Katyonik lipozomlar üzeri özel siRNA tekrar teslim ile Fare Akciğerler Intersectin-1s uzun süreli suskunluğu. Elektron Mikroskobu ile demonte Etkilerinin Değerlendirilmesi

Özet

Farelerde katyonik liposomes/siRNA/ITSN-1s kompleksleri, 24 gün boyunca her 72 saatte tekrarlanan retroorbital enjeksiyonları, verimli% 75 oranında ITSN-1s mRNA ve protein ekspresyonu azaltarak fare akciğer mikrovasküler için siRNA dubleks teslim. Bu teknik, bir hayvan modelinde yüksek tekrarlanabilir, herhangi bir olumsuz etkisi yoktur ve ölümlerin önler.

Özet

Önceki çalışmalar ITSN-1s (KD _ITSN), akciğer damar geçirgenliği ve endotel hücreleri (EC) hayatta kalma, bağlı apoptotik hücre ölümü, ITSN-1s uzun süreli bir hücre kültür sistemi geliştirilmesinde önemli bir engel düzenleyen dahil bir endositik proteinin bu demonte gösterdi ¹ inhibisyonu. Taşıyıcıları olarak katyonik lipozomlar kullanarak, ITSN-1 geni (siRNA _ITSN) hedef siRNA sistemik yönetimi tarafından fare akciğerlerde ITSN-1s genin susturulması araştırdı. ² üretmek için, tekrarlanan doz güvenli immünojen olmayan, toksik olmayan ve kolay: Katyonik lipozomlar siRNA teslimat için birçok avantaj sunar. Lipozomlar performans ve biyolojik aktivite bir kolesterol ve dimetil dioktadesil amonyum bromür kombinasyonu kullanarak boyutu, ücret, lipid kompozisyonu, istikrar, doz ve uygulama ³ yolu Burada, verimli ve elde edilmiştir fare akciğerlerde belirli KD _ITSN bağlıdır. İntravenöz teslimatsiRNA _ITSN bir / katyonik lipozom kompleksleri geçici ek 3 gün sonra kurtarıldı gün 3 de fare akciğerlerde ITSN-1s protein ve mRNA, yere serdi. Bir tekrarlanabilir güvenli taşıyıcı olarak katyonik lipozomlar yararlanarak, çalışma 24 gün daha uzatıldı. Bu nedenle, taze üretilen kompleksleri ile retro-orbital tedavi çalışma ⁴ boyunca sürekli KD _ITSN uyaran, her 3 gün uygulandı. Çeşitli zaman noktalarında sonrası siRNA _ITSN toplanan Fare dokularda akciğer endotel, kronik KD _ITSN etkilerini değerlendirmek için elektron mikroskobu (EM) analizlerine maruz bırakıldı. Yüksek çözünürlüklü EM görüntüleme bize akciğer vasküler yatakta KDITSN neden olduğu morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için izin ışık mikroskobu ile özellikleri olmayan saptanabilir, (endotel bariyer yani bozulması, caveolae sayısı ve alternatif ulaşım yollarının upregülasyonu azalma). Genel Bu bulgular bir zayıf olmakla birlikte baskı kurduEC fonksiyonu ve akciğer homeostazında ITSN-1s tant rolü, in vivo siRNA-lipozomlar teslim etkinliğini gösteren ise.

