GST-His saflaştırma: Tam boy Saflaştırılmış Proteinler Verim iki aşamalı bir saflaştırma protokolü Affinity

Özet

Bu protokol, eşsiz bir şekilde bölünebilir GST-tag ve küçük bir His-tag birleştirilmesiyle yeniden birleştirici proteinlerin saflaştırılmasını sağlayan bir yüksek verimli ve düşük maliyetli, küçük ölçekli protein saflaştırma yöntemi göstermektedir.

Özet

In vitro protein biyokimyasal karakterizasyonu için in Enzymology anahtar tahliller, ilgi konusu saflaştırılmış proteinin yüksek konsantrasyonlarını gerektirmektedir. Protein saflaştırma protokolleri etkinlik, basitlik ve maliyet etkinliğini ^1. birleştirmek gerekir. Burada, bir N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST) ve her ikisi de ^{2,3-kaynaşmış,} bir C-terminal 10xHis etiketi ⁴ dayanan rekombinant protein için yeni bir küçük ölçekli bir afinite arıtma sistemi gibi GST-His yöntemi tarif ilgilenilen proteine. İkinci yapı, protein ekspresyonu için Sf9 ⁵ enfekte olmuş hücrelerin enfeksiyonu için, baculovirüsler oluşturmak için kullanılır. KDV arıtma verimliliği sağlamak için hizmet veren, oldukça uzun bir etiket (29 kDa) 'dir. Bununla birlikte, proteinin fizyolojik özelliklerini etkileyebilir. Bu nedenle, bu daha sonra ⁶ PreScisson enzim kullanılarak protein kesilir. , En fazla saflık sağlamak ve bölünmüş GST çıkarmak için, biznispeten küçük bir His-Tag göre ikinci bir afinite saflaştırma adımı ilave edildi. Önemli olarak, bizim teknik bu nedenle, bozulmuş proteinlerin çıkması ve etkili bir araçtır, proteinin, iki ucunu yan iki farklı etiketler dayanan, tam uzunluklu proteinlerin zenginleştirir. Burada sunulan yöntem, FPLC gibi pahalı bir enstrümantal kurulum, gerektirmez. Ayrıca, ısı şoku proteini kirleri ve nükleik asitler kontamine kaldırmaya nukleaz tedavisi kaldırmak için _MgCl2 ve ATP yıkar dahil. Özet olarak, yandan kuşatan iki farklı etiketler kombinasyonu N-ve C-terminal ve etiketler biri kapalı parçalama yeteneği, ilgi konusu bir yüksek derecede arıtılmış ve tam-boy proteinin kurtarma garanti eder.

Giriş

Rekombinant proteinlerin saflaştırılması biyokimya temel soruları için önemlidir. Iyon değişim kromatografisi ve boyut dışlama kromatografisi gibi protein saflaştırma geleneksel yollar olduğu, örneğin izoelektrik noktası ve ücret ya da boyutu gibi hedef proteinin fiziksel özelliklerine dayanır. Bu ikinci protein özellikleri önemli ölçüde geleneksel protein saflaştırma stratejilerinde kirletici proteinleri şansını arttırır proteinlerin çeşitli tarafından paylaşılır. Bu sorun, zaman alıcı, birden çok arıtma sütun kullanımı ile engellenebilecektir. Aynı zamanda, ikinci kromatografi yöntemler pahalı deney düzeneği gerektirir. Olguların çoğunda etiket ilgi protein benzersiz olacak gibi afinite etiketi arıtma güçlü, hedef-özgüllük artar. Son zamanlarda yapılan araştırmalarda, Flag-ya da HA-afinite saflaştırma yaygın olarak kullanılmaktadır.

