Naif CD4 adenoviral İletimi Treg Farklılaşma Eğitim Hücreler T

Özet

Naif CD4 Coxsackie adenovirüs reseptör transgenik ekspresyonu ile T-hücreleri içine adenoviral gen transferi düzenleyici T hücre farklılaşmasının moleküler analiz sağlar In vitro.

Özet

Düzenleyici T hücreleri (Tregs) kendini hem de bazı yabancı antijenlere karşı bağışıklık dayanıklılık sağlamak için gereklidir. Tregs TGFβ ve IL-2 varlığında TCR-ve ko-stimülasyonu ile in vitro olarak naif CD4 + T hücrelerinden elde edilebilir. Bu, gelecekteki tedaviler için büyük bir potansiyel taşıyan, ancak, moleküller ve sinyal yolları kontrol farklılaşma büyük ölçüde bilinmemektedir olduğunu.

Primer T hücrelerinde ektopik gen ifadesi yoluyla manipüle, ancak yaygın yöntemler primer antijen tanıma önce, T hücresinin en önemli naif durumuna hedef başarısız olabilir. Burada, Treg farklılaşma oluşturulmadan önce in vitro naif CD4 T hücrelerinde ektopik genleri ifade etmek için bir protokol sağlar. Bu çoğaltma eksikliği adenovirüs ile iletim yapar ve onun üretim ve üretim açıklar. Adenovirüs büyük ekler (en fazla 7 kb) kadar sürebilir ve yüksek ve geçici Hsplm ulaşmak için rehberleri ile donatılmış olabilirT hücrelerinde yansıması. Bir transgenik Coxsackie adenovirüs reseptör (SYR) ifade ise etkili naif fare T hücreleri transduces. Önemlisi, enfeksiyon sonrası T hücreleri naif kalır (CD44 ^düşük, CD62L ^yüksek) ve dinlenme (CD25 ^-, CD69 ^-) ve Tregs içine enfekte olmayan hücrelere benzer aktif ve ayırt edilebilir. Bu yüzden, bu yöntem, en başından beri CD4 T hücre farklılaşmasının manipülasyon sağlar. Bu ilk TCR stimülasyon erken sinyal olaylar sonunda farklılaşma Treg içine kurşun hücresel değişiklikler neden zaman bu ektopik gen ifadesinin yer zaten olmasını sağlar.

Giriş

Tregs immün tolerans korumak ve aşılmaz bağışıklık yanıtları kırmak için çok önemlidir. Tregs seyirci T hücre aktivasyonu bastırmak. Sonuç olarak, Tregs ablasyon aktive T hücreleri ¹ ile tahrik ölümcül otoimmünite ve kendi kendini yok yol açar. Tregs CD4 tek pozitif öncüleri olumsuz seçimi sırasında timus gelişebilir, ama onlar da optimal ortak stimülasyon ^1,2 ile düşük doz antijen stimülasyonu üzerine naif CD4 T hücreleri çevre içinde ayırt edebilirsiniz. Periferik Tregs bağırsak ve akciğer hoşgörü sağlayan suçlanmıştır ise timik Tregs, kendini antijenlere karşı doku otoimmünite bastırmak gibi görünüyor. Bu bağlı Tregs kuvvetli gıda ve hava, ortakçı bakteri ve alerjenleri ^3,4 çevresel antijenleri dahil olmak üzere mukozada yabancı antijenleri, tanınması sonra T hücre aktivasyonu engeller. Buna ek olarak, Tregs fetal peptidler için anne toleransı ⁵ kurmak ve önceden için çok önemlihavalandırma graft-versus-host hastalığı ^6. Aynı zamanda, aynı zamanda ^7,8 Tregs tümör hücrelerinin immün gözetim alçaltarak istenmeyen etkilere aracılık eder. Tregs damgasını özelliği alt-belirterek transkripsiyon faktörü Foxp3, gerekli ve fonksiyon ^9,10 Treg görüşmek için yeterli bir çatal başlı etki alanı içeren transkripsiyon faktörü ifadesidir. Foxp3 ifade neden bazı sinyal yolları bilinmektedir. Bununla birlikte, kontrol, düzenler ya da tetikleyici T hücresi reseptörüne tepki olarak farklılaşma Treg modüle ettiğini moleküler süreçlerin daha iyi anlaşılmıştır.

