Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Özet

Biz yüksek hızlı 3D canlı hücre floresan ışık mikroskobu ve yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografi birleştiren bir karşılıklı mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. Biz burada görüntüleme, dinamik ana HeLa hücreleri ile etkileşime küçük bir HIV-1 parçacıkların bağıntılı yöntemin özelliği göstermektedir.

Özet

Cryo-elektron tomografi (cryoET) yakın-to-fizyolojik durumu ¹ moleküler çözünürlükte hücresel yapıların 3 boyutlu görselleştirme sağlar. Bununla birlikte, cryoET ile ev sahibi hücresel ortamda ayrı ayrı virütik kompleksleri, doğrudan görselleştirme özellikle HIV-1 durumunda, viral giriş seyrek ve dinamik yapısı nedeniyle, ² zordur. Zaman atlamalı canlı hücre görüntüleme HIV-1 ^3-7 yaşam döngüsü birçok yönleri hakkında bilgi büyük bir vermiştir ise, çözünürlük canlı hücre mikroskobu sağladığı (~ 200 nm) sınırlıdır. Çalışmalarımız, canlı hücre floresan ışık mikroskobu birleştirerek cryo-floresan mikroskop ve cryoET tarafından HIV-1 enfeksiyonu erken olayların doğrudan görselleştirme izin veren bir korelasyon yöntemi geliştirmeyi amaçlıyordu. Bu şekilde, canlı hücre ve kriyo-floresan sinyalleri doğru cryoET içinde numuneleme yönlendirmek için kullanılabilir. Ayrıca, yapısal bilgi cryoET olabilir b eldedinamik fonksiyonel verileri ile tamamlanmaktadır E floresan etiketli hedef canlı-hücre görüntüleme ile kazandı.

Bu video makalede, biz yapısal HIV-1 araştırılması ve 3D karşılıklı yüksek hızlı canlı hücre görüntüleme ve yüksek çözünürlüklü cryoET yapısal analizi ile konak-hücre etkileşimleri için detaylı yöntem ve protokolleri sağlar. HIV-1 ile enfekte olmuş partiküller HeLa hücreleri canlı hücre konfokal mikroskopi ile ilk olarak karakterize edilmiştir, ve aynı viral partikül içeren bölgesi, daha sonra 3 boyutlu yapısal detayları için kriyo-elektron tomografi ile analiz edilmiştir. Görüntüleme verileri, optik görüntüleme ve elektron görüntüleme, iki takım arasındaki ilişki bir ev yapımı cryo-floresan ışık mikroskobu sahne kullanılarak elde edilmiştir. Burada ayrıntılı yaklaşım virüs-konak hücre etkileşimleri çalışma için değil, aynı zamanda hücre sinyal, membran reseptör ticareti gibi hücre biyolojisi daha geniş uygulamaları, ve diğer birçok dinamik hücresel süreçleri için değil sadece, değerli olacaktır. </ P>

Giriş

Cryo-elektron tomografi (cryoET) hücre ve dokuların üç boyutlu (3D) görselleştirme izin verir ve bir yakın-fizyolojik durum ¹ moleküler çözünürlükte yerli organeller ve hücresel yapıların örgüt haline anlayışlar sağlayan güçlü bir görüntüleme tekniğidir. Ancak, radyasyon duyarlılığı ile birlikte lekesiz dondurulmuş sulu numune, en doğal düşük kontrast zor bir hücre içinde ilgi alanları bulmak ve daha sonra hedef alan zarar vermeden başarıyla eğim dizi performans için yapar. Bu sorunların üstesinden gelmek için, ışık ve elektron mikroskopi birleştiren bir bağlaşık bir yaklaşım gereklidir. Floresan etiketleme tarafından vurgulanan özgü özellikleri tespit ve floresan ışık mikroskobu ile bulunan ve daha sonra koordinatları yüksek çözünürlüklü 3 boyutlu yapısal veri toplama için elektron mikroskobu aktarılır edilir. Bu yöntem, bir korelâsyon hedef bulma yardımcıilgi Arıkan ele alınması. CryoEM (<300 nm) numune kalınlığına sınırlama nedeniyle, şu anda, hücrenin, sadece çevre bölgelerinde CryoET ile 3 boyutlu yapısal analizi için uygundur. Ayrıca freze ⁹ vitreus ⁸ kesit veya kriyo-odaklı iyon demeti (FIB) tarafından dondurulmuş sulu örneklerin kalınlığı azaltmak bağıntılı görüntüleme yeteneği genişletmek olacaktır.