Mevcut rec aksineTek etiketleri kullanıldığı ombinant protein saflaştırma protokolleri, iki etiketlerin benzersiz bir bileşimini kurulmuştur. Önerilen yöntem, miktar ve istenen proteinin saflığı arasında optimum bir oranı için, ilgi konusu proteinin C-terminalinde N-terminalinde bir His-tag, bir GST-füzyon etiketinin içerir. GST glutatiyon Sefaroz taneleri üzerinde saflaştırma için yüksek verimli bir uzun etiketi (29 kDa) 'dir. Ayrıca, KDV kullanarak bizim yöntem ¹ maliyet etkinliğini garanti. (Sadece iki amino asit ilavesi ile sonuçlanan tanıma sekansı LeuGluValLeuPheGln / GlyPro ile) PreScisson enzimi ile GST kapalı yarmak için bir olasılık, bir çok avantajı vardır, örneğin, bu strateji allosterik bir engel nedeniyle fizyolojik protein fonksiyonlarının değişiklikler önler. Diğer protein ucuna kaynaşmış His-tag, küçük bölünmüş GST yıkandıktan, hem de bozulmuş proteinlerin ve diğer protein saflığını daha da arttırmak için ikinci bir arıtma adımında karşılık vermektedir kirleticiler. His-saflaştırma adımı kolonu (TALON reçinesi) için GST geçiş Ek olarak, iletişim kuralı, bir diyaliz adımı gerektirmez. Bu tür saflaştırma işlemlerinde yaygın kirletici maddeler ısı şok proteinlerinin (HSP) 'dir. _MgCI2 ve ATP ile bir kuluçkalama adımının eklenmesi bu kirleticilerin çıkarılması (Şekil 1) sağlar.

Hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) ve Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC), ilgi konusu saflaştırılmış proteinin yüksek verim elde etmek için pahalı enstrümantasyon bağlıdır sıradan yöntemlerdir. Burada mevcut toplu arıtma protokolü, aksine, manuel ve pahalı bir enstrümantal kurulum gerektirmez. Protein yüksek verim protokolünü ölçeklendirme ulaşılabilir. Aynı zamanda, toplu arıtma protokolü ile, elüsyon hacmi FPLC ve HPLC ile verilmezse protein konsantrasyonu arttırmak için ayarlanabilir.

ntent "> Aynı zamanda, toplu GST-His arıtma protokolü ile, ~ 10-300 kDa bir boyut aralığı ile proteinler saflaştırılabilir. en büyük avantajlarından biri, aynı anda birkaç proteinleri saflaştırmak gerçeği ile verilir Örneğin, bir vahşi tip ve mutant protein hem de. sunulan protokol başarı sadece, ilgi konusu proteinin ekspresyon seviyesi ve çözünürlüğüne bağlıdır.

Protokol

1.. Rekombinan bakulovirüslerin üretimi

Bakulovirüsler esas olarak sadece hafif bir değişiklik ile, üreticinin protokolüne uygun olarak Invitrogen'in Bac-to-Bac Baculovirus Expression System kullanılarak üretilir:

1. Bir modifiye pFastBac1 vektörü (Gibco, yaşam) GST ve O'nun etiketleri (Şekil 2) içeren oluşturuldu. PET-52b (+) vektörü (Novagen) multiklonlama bölgesine (MCS), bir 10xHis-etiketi ihtiva eden, pFastBac1-Strep-10xHis oluşturmak için bir pFastBac1 vektörünün MCS sokulmuştur. PET-52b (+) MCS dizisi 5 'ucunda bir BglII kısıtlama sitesi' ucu ve 3 'bölgesinde bir Hind III sınırlandırma sitesi' ucuna eklenmesi, Xbal ve HBLP kısıtlayıcı siteleri arasında amplifiye PCR oldu. PCR ürünü daha sonra BamHI ve BglII kısıtlama dizilerin uyumluluk kullanılarak BamHI ve Hindlll kısıtlama pFastBac1 sitesi arasında klonlandı. Amaç ifade sağlayan bir pFastBac1 oluşturmak için olduğu içinve streptavidin-10xHis etiketleri ile rekombinant protein, pET-52b (+) BamHI kısıtlama alanı MCS sekansı kullanılmadı. Ayrıca, Xbal kısıtlama alanı zaten pFastBac1 bir MCS ve pET-52b MCS ile eklenen, bu (+) 'de siteler arasında meydana gelen kısıtlama sitelerinin fazlalık önlemek için kullanılmamıştır. PreScisson Proteaz tanıma sitesi (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) ile GST kodlayıcı sekans daha sonra pFastBac1-Strep-10xHis içine sokulmuştur. PGEX-6P-2 (GE Healthcare) için GST cDNA sekansı PCR sırasıyla 5 de, Ncol ve Kpnl sınırlandırma bölgelerini içeren bir primer 've 3' ekstremite ile büyütülmüştür. Ncol mevkisi bir başlangıç ​​kodonu ve buna ek olarak değil, aynı zamanda bir GST Alanin sağlar. PCR ürünü daha sonra streptavidin-etiketinin silinmesi ile sonuçlanan, Ncol ve Kpnl kısıtlama siteleri arasında pFastBac1-Strep-10xHis klonlanmıştır. Bu şekilde elde edilen yeni bir füzyon vektörü pFastBac1-GST-10xHis seçildi.
2. Pr için cDNA kodlama CloneGST (N-terminal) ve His-etiketi (C-ucu) arasındaki pFastBac-GST-10xHis vektörü içine ilgi otein. C-terminal His-tag ile füzyon izin vermek için cDNA durdurma kodonunu ortadan kaldırmak için dikkat edin.
3. E. Transform (Adım 1.2 'de elde edilmiştir) rekombinant pFastBac ile coli DH10Bac bacmid üretir. Koloniler Bluo-gal ve IPTG (10 ug / ml tetrasiklin, 50 ug / ml kanamisin, 7 ug / ml gentamisin, 100 ug / ml Bluo-ihtiva-eden seçme plakaları üzerinde 30 ° C 'de 37 ° C ve birkaç saat gece boyunca büyümeye izin verin Gal, 40 ug / ml IPTG).
4. Seçim ve beyaz fenotip onaylamak için seçme plakaları üzerinde (adım 1.3) 2 beyaz koloniler restreak.
5. 10 ug / ml tetrasiklin, 50 ug / ml kanamisin, 10 ug / ml gentamisin aşama 1.4 'dan iki beyaz koloniler ile ve bunların 37 ° C de bir gece boyunca çalkalama altında (250 rpm) büyümesine izin ihtiva eden LB içinde 2 ml inoküle
6. Bacmid DNA'yı saflaştırmak amacıyla, aşama 1.5 bakterileri peletçözeltisi 300 ul I hücreleri tekrar süspansiyon ve çözelti II 300 ul (Qiagen'den Maksiprep kit) ekleyin. , Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe 3 M KOAc, pH 5.5 içinde 300 ul ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edilir. 4 ° C, 10 dakika boyunca yüksek hızda örnekleri santrifüj. Yüzer için izopropanol 800 ul eklenir ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edilir. 4 ° C'de 15 dakika boyunca santrifüj örnekleri ve% 70 etanol içinde 500 ul ile pelet yıkayın. Pelet kuruması ve Tris-EDTA pH 8.0, 40 ul steril koşullar altında yeniden süspanse edin. Bacmid DNA, 4 ° C 'de muhafaza edilmelidir
7. Üreticinin protokolünde tarif edildiği gibi baculovirüsler oluşturmak. Bakulovirüsler ışıksız bir ortamda 4 ° C'de saklanabilir.

2. Rekombinant Protein Expression

1. Arıtma için en verimli bakülovirüsü seçmek ve protein ifade zirve ulaşıldığında ne zaman izlemek için bir mini-enfeksiyon deneyi a gerçekleştirmeks aşağıdaki gibidir: 2 Sf9 x 10 ⁷ bakulovirüsün 133 ul (1/150) ile (% 10 FBS ve% 1 P / S ile tamamlanır) Grace ortam içinde 27 ° C 'de kültür hücreleri enfekte Infect. 0, 24, 48, 1.5 ml'lik alikotları toplamak ve 72 saat post-enfeksiyon. Pelet hücreleri ve anti-tag antikoru kullanılarak western blotting ile, ilgi konusu proteinin ekspresyonu düzeyini analiz.
2. Virüs ve ortam arasında 1/150 oranı ile bir ortamın 500 ml, ml başına 1.0 x 10 ⁶ Sf9 hücrelerini içeren bir değer değiştirici enfekte etmek için aşama 2.1 'den en verimli bakulovirüs kullanın. Enfekte olan hücreler, 27 ° C 'de süspansiyon içinde büyümeye ve en yüksek protein ekspresyon (yukarıdaki aşama 2.1' de tespit edildiği üzere) ulaşıldığında hücreleri hasat olsun. Tanelenmiş hücreler daha fazla kullanıma kadar -80 ° C'de muhafaza edilebilir.

3. Çözünür hücre lisatı hazırlanması

Aşağıdaki kuluçka adımlarının tüm hafif dönme altında 4 ° C'de gerçekleştirilmektedir.