Tregs çok etkili TGFβ ve IL-2, ¹¹ varlığında, anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları ile naif CD4 + T hücrelerinin uyarılması ile in vitro olarak uyarılabilir. Gelişmekte olan Tregs in vivo, Treg farklılaşma teşvik moleküllerin manipülasyon fonksiyonel olduğu gibi gelecekte therapi için büyük bir potansiyel taşımaktadıres, örneğin, astım, Crohn hastalığı, transplantasyon ve ^11,12. Tersine, Treg farklılaşma engellemek için moleküllerin tedavi modülasyonu tümör hastaların kombine tedavi gelecekteki yaklaşımlar fayda sağlayabilir.

In vitro farklılaşma tayinlerde T hücre alt farklılaşma ile ilişkili moleküler değişikliklerin açıklaması için vesile olmuştur. Şu anda, ara ya da kontrol T hücre farklılaşmasını ektopik gen ifadesinin en yaygın yöntemler naif T-hücrelerinde başarısız olması nedeniyle engellenmektedir bu gen ürünlerinin taranması için deneysel çalışır. Örneğin, elektroporasyon ve retroviral transdüksiyon aktive edilmiş T-hücrelerinde etkilidir. Ilk beklentileri, dinlenme hücreler tipik olarak etkilidir lentiviral transdüksiyon, aksine, sitokinler ¹³ tarafından naif T hücrelerinin ön aktivasyon gerektirir. Ayrıca, elektroporasyon sırasında cDNA veya mRNA 'devrikendisi T hücre aktivasyonunun özellikleri kazandırır ve hatta ^{Ca2 +} sinyali harekete geçirebilir plazma zar, depolarizasyon içerir ve NFAT proteinler (yayınlanmamış gözlem ve ref. ¹⁴⁾ etkinleştirin. 40 saat - Benzer şekilde, retroviral transdüksiyon için, naif T hücreleri 18 için aktif olmak zorunda. Bu süre boyunca, hücre bölünmesi sırasında nükleer membran arıza meydana ve retroviral vektör ^15'in sonraki genomik entegrasyon için izin verir. Bu yöntemler bu nedenle yardımcı T hücre farklılaşmasının belirleyici aşamasıdır antijen ile ilk T hücre karşılaşma erken moleküler düzenleme ele mümkün değildir.

Adenoviral transdüksiyon, insan adenovirüs Coxsackie reseptörü (CAR) ifade, insan hücre tipleri arasında bir dizi geçici ektopik gen ekspresyonunu vermek bilinmektedir. Bu hücre aktivasyonu ya da hücre döngüsü ilerlemesi için gerek kalmadan devam eder. C yüzey ekspresyonuAR etkili bir virüs bağlanma ve içselleştirilmesi için gerekli olan ve bir T hücre-spesifik promotör altında kesilmiş versiyonunu CARΔ1 transgenik ekspresyonu adenoviral enfeksiyon ¹⁶ ile duyarlı bir fare timositleri ve T hücre oluşturmak bulunmuştur. Önemli olarak, transgen timosit gelişimi değiştirmeyen veya naif CD4 in vitro farklılaşma, farklı alt-grup halinde hücreleri (veriler gösterilmemiştir; ref ^17.) T. T hücrelerinin Adenovirüs aracılı transdüksiyon önce yaklaşımlar ^19,20 aşırı ^17,18 için kullanılan ve knock-down oldu. Transgenik T hücreleri ticari olarak temin DO11.10 TG arıtılabilir; CARΔ1 TG (Taconic, Inc ref ^17).. Önemli olarak, Adeno transdüksiyon aktivasyon belirgin belirtileri neden olmadan naif T-hücrelerinde, bir ilgi geninin yüksek sağlar. T hücreleri naif kalır (CD44 ^düşük, CD62L ^yüksek) ve dinlenme (CD25 ^-, CD69 ^-) sonra enfeksiyonuve enfekte olmayan hücrelere benzer Treg içine aktif ve ayırt edilebilir.