Daha önce, bağıntılı yöntemler öncelikli olarak büyük statik ve yapıları için ^10-13 cryoET veri toplama kolaylaştırmak için kullanılmıştır. Bu çalışmalarda, cryo-aşamaları cryoEM ızgaraları kabul ve dik bir mikroskop ya da ters bir mikroskop ^10,11,14 ya sığacak şekilde uygulanmıştır. Izgaraları geçiş kendi tasarımları oldukça basit görünse de, EM ızgara için ilgili adımları transfer ızgara, deforme hasar ve kontamine olabilir şansı artan ek vardır. Biz son zamanlarda bir teknik ilerleme gösterdibize doğrudan enfeksiyon ¹⁵ erken aşamalarında, HIV-1 ve konak hücre etkileşimleri olarak yakalamak için doğası gereği zordur dinamik olaylar, görüntülemenizi sağlar bağıntılı mikroskobu. Böylece korelasyon kolaylaştırmak, ızgara kullanım nedeniyle örnek hasarı en aza indirmek için bir kartuş sistemi adapte bir cryo-ışık mikroskobu örnek sahne tasarımı ve uygulayarak bu başarılı. Tasarım her iki kriyo-ışık ve cryo-elektron mikroskobu böylece karşılıklı süreç düzene, örnek transferi olmadan, aynı numune tutucu üzerine, sırayla, yapılacak sağlayan, entegre örnek kartuş tutucu içerir. Buna ek olarak, aynı zamanda indirgeme belirteçleri olarak floresan lateks boncukları kullanılarak doğru ve güvenilir bir korelasyon işlemi uygulanmıştır.

Protokol

1. Karbon kaplı üzerinde HeLa Hücre Kültürü, Altın EM Bulucu Izgaralar

1. Glow deşarj 25 saniye için 25 mA altında 200-örgü R2 / 2 Quantifoil altın EM bulucu ızgara karbon tarafı.
2. Coat 50 mg / ml fibronektin çözümün bir 40 ul damlacık üzerine, aşağı, karbon-yan yüzen fibronektin ile EM ızgara, daha sonra bir doku kültürü kaputu 2 saat UV ışığı altında dezenfekte edin.
3. Plaka HeLa bir cam alt kültürü çanağı içinde 2 x 10 ⁴ hücre / ml (toplam 2 ml kültür) bir yoğunlukta ızgara üzerine hücreleri ve DMEM içinde,% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de hücrelerin büyümesi 4.5 ile takviye edilmiş yaklaşık 18 saat boyunca g / L L-glutamin ve glikoz,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal buzağı serumu, 100 birim / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin,. HeLa hücreleri O / N kültürden sonra enfekte edilir.

2. HIV-1 enfeksiyonu ve Canlı hücre Görüntüleme

1. Cam-alt kültür bir floresan hücre izci (Kırmızı CMTPX, 1 ul / 2 ml) EkleÇanak (adım 1.3) ve floresan boya kadar almak izin vermek için, 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe çanak.
2. Hücreler PBS ile yıkanır ve 50 ul önceden ısıtılmış taze ortam ilave edin.
3. 37 ° C, bir Tebeşir Alan Konfokal tarayıcı mikroskop de, canlı-hücre odası üzerine çanak yerleştirin. Onlar cryoEM yana en yayılma-out ve düz (Şekil 2c ve 2d bakınız), zaman nispeten ince bölgeleri gerektirir iki mitoz faz arasındaki hücreleri ile 1-3 hücre / kare içeren birden çok alan (10-15 pozisyonları), seçin örnek. Gelecekte görüntüleme (adım 2.5) için bu pozisyonları saklayın.
4. (Biz p24 40 ng / ml içeren bir numunenin 40 ul kullanın) GFP VPR içeren VSV-G sözde yazılmış HIV-1 parçacıkları ile hücreleri enfekte. Görüntüleme için pozisyon seçili ve saklanan beri çanak alt içine virüs parçacıkları eklerken, EM ızgara rahatsız değil dikkatli olun.
5. Hemen virionlar eklenmesinden sonra, Ti toplamak20-40 dakika önce seçilen pozisyonlarda yüksek hızlı 3D konfokal görüntüleri, (adım 2.3 'e) me-sukut.
6. Konfokal görüntüleri MetaMorph kullanılarak elde ve Imaris yazılım (Bakınız Şekil 1) kullanarak tek parçacık dinamiği için otomatik 3D parçacık izleme ile analiz edildi. Biz kırınım-sınırlı dinamik davranışı arasında ilişki olduğu için HIV-1 hücresel ince yapı, zaman atlamalı canlı hücre görüntüleme ve 3D parçacık izleme ile parçacıklar sonuçları için önemlidir. Ancak, büyük ve statik yapısı için, basit bir floresan görüntü (canlı hücre olmadan) karşılıklı analiz için yeterli olacaktır.