1. Lyse SGST bağlayıcı tampon (150 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 0.05 Triton-X-100, 1 mM 250 mM NaCI nihai konsantrasyon için PBS1X de DTT ve proteaz inhibitör ~ 20 ml ilgi proteini eksprese eden hücreler f9 kokteyli (Roche). bir buzlu su banyosu içinde, bir Dounce homojenleştirici, sonikasyon 3x 30 saniye her biri (% 70 üretim) ile çözeltinin Dounce 20x ve 20x yeniden Dounce.
2. (İsteğe bağlı). DNA ya da RNA kontaminasyonu çıkarmak için 4 ° C'de 30 dakika boyunca 1 mM _MgCI2 ve ⁷ nükleaz (2.5 U / ml) benzonaz toplam hücre lizatı inkübe edin.
3. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 18,000 rpm'de santrifüje Süpernatant tutun.
4. (İsteğe bağlı). Santrifüj süpernatan tekrar 4 ° C'de 18,000 rpm'de 30 dakika boyunca berrak lizat çözünür alır. Tıkanmasını önlemek için, 0.2 ya da 0.45 um'lik bir filtreden süpernatantı geçirir.

4. GST Boncuk Protein bağlanması

1. GST boncuk 1 ml Çözünür hücre lisatı inkübe (iki kez yıkanmışGST 10 mi yumuşak döndürülerek 4 ° C'de 1 saat boyunca tamponu) bağlayıcı.

Yorum: Kuluçka süresi, proteinin stabilite ve bağlanma verimliliği göre optimize edilmesi gerekmektedir.

2. Hızlı 700 rpm'de spin ve ilişkisiz proteinleri içeren süpernatant kaldırmak (bu daha fazla analiz için muhafaza edilebilir). GST Yıkama tamponu ile GST-bağlı protein (Şekil 3B, şerit 1) yıkayın (GST 350 mM NaCl finali ile bağlama tamponu).
3. Adımı tekrarlayın 4.2 2x. Son yıkamadan olarak, mümkün olduğu kadar supernatant çıkarın.
4. Isı-şok proteinleri ⁸ arasında spesifik olmayan bağlanmanın olmaması için 4 ° C'de 1 saat boyunca (10 mi GST bağlama tamponu içinde) 5 mM ATP ve 15 mM _MgCl2 ile boncuk inkübe edin. GST yıkama tamponu ile boncuk üç kez yıkayın.

5. GST PreScisson Dilinim

1. GST boncuk santrifüj, süpernatant kaldırmak ve P5 buf ile GST boncuk yıkayınfer (50 mM NaHPO ₄ pH 7.0, 500 mM NaCl,% 10 gliserol,% 0.05 Triton-X-100, 5 mM imidazol).
2. 3 saat için gece boyunca 4 ° C den P5 tamponu PreScisson enzimi ile GST-boncuk inkübe (100 ul fraksiyon olarak GST boncuk bölün ve P5 tampon 100 ul seyreltilmiş enzim, 4-8 adet (2-4 ul) ekleyin.)

Yorum: PreScisson aşamasının Kuluçka süresi molekül ağırlığı hem de protein kararlılığına göre optimize edilmesi gerekmektedir. Bozunma görülmektedir, bu, bir gece boyunca inkübasyon süresi, 2 saat içinde en az yerine göre azaltılabilir.

3. Hızlı spin ve süpernatant toplamak. P5 100 ul ekleyerek sonra bu adımı iki kez tekrarlayın boncuklara tampon ve tüm kısımlar (Şekil 3B, şerit 2) havuz.

Yorum: Kalan boncuklar bölünme etkinliğinin analizi için kullanılabilir (Şekil 3B , şerit 3). Genellikle, proteinin% 70-80 bölünmektedir.

6. Protein bağlayıcı TALON Metal Afinite Reçine'ye

1. 1 ml'lik fraksiyonlar halinde 3 yukarıdan elüsyon bölün ve döndürme altında 1 saat boyunca (P5 tamponu ile iki kez yıkanmış) 100 ul Talon metal afinite reçinesi ile kuru boncuk her inkübe edin.

Yorum: Bir çok paylarda elüsyon bölme bağlayıcı / yıkama verimliliği artırır.

2. P30 tamponu (30 mM imidazol, son konsantrasyon ile P5 tamponu) ile reçine 5 dakika yıkanır.
3. Adımı 6.2 2x tekrarlayın ve tek bir tüp içinde boncuk havuzu. Son yıkamadan önce, mümkün olduğu kadar supernatant çıkarın.

Yorum: Bu TALON bağlı numune (Şekil 3B, şerit 4) karşılık gelmektedir.