Giriş

Çıplak siRNA, hücre zarı nüfuz edemez negatif yüklü olan ve kandaki enzimler, doku ve hücreler tarafından kolayca düşer. Hatta kararlılığını iyileştirmek için son zamanlarda yapısal değişiklikler ile birlikte, tatbikattan sonra, hedef mahallinde siRNA birikim son derece düşüktür ve etkin bir hücre içi araç ⁵ gerektirir. Katyonik lipozomların içine alıcı ve enzimatik degradasyona ⁶ nükleik asitler koruyarak hücre içine DNA / RNA 'nın büyük parça aktarmak için potansiyeli olan güvenli bir nükleik asit taşıyıcı olarak ortaya çıkmıştır. Ayrıca, katyonik lipozomlar ve böylece kendiliğinden hücreleri ² gen transferi teşvik, DNA / RNA ile etkileşime girer. Daha yakın zamanlarda lipozomlar, aşılar ve düşük molekül ağırlığına sahip ilaçların ⁷ teslim etmek için uygulanmıştır. Plazmid mikroRNA-7-ifade lipozomal akciğer kanser hücrelerinin ⁸ epidermal büyüme faktörü reseptör tirozin kinaz inhibitörü direnç üstesinden gelir. Hedeflerkenkompleksleri endotel bariyer çapraz ve interstisyumda ⁹ için extravasate olası değildir, çünkü, damar endotelyumu intravenöz yoldan gereklidir. Diğer organlara kıyasla, akciğer mikrovasküler gelen ECS büyük alımı ve heyecanla lenf düğümleri ve Peyer en yamalar ⁹ takip katyonik lipozom ve DNA / RNA kompleksleri, içselleştirmek. Retroorbital veya kuyruk ven enjeksiyon yoluyla siRNA kemirgen modellerinde intravenöz teslim hatta 50 mg / kg ¹⁰ gibi yüksek konsantrasyonlarda, zararsız kanıtlanmıştır. Literatürde katyonik lipozomlar kompozisyonu lipid formülasyonu ve eşit molar oranı ^{11, 12} esas olarak farklılık gösterir. , Aşı ya da anti-tümör tedavileri ^13-15 teslim proteinlerin down-regulation/over-expression hedef olup, in vivo gen aktarımı için katyonik lipozomlar kullanarak potansiyel uygulamaların geniş bir dizi bulunmaktadır. Hatırlamak önemlidirDNA / RNA-hücre membran etkileşimi verimini oluşturulan kompleksleri ve membran lipidleri arasındaki kuplajı şeklinde düzenlenir olmasıdır. Bu, hedeflenen hücre membranı profillerine lipid bileşimin dikiş belirli bir hücre tipi ⁶ transfeksiyon yüksek oranda faydalı ve sonuç olabileceğini düşündürmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Katyonik lipozomlar hazırlanması

1. Lipososmes hazırlanması için kullanılmak üzere temiz bir yuvarlak-tabanlı bir şişeye otoklav.
2. Stok çözümleri hazırlayın:
   1. - Küçük bir cam şişe kullanarak 10 ml kloroform içinde dimetil dioktadesil amonyum bromür (DOAB) 200 mg çözülür.
   2. - Küçük bir cam şişe kullanılarak 10 ml kloroform içinde kolesterol 200 mg çözülür.
   3. - Hazırlamak ve 100 ml RNA / DNA-az serbest damıtılmış su içinde% 5 glukoz otoklavda sterilize edilmesi için.
3. Kloroform ile yuvarlak-tabanlı bir şişeye durulayın. Şişesi, girdap için 5-10 ml ekleyin ve birkaç dakika bekletin. Her zaman alüminyum folyo ile kaplı şişesi tutun. Şişesi kloroform boşaltın.
4. Lipozomların hazırlanması:
   1. - Yuvarlak-tabanlı bir şişeye DOAB stok çözeltisi 315 ul ekleyin.
   2. - Şişeye kolesterol stok çözeltisinden 200 ul ekleyin.
   3. - Bir şişeye kloroform içinde 9.5 mlnd girdap tarafından karıştırın.
5. 37 rotavaporda ayarlayın ° C, 100 dakikadaki dönüş (rpm) veya daha fazla (100-120 rpm). Rotavaporda doğru bir şekilde takılmış olan bir emiş borusu ile birlikte bir su vakum pompası kontrol bağlı olmalıdır.
6. Argon gazı tank ve rotavaporda bağlayın.
7. Rotavaporda için şişesi takın ve su banyosu içinde indirmeden önce en uygun ayarları yapın. Saat yönünün tersine çevirerek tamamen argon için ilk vanasını açın. Her zaman önce bu valf açıp kapatın. Ikinci valf şişeye üfleme argon basıncı kontrol eder. Basıncı her zaman nazik olmalıdır.
8. Tamamen sular altında olmadan su dokunun ve hız açmak için şişesi için yeterli, su banyosunda rotavaporda indirin.
9. 10 dk, tüm kloroform buharlaşır kadar bekleyin. Daha sonra makineyi durdurun.
10. Rotavaporda hızı ve argon tankı vanaları kapatın. Şimdi şişenin çıkarılmalıdır.
11. Th% 5 glikoz 2 mle şişesi lipidler çözmek için.
12. Iyice tüm lipidler çözmek için 1 ml pipet kullanarak balonun alt Scratch. Gerekirse çizilmemesi sonra, ikinci bir ucu, 1 ml ucundan balonun içine kalan lipid çıkarın.
13. Yavaş yavaş (15 rpm) balonun Vorteks 42 ° C su banyosu içinde, elde edilen çözelti inkübe edin.
14. Soğuk su ile sonikatör KDV doldurun. Zar zor su dokunmadan kaldırdı şişesi ve alt ile en az 20-30 dakika için çözüm sonikasyon.
15. Suya yuvarlak tabanlı, bu kez, sıfır hızda 42 ° C'de 20 dakika C için rotavaporda su banyosunda şişeye ısıtın.
16. Bir 0.47 mikron ve daha sonra, 0.22 mikronluk şırınga filtreleri aracılığıyla lipozomlar filtre.
17. Küçük bir ekstrüzyon presini kullanarak, tek lamelli veziküller lipozom homojen bir popülasyon elde etmek için bir 50 nm zar içinden, lipozomların filtre.
18. Bir Eppendorf tüp lipozomlar aktarın ve buz üzerine yerleştirin.