3. Dondurulmuş-sulu EM Numune Hazırlama

Son konfokal görüntü ve örnek cryo-fiksasyon toplanması arasındaki zaman gecikmesini en aza indirmek için, FEI Vitrobot (ya da diğer vitrifikasyon cihaz) floresan konfokal canlı hücre görüntüleri toplama sırasında başlatılan ve dalma-dondurma için hazırlanmalıdır.

1. Vitrifikasyon cihazı açın ve 22 iklim sıcaklığını ayarlamak ° C,% 100 hedef nem, 7 saniye için kurutma süresi ve bekleme ve 1 sn zaman boşaltın.
2. Piston Dewar içinde ızgara saklama kutusu yerleştirin ve soğuk sıvı etan hazırlamak. Vitrifikasyon cihaz üzerine Dewar monte edin.
3. Hemen konfokal canlı hücre görüntüleme (bölüm 2) sonra, bir buz soğutmalı bakır blok üzerine kültür çanak yerleştirin ve cryoEM numune hazırlama odasına aktarın. Özel cımbız üzerine EM ızgara yüklemek ve hızlı bir şekilde ızgara üzerinde herhangi bir medya uzak kurulayın. Kurutma 0.2 mikron floresan mikroküreler hemen ızgara yerleştirilir ile 15 nm altın boncuk çözüm 4 ul karışık sonra, filtre kağıdı ile, elle yapılır. Altın boncuklar tomografi veri toplama ve hizalama yardım etmek için indirgeme marker olarak kullanılmaktadır. Floresan mikroküreler (Şekil 2c-2f bakınız) floresan ve cryoEM görüntüler arasında korelasyon yardım için kullanılır.
4. Vitrifikasyon cihaz üzerine cımbız yükleyin ve sıvı etan ¹⁶ dondurma leke ve atılmak için cihaz talimat. En iyi sonucu elde etmek için optimize kurutma parametreler şunlardır: leke zaman, 7 saniye, leke ofset, 0, drenaj süresi, 1 sn, sıcaklık, 22 ° C ve nem,% 100.
5. Daha sonra kullanmak için hemen cryoET görüntüleme için bir cryoEM tutucu, ya da bir sıvı azot depolama Dewar dondurulmuş sulu ızgara aktarın.

4. Cryo-floresan Işık Mikroskopi

Bir ev yapımı, cryo-floresan örnek odası ve sahne sistemi (Şekil 3) adımları 4,1-4,10 yürütmek için gereklidir. Sahnenin ayrıntılı özellikleri ve açıklama Haziran ve ark. ^15. bulunabilir.