7. Saflaştırılmış Protein elüsyonu

1. P5 ile birlikte dönüş altında 5 dakika için protein bağlı TALON reçine inkübe00 tampon maddesi (500 mM imidazol, son konsantrasyon ile P5 tamponu). Tampon ve 01:01 h / h arasında boncuklar arasında bir oranı kullanarak (Eğer kuru boncuk 200 ul almıştı Örneğin, siz P500 200 ul eklemek gerekir). Bu adımı iki kez tekrarlayın ve ayrı ayrı her akıtılan kısmını tutmak (; Şekil 3B, 5-7 kuşak), yıkama 1 (E1) adında yıkama 2 (E2 ve elüsyon 3 (E3)).

Yorum: Kalan boncuk elüsyon verimi (Şekil 3B, şerit 8) analizi için kullanılabilir. Tipik haliyle, proteinin% 60-80 toplam akıtılır.

2. Coomassie mavisi (Şekil 3B) veya görüntüleme için SYPRO protein boyası ile bir SDS-PAGE ve leke üzerinde standart BSA konsantrasyonu her fraksiyonun yaklaşık 20-40 ul yükleme göre saflaştırılmış protein miktarını ve kalitesini analiz edin.

Yorum: İlgilenilen proteini aynı zamanda bir uçtan bir uca tespit edilebiliranti-GST ve anti-His antikorları (Şekil 3C) kullanılarak saflaştırma prosedürü hayatları boyunca.

8. Saflaştırılmış proteinin depolanması

1. 4 ° C sıcaklıkta, uygun bir saklama tamponu ile saflaştırılmış proteinin (örneğin 20 mM Tris asetat pH 8.0, 200 mM KAc,% 10 gliserol, 1 mM EDTA, 0.5 mM DTT) Dialyze Bu, diyaliz sırasında, saflaştırılmış proteinin çökeltilmesi için kontrol etmek önemlidir. Genellikle çalkalama döndürme altında 4 ° C'de 1 saat boyunca 2x dialyze.
2. Saflaştırılmış protein (10-20 ul) az miktar yapın ve 30 dakika boyunca kuru buz üzerinde dondurma. -80 ° C'de alikotları saklamak ve birçok çözülme / donma döngüleri kaçının.

Sonuçlar

GST-His saflaştırma protokolü etkinliğini göstermek amacıyla, Rec14, bir S. arıtıldı 32.9 kDa protein pombe. Rec14 cDNA, sırasıyla N-ve C-termini, (Şekil 1A) GST-ve His-etiketi ekleme olanak veren bir modifiye pFastBac1 vektörü içinde klonlandı. Rekombinant bakulovirüs hazırlanabilir ve protein ifadesi için SF9 enfekte hücreleri enfekte etmek için kullanıldı. Çözünür hücre lizatları GST taneleri ile kuluçkalandı ve bağlanmış proteinleri PreScisson prot...

Tartışmalar

Burada sunulan GST-His rekombinant proteinlerin saflaştırma protokolü boyutları geniş bir aralığının saflaştırılması için uygundur: başarıyla Li Rad51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa) ve dengesiz yüksek molekül ağırlıklı protein saflaştırılmış Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) ^6,9. Ayrıca, bu protokol ile saflaştırılmış proteinler ⁶ biyokimyasal aktif edildi. Bu yöntemin başarısı, sadece arzu edilen protein ekspresyon, çözünür...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
E.Coli DH10Bac (competent)	Invitrogen
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Invitrogen
Maxi Prep Kit	Qiagen	12163	Solution I and II
Ultra Pure Bluo-Gal	Gibco (Life)	15519028
IPTG	Gibco (Life)	15529019
Sf9 infected cells	ATCC	CRL-1711
PreScission enzyme	GE Healthcare	27084301
Grace's infected medium supplemented	Gibco (Life)	11605-094
Fetal Bovine Serum characterized	Hyclone	SH30396.03
P/S (Penicillin-Streptomycin)	Gibco (Life)	15070-063
Glutathione Sepharose resin	GE bioscience	17075605
Protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001
Talon resin	Clontech	635504
Imidazole	BioShop	288324
Gentamicin	Gibco (Life)	15710064
Polyclonal GST-antibody	Production in house
Monoclonal 6X-His-antibody	Clontech	631212
EQUIPMENT
Dounce homogenizer (tight)	Wheaton	357546
Sonicator (Fisher dismembrator)	Fisher	Model 150
Dialysis bag (50 mm)	Fisher Scientific	2115217