Rekombinant adenovirüsleri üretimi adenoviral plazmidi (Şekil 1) ile HEK293A hücre sırasında transfeksiyonundan sonra elde edilebilir. Bu plazmid genellikle çoğaltma-beceriksiz rekombinant adenovirüs ²¹ işlemek için silinir E1 ve E3 genleri ile insan tipi 5 adenovirüs genomu içerir. Onlar makaslanmış adenovirüs ²² istikrarlı entegrasyonu ile ölümsüzleştirdi edilmiş olarak HEK293A hücre çoğaltma eksikliği tamamlıyor. Adenoviral vektörlerin büyük (~ 40 kb) ve dolayısıyla iyi geleneksel kısıtlama enzim aracılı klonlama için uygun olmadığı için, biz Ağ Geçidi sistemi istihdam. İlgi konusu genin başlangıçta kolaylıkla lambda Rekombinasyon reaksiyonu (LR) ²³ yoluyla hedef adenoviral vektörü içine transfer edilebilir daha küçük bir giriş vektörü içine klonlanır. Biz pCAGAdDu vektör inşaprokaryotik ccdb seçim işaretleyici ²⁴ yan LR siteleri içeren bir ekspresyon kaseti ile CAG promoteri (tavuk aktin promotörü ve CMV artırıcı) birleştirerek. Bu ifade kaseti, büyükbaş hayvan büyüme hormonu poli (A) sinyal içeren bir diziye kaynaşmış olan ökaryotik enfeksiyon marker gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) arasında ekspresyonuna izin veren bir dahili ribozom giriş bölgesi (IRES) öğesi için eritilerek birleştirilir. Prototipik CMV promoteri yüksek aktivasyon bağımlı ve naif T hücrelerinde gen ekspresyonu için bu nedenle elverişsiz olduğu bulunmuştur beri, CAG cis-düzenleyici sekanslar seçtik.

Burada, in vitro Treg farklılaşmasında etkili bir protokol ve etkinleştirme (Şekil 2) olmadan naif CD4 + T hücrelerinin transdüksiyonu için bir yöntem sağlar. Yöntemi ektopik gen ekspresyonu sağlayan ya da naif devlet önceki CD4 T hücre farklılaşması yıkmak. Bir overexpresse etkisini test edilmesine olanak sağlarT hücre alt bağlılık kadar ilk TCR uyarılması üzerine erken sinyal olaylar sırasında ilgi d gen. Bizim doğrulama deneyleri de Th2 gibi Th1 gibi diğer T hücre alt grupları, TH9, Th17, Th22 veya TFH hücrelerin farklılaşması benzer adenovirüs uygulama kurmak için temel sağlar.

Protokol

1. Girdi Vektör içine İlgi Çekici Gen Klonlanması

1. Bir giriş vektörü, ilgi konusu gen klonlama. Bir topoizomeraz çiftli vektör (örneğin pentr / D-TOPO) veya kısıtlama enzim aracılı klonlama bu işlem için kullanılabilir içine kör uç ligasyonu ile takip geninin PCR amplifikasyonu.

2. PCAGAdDu hedef vektörü içine, ilgi konusu gen aktarma

1. LR rekombinasyon (örneğin Ağ Geçidi LR Clonase II enzim Mix) tarafından hedef vektör girmesinden vektör ilgi gen aktarın. Bu adenovirüs ekspresyon vektörü (Şekil 1) oluşturur.
2. , Bir Paci restriksiyon sindirimi içinde adenoviral sentezleme vektörü 10 ug linearize DNA hızlandırabilir ve 100 ul başına 3 ug 'lik bir konsantrasyonda su içinde süspansiyon haline getirin. Doğrusallaştırma v çoğaltma ve encapsidation için gerekli olan viral ters tekrarlar (Re), açığaVirüs partiküllerinin içine Iral DNA yapısı.