1. En az 2 saat cryo-floresan ışık mikroskobu (Şekil 3a bak) başlamadan önce sıvı azot ile kendinden basınçlı sıvı nitrojen Dewar doldurun.
2. Bir homebuilt cryo-f monteBöyle bir Olympus IX 71 olarak ters bir floresan ışık mikroskobu, üzerine luorescence örnek sahne ¹⁵ (Şekil 3).
3. Kendini basınçlı Dewar için cryo-örnek sahne sıvı azot girişi bağlayın ve uygun bir kabın içine sıvı azot taşma koruması çıkışı yerleştirin. Objektif sıcak ve don serbest tutmak için objektif lens üzerine yerleştirilen bir kol için kuru azot gazı hattı bağlayın.
4. Dondurulmuş sulu örnek ızgara yüklemek için cryo aşamalı odasına bir bakır blok platformu (Şekil 3b siyah ok) yerleştirin. Soğumasını ve öz-basınçlı dolum Dewar gelen giriş hattı üzerinden sıvı nitrojen ile cryo-sahne bakır odası doldurun.
5. Cryo aşamalı sıvı azot sıcaklığında (~ 4-6 dakika içinde) ulaştığında, cryo aşamalı için ızgara saklama kutusu (adım 3.5 dan itibaren) aktarın.
6. Bakır blok EM numune kartuş içine donmuş-sulu örnek ızgara yerleştirin ve g klibiC-ring kullanılarak yerinde kurtulmak, ya da üstüne bir önceden soğutulmuş bakır halka (Şekil 3d siyah ok) yerleştirin, ızgara kolay erişim için de bir yerde ızgara tutmak ve sonra (bir Polara mikroskop kartuş kullanıyorsanız) Cryo-floresan görüntüleme (olmayan bir Polara cryo-elektron mikroskobu için ise).
7. Kriyo-aşamada (Şekil 3b'de beyaz ok başı) iç bölmesi içinde kartuşu (adım 4,6) yerleştirin.
8. Arama ve canlı hücre görüntüleme verilerden aynı virüs parçacıkları bulmak. EM ızgara bir dizin olduğundan, canlı hücre görüntüleri ve cryo-floresans görüntüler hem de ızgara üzerinde aynı parçacık tespit etmek için basittir.
9. Uzun çalışma (2,7-4 mm) objektif lens ile bir ışık mikroskobu kullanarak cryo-koşul altında belirlenen pozisyonlarda cryo-DIC ve GFP görüntüler elde. Cryo floresan görüntüleme sırasında, periyodik olarak, cryo aşamalı ve dolum içinde sıvı azot seviyesini kontrol gerektiği gibi, -170 aşağıdaki örnek sahne tutmak için° C
10. Kriyo-floresan görüntüleme tamamlanmasından sonra, dikkatli bir şekilde, bakır blok platformuna örnek kartuşu dönmek ve Polara sistemi ile gelecekteki cryoET analizi için bir sıvı azot Dewar kartuşunu. Olmayan bir Polara cryo-elektron mikroskobu kullanıyorsanız, bakır halka kaldırmak için örnek ızgara almak, bir ızgara saklama kutusu yerleştirin ve numune cryoET tarafından incelenir kadar sıvı azot Dewar içinde numune saklayın.
11. Veri analizi için, satın cryo-DIC ve GFP görüntüleri üst üste (adım 4,9, Şekil 4b) ve canlı hücre görüntüleme serisi elde edilen ile cryo floresan görüntü GFP sinyallerin pozisyonları ilişkilidir.

5. Cryo-elektron Tomografi

1. Bu Polara G2 mikroskop gibi bir alan emisyon silah ile donatılmış bir elektron mikroskop cryo-aktarma istasyonuna örnek kartuşu yükleyin.
2. 140X, ide bir büyütme altında düşük doz-arama moduntify ve bir sahne dosyasına ilgili ızgara kareler (adım 4.11 'dan itibaren) kaydedin.
3. 3.500 X bir büyütmede düşük doz-arama modu altında, bir 100 mikron objektif diyafram, arama eklemek ve bir ikinci aşama dosyaya GFP sinyalleri ile ilişkili tüm pozisyonları kaydedin.
4. Önemsiz bir karbon bölgedeki buz uzak yakarak, sahne y işlevini kullanarak, / Å ² ve eğim ekseni rafine ^- düşük doz-pozlama modu altında, 1 veya 2 e bir doz ışın yoğunluğunu ayarlamak için boş bir alan bulmak birkaç altın boncuk ile.
5. Düşük doz-odak modu altında, ~ 3 mikron olarak odak mesafesini ayarlamak ve eğim eksenine paralel olarak odak yönünü hizalamak için açısını ayarlayın.
6. Düşük doz-arama modu altında, (adım 5.3) kayıtlı pozisyonları hatırlamak, örnek eucentric yüksekliğini ayarlayın ve ilgi alanı için eğim aralığı kontrol edin. Expos de, 8 ile 10 mikron bulanıklaştırma az ^- çok düşük elektron doz (/ Å ² ~ 1 e) ile bir projeksiyon görüntü eldekriyo-elektron tomografi için ilişkili virüs parçacıkları onaylamak için ure modu,.
7. Düşük doz odak moduna geçin. TEM otomatik fonksiyonları menüsünde, otomatik eucentric yüksekliği öncesinde ve odak alanı fonksiyonları odaklanmak.
8. Bir eğim serisi elde etmek için parametreleri ayarlayın. / Å ² toplam doz ^- Bu yazıda Şekil 4 için, eğim açıları, sırasıyla, 3 ° ve 2 ° eğim artışlarla, °, altında ve üstünde 45 ° ± 70 arasında değişen 6 mikron bulanıklaştırma ve yaklaşık 70 e, kullanılmıştır.
9. Tüm kayıtlı pozisyonlar için adımları 5.7 ve 5.8 tekrarlayın. Toplu tomografi yazılım iş verimini arttırmak için çoklu pozisyonlarda otomatik veri toplama için kullanılabilir.

