stereotaksik enjeksiyon iki hafta sonra (serotip AAV2 / 8/10 ⁹ genom kopyalarının sol arka boynuzu flüoresan rapo...

Tartışmalar

Stereotaksik vektör ^enjeksiyon, nörodejenerasyon ¹¹ önlenmesi veya tedavisi için yaralanma ^9,10, veya gen tedavisi rejenerasyon sırasında ^6,7 veya optogenetic disseksiyon ^8, akson kılavuz yayılan virüs transsinaptik dayalı bu tür nöronal ağ eşleme gibi uygulamalar için, omurilik nöronları hedefleme sağlar ^12. Viral vektörler somatosensoriyel, motor ve otonomik yolların ^9,10,13-15 çalışma omurilikte gen manipülasyonu içi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Malzeme Adı	Şirket	Katalog Numarası
Spinal taban plakası	David Kopf Instruments	912
Küçük hayvan stereotaksik alet	David Kopf Instruments	900
Fare gaz anestezi kafa tutucu	David Kopf Instruments	923-B
Ayarlanabilir taban bağlar	David Kopf Instruments	982
V çentik sivri	David Kopf Instruments	987
Küçük hayvan sıcaklık kontrol sistemi	David Kopf Instruments	Tcat-2LV
Adson forsepsi	Güzel Bilim Araçları	11006-12
Laminektomi forseps	Güzel Bilim Araçları	11223-20
SYS-Micro4 Controller ile UltraMicroPump (bir)	Dünya Hassas Aletler	UMP3-1
Mikroenjektör, 65RN	Hamilton	7633-01
RN sıkıştırma uydurma, 1 mm	Hamilton	55750-01
Borosilikat cam kapilerleri	Dünya Hassas Aletler	1B100F-4
Microgrinder	Narishige	EG-44