3. Birincil Virüs Lizat üretimi

1. Tohum 1 x 6-plaka de bir 2 ml hücre kültür ortamı içinde 10 ⁵ HEK293A hücreleri (DMEM,% 10 FBS,% 5 PenStrep) ve 6 için hücre inkübe - 37 ° 14 saat, bir% 10 ° C CO ₂ inkübatör onlara uymak için izin vermek. Daha sonra hücreler konfluense yaklaşık olarak en az% 50 olmalıdır.
2. Lipofeksiyon: Transferi NaCl 50 mcM, vorteks kısaca 94 ul içine jetPEI reaktif 6 ul. Vorteks 100 ul doğrusallaştırılmış adenovirüs vektörüne karışık çözelti eklenir ve 15 için transfeksiyon karışımı inkübe - oda sıcaklığında 30 dak.

Adenovirüs enfeksiyonu için uygun biyogüvenlik koşulları altında aşağıdaki adımları uygulayın!

3. HEK293A hücre içeren iyi üzerinde damla damla çözüm koyun ve 37 hücreleri inkübe ° C ve% 10 CO _2. Flöresanlı bir işaretleyici kullanırken, transfe değerlendirmekgörsel 12'den sonra ction verimliliği - ters bir floresan mikroskop kullanılarak 36 saat. Taze ortam içinde 0.5 ml 3 günde ekleyin.
4. Ayırmak başlar genişlemiş ve yuvarlak hücreler ile alanlardır sitopatik etkileri (CPE), bir ışık veya floresan mikroskop ile 3 gün - her 2 kontrol edin. Bu, etkili bir virüs üretimi göstergesidir. CPE daha geniş bölgeleri (Şekil 3) ortaya çıkması üzerine, bu 24 alacak - 72 saat tüm hücreleri enfekte önce.
5. Tüm hücreleri CPE belirtileri gösteriyor, ancak hücrelerin genel bir dekolmanı meydana gelmeden önce, süpernatant ile Nazik pipetleme ve transfer hücreleri (SN, 3 - 5 ml) ile hücreleri ayırmak zaman 15 ml polistiren tüp.
6. 15 kuru buz üzerinde SN hücreleri Freeze - 20 dakika ve kopma hücrelere ° C daha sonra 37 hızlı bir şekilde çözülme. Bu donma-ve-çözülme döngüsü (F / TC) iki kez daha tekrarlayın. Bir gün içinde kullanım için buz üzerinde birincil virüs lizat tutun veya -80 ° C uzun süreli depolama için dondurma. Her türlü ilave F/ TC 30, virüsün titresi azaltacaktır - 50%.

4. Virüs Amplifikasyon

1. Tohum ve 14 cm doku kültürü çanak% 90 izdiham HEK293A hücreleri büyür.
2. Birincil virüs lizatı (1,5-2,5 mL) yarısı ile hücreleri enfekte edebilir ve en az 36 saat boyunca hücrelerin inkübe. Hemen hemen bütün hücrelerin floresans mikroskobu ile tespit edilebilir, daha sonra enfekte edilmelidir. Zaten (daha konsantre yani) amplifiye virüs stokunun yeniden güçlendirme için, 50 enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı) (6.3) de HEK293A enfekte.
3. Hepsi CPE gösterir ama dekolmanı önce zaman Hücreler hasat edilmelidir. Verimli virüs üretimi ile bu durum enfeksiyondan sonra 48 saat içinde ulaşılır. (Bu bir hafta kadar sürerse, 4.2 açıklanan enfeksiyon için kullanılan adenovirüs stok miktarını artırarak amplifikasyon bir tur düşünün.)
4. 50 ml'lik bir tüp polistiren için nazik pipetleme ve transfer hücreleri ve SN hücreleri ayırmak. 4 10 dakika ° C için 300 xg'de hücreleri aşağı Spin
5. SN çıkarın ve orta veya Sn (yaklaşık 1 mi) arasında uygun bir hacimde pelletini.
6. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj hücreleri ve bozmaya 3 K / TC gerçekleştirme (Konsantre virüs lizat yani) virüs partikülleri içeren SN çıkarmak ve kısım virüs lizat -80 saklayın ° C