6. IMOD ¹⁷ kullanarak üç boyutlu İmar

1. Minimum ve maksimum yoğunluk değerleri ayarlayın ve büyük görüntü değişimine bağlı olarak dışlanacak herhangi bir görünümü var olup olmadığını belirlemek için ham tilt serisi kontrol edin.
2. ETomo ve Eksen tipi, piksel boyutu, konvansiyonel indirgeme çapı, vb kullanarak kurulum tomografisinde paneli başlatın. Sonra com komut dosyaları oluşturabilirsiniz.
3. Tomografisinde hesaplama birkaç aşamada ayarlanabilir / eş zamanlı olarak takip edilebilir şekilde ana pencere yapılandırın. Gerekli parametreleri değiştirin ve her işlem adım (eTomo öğretici bak, gerekli olan özel programlar yürütmek http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ).
4. Son aşamada, tam uyumlu yığını oluşturmak (0.6 daha az bir ortalama kalıntı hata ile) ve IMOD bir ağırlıklı arka projeksiyon algoritması kullanılarak tomografi yeniden.
5. Kontrast ve netlik geliştirmek için uygun parametrelerle IMOD uygulanan bir 3D doğrusal olmayan anizotropik difüzyon kenar geliştirme programını kullanarak ilgi potansiyel alanları Denoise.

Sonuçlar

Virüs partiküllerinin dinamik davranışını karakterize etmek için, HIV-1 ile enfekte olmuş HeLa hücrelerinde yüksek hızlı canlı hücre konfokal mikroskopi ile görüntülenmiştir ve partikül hareketleri (Şekil 1) otomatik 3 parçacık izleme ile analiz edilmiştir. Son konfokal canlı hücre görüntü toplama ve dalma-dondurma (ki yeterince ilişkili HIV-1 parçacıkların kaybetmek olabilir), bir cryo-floresan ışık mikroskobu aşamada (Şekil 3 arasında oluşabilir ...

Tartışmalar

Biz cryoET takip zaman atlamalı konfokal, canlı hücre floresan görüntüleme kullanarak dinamik hücresel olayları analiz etmek için gelişmiş bir karşılıklı bir yaklaşım sağlamak için protokoller basit bir dizi sundu. Yüksek çözünürlüklü cryoET ile 3D canlı hücre görüntüleme ilişkilendirmek için metodolojik geliştirme gibi ana hücreleri ile nadir, dinamik (, ​​daha önce statik rapor değil), ve kırınım sınırlı viral parçacıklar ve etkileşimleri görselleştirme gibi birçok ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine	Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA	12-604F
Fibronectin	Sigma, St. Louis, MO	F1141-1MG	HeLa cell culture on EM grids
Cell tracker	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	C34552	Red CMTPX
Protein A gold conjugates	Ted Pella, Inc., Redding, CA	15822-1	15 nm diameter
0.2 μm fluorescent microspheres	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	F8811	Yellow-green fluorescent
Heat-inactivated fetal calf bovine serum	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	10082-139
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	15140-122
Glass-bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Gold quantifoil finder EM grids	Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany	R2/2 Au NH2 200 mesh
PBS	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	70011-044
Equipment
Glow-discharge device 100X	EMS, Hatfield, PA
Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun	FEI, Hillsboro, OR		300 keV
Vitrobot Mark III	FEI, Hillsboro, OR
Olympus IX 71 microscope	Olympus America Inc., Center Valley, PA		LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens
Nikon TiE microscope	Nikon Instruments, Melville, NY		using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens
Sweptfield confocal microscope	Prairie Technologies, Middleton, WI
Tokai Hit live cell chamber	Tokyo, Japan
Cryo-fluorescence sample stage	Home-made		Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design.