2. Lipozomlar hazırlayın: siRNA-ITSN-1 Kompleksleri

1. 2 mg / ml bir son konsantrasyona kadar 20 mM HEPES ve 150 mM sodyum klorür, pH 7.4 ihtiva eden tampon içinde siRNA ile ilgili hedef fare siRNA _ITSN yeniden süspanse edin. Karıştırmadan önce buz üzerinde tutun.
2. 2 ug RNA (veya 400 nmol lipozomlar: 100 ug siRNA _ITSN) 8 nmol lipozomlar oranında siRNA _ITSN kompleksleri: lipozomlar hazırlayın. Bu çalışmada, bir RNA / DNA-az serbest Eppendorf tüpü kullanılarak taze hazırlanmış lipozomlar 100 ul stok çözeltisi (50 uM), ikinci siRNA _ITSN 50 ul eklendi. Karışım 150 ul maksimum bir zamanda fare bilateral ve retro-orbital enjekte olabilir, çünkü siRNA _ITSN konsantrasyonu çok önemli olduğu unutulmamalıdır.
3. Fareler enjekte beklerken buz karışımı tutun.

3. Fare Retro-yörünge Ven Enjeksiyon (Göz Soket İç Açı)

jove_content "> Tüm fare deneyleri Rush Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu kurallarına uygun olarak onaylanmış ve yapıldı.

1. 50 mg / kg vücut ağırlığı ketamin ve 5 mg / kg vücut ağırlığı ksilazin (ticari olarak temin edilebilen karışımı) intraperitonal enjeksiyonu ile fare anestezisi. Hayvanın yaşına ve ağırlığına bağlı olarak, anestezik madde hacmi ile konsantrasyonunun ayarlayın. Çalışmada kullanılan farelerin farenin 6-8 haftalık erkek fareler CD1, ve 25 gram civarında tartın. Şırınga, iğne takılı olan tüberkülin 1 ml türüdür.
2. Tek elle fare kulakları tutun ve gözün iç açısı ortaya çıkarmak için bir yan üzerinde fare kısın. Plika semilunaris için medial Amaç, göz küresi dokunmaktan kaçının.
3. Her üç eksende 45 derece açıda karışımı içeren şırınganın tutan gözün lakrimal karünkül Yaklaşım.
4. Yavaşça karışımı enjekte ve enjekte tarafı ile kurtarmak için fareyi sağlar. Bir büyük bir sıvıiğne yerde damlacık formları, şırınga geri iğne, emme damlacık geri çekin ve yeniden deneyin. Tekrarlanan enjeksiyonlar iyi mükemmel kurtarma sağlamak için, gözleri alternatif tarafından yapılır. Eğer emin değilseniz, bu teknik mavi boya (50 ul, metanol içinde% 0.5 kristal viyole) enjekte ve mavi damar gözlemlemek için fareyi akciğerler açığa tarafından kontrol edilebilir.
5. Bu çalışmada farelerin ölüm ya da yan etkisi olmadan 3 hafta boyunca her ^3. gün enjekte edildi.