5. Virüs titresi Belirlenmesi

1. Tohum 10 ⁵ A549 hücre başına kuyuya 1 ml orta ve hücreler 6 saat uymak izin bir 12 plaka 5 kuyu.
2. Ortam içinde bir seri dilüsyon (1:5,000, 1:10,000, 1:50,000, 1:100,000) yapmak ve oyuk başına 10 ul kadar konsantre edildi adenovirüs (buz üzerinde çözündürüldü) 1 ul kullanımı. Akım sitometri olarak yolluk ayarlamak için bir de bulaşmamış bırakın.
3. 36 saat sonra, PBS ve ayırmak hücreleri (örneğin trypsinization tarafından) ile yıkayın, SN çıkarmak. Biohazard önlemler için, bu c düzeltmek için tavsiye edilir10 dakika oda sıcaklığında ve bir kez PBS ile yıkama için 100 ul PBS içinde% 4 paraformaldehid arşın.
4. Enfeksiyon işaretleyici ifade FACS analizi yapın. Arsa enfekte hücrelerin mutlak sayısı (Şekil 4) karşı 'ul viral lizat Seç'. Enfeksiyon doğrusal aralığı belirlemek ve x = 1.000 ul kullanarak lineer aralığında standart eğriden sulandırılmamış virüs ml'si başına titreyi hesaplamak.

6. T Hücre Enfeksiyon

1. Den dinlenme / naif CD4 T hücreleri izole DO11.10 tg; MACS (Naif CD4 + T hücre izolasyonu Seti II) veya FACS sıralama kullanarak CARΔ1 tg fareler (CD4 + CD25-CD62L + CD44-).
2. Küçük ölçekli deneyler için, bir 96-gözenekli yuvarlak tabanlı bir plaka içine iyi bir MOI 50 elde etmek için viral lizat uygun bir hacmi pipetle.
3. T hücre ortamı içinde 50 ul son hacim enfeksiyonu (RPMI1640,% 10 FBS,% 5 PenStrep,% 5 NaPyruvate, 1x NEAA, 1x gerekli MEM içinde 4 x 10 ⁵ T hücre ile toplayınvitamini, 1x L-glutamin, 1:250,000 merkaptoetanol, 10 mM HEPES).
   Örnek:
   Bir İçişleri Bakanlığı 50 3 x 10 ⁵ T hücreleri enfekte için kullanılır; viral titresi, 3 x 10 ml ^{9 -1}
   Virüs hacmi = İçişleri Bakanlığı x T / hücre sayısı / viral titresi = 50 x (3 x 10 ⁵⁾ (3 x 10 ⁹ ml ^-1) = 0.005 ml

Not: gevşek fincan (tüp başına tp 3 ml kadar) bir polistiren tüp içinde 10 ⁶ naif T hücreleri başına 165 ul bir enfeksiyon hacminde bir İçişleri Bakanlığı 50 kullanılarak daha büyük hücre sayıları, ölçek enfeksiyon için.

4. % 5 _CO2 kuluçka makinesinde 37 ° C 'de 90 dakika boyunca inkübe hücreleri.
5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri aşağı Spin, 200 ul PBS içinde tekrar süspansiyon SN, çıkarmak. Tekrar santrifüj ve SN çıkarmak.

(İsteğe bağlı: hücreleri daha etkin virüs kaldırmak için tekrar yıkanabilir)

6. Tekrar süspansiyon hücreleri200 ul T hücresi uyarıcı antikor olmayan ve IL-2 veya başka bir sitokin olmadan, orta ve 37 ° C'de 40 saat boyunca dinlenmeye bir% 5 _CO2 inkübatöründe ° C aktivasyonundan önce, ilgi konusu gen ekspresyonunu sağlamak için.