4. Biyokimyasal Araştırmalar Fare Akciğer Perfüzyon ve Doku Koleksiyon

0. 1.5 mL / dk 'da çalıştırmak için peristaltik pompa ayarlayın.
1. Ventilatör, çalışma masası, alet, steril pamuklu, q-ipuçları, dizeleri, bardak, distile su, Hank dengeli tuz, izleyici: ayar hazırlayın.
2. Anestezik karışımı (100 mg / kg vücut ağırlığı ve ketamin 10 mg / kg vücut ağırlığı ksilazin) intraperitonal enjeksiyonu ile fare anestezisi.
3. Boyun düzeyinde, tükürük bezleri çıkarın ve trakea ortaya.
4. Laparotomi, tüketim diyafram ile başlayın, ve akciğer ve kalp açığa, torakotomi ile izleyin.
5. Timus çıkarın.
6. Daha iyi doğruluk için ışık mikroskobu kullanarak, pulmoner arter kateterize.
7. Trakeostomi yapın ve trakeostomaya kullanarak fare entübe. 150 vuruş / dak ve 150 ul atım hacmi bir oranı ventilatör ayarlayın.
8. Çıkış olarak, sol atrium açın.
9. Peristaltik pompa ve Hank çözeltisi kullanarak, 5 dakika boyunca kan serbest fare akciğer damar serpmek 37 ° C'de ısıtıldı
10. Aynı akış hızında 10 dakika daha izleyici (8 nm altın albümin ¹⁶⁾ serpmek.
11. Hank solüsyonu ile 5 dakika akciğer perfüzyon ile ilişkisiz izleyici yıkayın.
12. 0.1 BORU 10 dk% 4 perfüzyon (ağırlık / hacim) formaldehit,% 2.5 glutaraldehit ve% 1 tannik asit ile akciğerlerin yerinde tespitte ile izleyintampon maddesi, pH 7.2.
13. Akciğer toplayın, aşırı doku kaldırmak küçük bloklar (3/3 mm) kesilmiş ve sabitleştirici karışımı 2 ml içeren bir etiketli sintilasyon flakon koyun.

Fareler işlem sırasında tamamen anestezi sona erecek.

5. EM için Fare Akciğer Doku İşleme

1. Stok çözümleri hazırlayın: 1% Palade OsO _4, veronal asetat ve Kellenberger tampon.
   1. -% 1 Palade-ogzo ₄ tampon içerir: asetat, 1 ml veronal stoku, 1,25 ml% 4 OsO _4, en son hacim, 5 ml ile 1 ml 0.1 N hidroklorik asit ve damıtılmış su.
   2. - Asetat veronal stok çözeltisi, 1.15 g sodyum asetat andydrous ve damıtılmış su, 100 ml barbital 2.94 g eritilmesi ile elde edilir.
   3. -Kellenberger ve çözelti asetat veronal stok 2 ml 0.1 N hidroklorik asit, 0.05 gr uranil asetat 2.8 ml ve 5.1 ml'dedamıtılmış su, pH değeri = 6.
2. Kısaca 0.1 M sodyum kakodilat tamponu, pH = 7,4, 3 kez akciğer blokları yıkayın.
3. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca 0.1 PIPES tampon, pH 7.2 'de% 4 (ağırlık / hacim) formaldehitle numuneler saptamak,% 2.5 glutaraldehid.
4. Karanlıkta, buz üzerinde, kaputu 1 saat için 1% Palade-Osmium ile Post-düzeltmek.
5. Kellenberger tamponu ile bir kez yıkayın.
6. Oda sıcaklığında, gece boyunca 2 saat için Kellenberger ve tampon örnekleri inkübe edin.
7. % 50 etanol içinde bir kez yıkayın.
8. 70%, 95%, daha sonra 2 x 15 dakika,% 100 etanol: etanol kademeli serisi, 5 dakika / her biri kurutmak.
9. 100% propilen oksit, 2 x 15 dakika geçin.
10. Propilen oksit çıkarın ve oda sıcaklığında, bir tekerlek üzerinde dönen, bir gece inkübe, en az% 50 propilen oksit ve en az% 50 EPON 812 karışımı ekleyin.
11. Ertesi sabah, karışım çıkarın ve en az tekerlek üzerinde 4-5 saat taze EPON 812, ekleyin.
12. Dolu iki konik kalıpları kullanarak,taze% 100 EPON 812 ile yarım, seçilen örnekler ekleyebilir ve kenarlarına yerleştirin.
13. 60 ° C sıcaklıkta inkübatör kümesine kalıp hareket ve 48-72 saat tedavi sağlar.
14. Polimerize zaman, kesitli (kalın 60-70 nm) ince olmak blokları gönderin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

ITSN-1s protein ve mRNA düzeyleri Western Blot ve ⁴ gibi geleneksel ve kantitatif PCR ile siRNA _ITSN doğumdan sonra birkaç zaman noktalarında takip edildi. _ITSN siRNA ile muamele edilmiş fare akciğerlerinde ITSN-1s protein ve mRNA seviyeleri 21 gün boyunca ITSN-1s sürekli demonte döneminde kontrol referans ile yaklaşık% 75 daha düşüktü. ITSN-1s olmadan, Dynamin-2, plazma zarından caveolae ayrılması içinde ITSN-1s ve önemli bir oyuncu önemli bir etkileşim ortağı ve...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Biz uzun vadeli özel siRNA / lipozom kompleksleri tekrar intravenöz (24 gün boyunca her 72 saat,) ile in vivo ITSN-1s yıkmak için bu yöntem geliştirdi diğerleri ⁹ ve bize ^{1, 18} tarafından yayınlanan önceki çalışmalara göre. Bu deneysel yaklaşım, verimli güvenli bir şekilde ve tekrar tekrar kullanılabilir ve kolayca akciğer endotel ve pulmoner dengesinin ilgi herhangi bir protein kodlayan bir genin katılımı incelemek için uzatılabilir. Tekrar siRNA / lipozomlar tes...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB)	Sigma-Aldrich	D2779
LiposoFast stabilizer (mini-extruder)	Avestin Inc.	LF-STB
Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore	Avestin Inc.	LFM-50
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C-8667
Chloroform	Mallinckrodt Chemicals	4432-04
Hank's balanced salts	Sigma-Aldrich	H1387
Round-bottom flask	Fisher Scientific	FHB-275-030X
Mouse siRNAITSN - on target	Dharmacon/ThermoScientific	J-046912-11
Peristaltic pump	Ismatec	REGLO-CDF digital with RHOO pump head
Ventilator	Hugo Sachs Electronik	NA
Barbital	Sigma-Aldrich	B-0500
Uranyl acetate	EM Sciences	22400
Epon812	EM Sciences	Discontinued by the manufacturer
Propylene oxide	EM Sciences	20400
Embedding molds	EM Sciences	69923-05
Tannic acid	EM Sciences	21710
8 nm gold-albumin tracer		Prepared in the laboratory as in16
Comments
Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
Modified siRNA, in vivo
Part of IDEX corp.
D-79232 March, Germany
Replaced with Embed812, cat. # 14120