7. T Hücre Aktivasyon ve Polarizasyon

1. Bir hacim, anti-CD3-ve küçük bir kap içine reaktif hücre sayısı (örneğin, 4 x 10 ⁵⁾ karşılık gelen bir anti-CD28 çiftli boncuk Pipet, PBS 10 kat hacim ekleyin ve 2 dakika için bir mıknatıs üzerine koyun . Süpernatantı alın ve 200 ul ortam içinde polarize boncuklar (Treg: T hücre ortamı + 1 ng / ml 'TGFβ, 100 U / ml IL-2) tekrar süspansiyon haline getirin.

Not: Hücreler aynı zamanda, anti-CD28 ve anti-CD3 antikorları ile kaplı doku kültür kaplarında kullanılarak aktive edilebilir, ya da ovalbumin 323-339 peptit antijen ile doldurulan ışınlanmış BALB / c splenositleri kullanılarak DO11.10 T hücre reseptör-özgül.

2. Centrifuge daha önce olduğu gibi hücreleri dinlenmiş, 200 içeren ul polarize orta anti-CD3-ve anti-CD28-antikor birleştiğinde boncuk SN ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarmak. Orta değiştirmeden% 5 CO ₂ inkübatör 37 ° C de 72 saat inkübe edin.

8. T Hücre Sabitleme ve Sitometrisi için Boyama

1. Hücreleri yıkayın: Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri aşağı Spin, 200 ul PBS içinde tekrar süspansiyon SN, çıkarmak. Tekrar santrifüj ve SN çıkarmak. Buna göre tüm aşağıdaki yıkama adımları uygulayın.
2. 100 ul tamir edilebilir ölü hücre boyama çözeltisi içinde hücrelerin yeniden süspanse edin ve 4 de 30 dakika boyunca inkübe ° C.
3. Hücre yıkayın, 100 ul PBS içinde tekrar süspansiyon, PBS, oda sıcaklığında inkübe edin, 15 dakika içinde 100 ul% 4 paraformaldehid ekleyin.
4. Yıkama hücreleri, PBS içinde 200 ul buz gibi soğuk bir% 70 metanol içinde onları tekrar süspansiyon ve buz üzerinde 30 dakika süreyle inkübe edin.

Not: Hücreler biyolojik tehlike önlem olmadan şu andan itibaren tedavi edilebilir!

5. 60 ul ana-karışımı 60 ul PBS + 10 ug / ml Fc bloğu (spesifik olmayan bağlanma bloke etmek için anti-FCR3). Hazırlanması Yıkama hücreleri, PBS + anti-FCR3 40 ul bunları tekrar süspansiyon ve 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
6. 20 ul ekleyin PBS + anti-FCR3 1 mg PE-birleştiğinde anti-Foxp3 antikoru içeren, ° C gece boyunca 4 de iyice karıştırın ve kuluçkaya yatmaktadır.
7. PBS içinde iki kez hücreleri yıkayın ve bir akış sitometresinde hücreleri analiz.

Sonuçlar

Virüs Üretim

Yüksek virüs titreleri üretimi için, birincil virüs üretimi veya virüs amplifikasyon HEK293A hücre hasat zamanlaması çok önemlidir. Virüs üretim görsel işaretleri ile Örnek fluoresan ve faz kontrast görüntüleri Şekil 3 'de gösterilmiştir. CPE 10 gün parçası olmayan bir kontrol pCAGAdDu vektörü ile HEK293A hücre sırasında transfeksiyonundan sonra gözlenmiştir. CPE enfeksiyon işaretleyici GFP yüksek ifade ayırmak ve sergilemey...

Tartışmalar

Virüs Üretimi ve Titrasyon

En iyi sonuçları elde etmek için transfeksiyon, Doğrusallaştırılmış vektör kalitesi ve miktarı en önemli görünmektedir. Enfeksiyon hızla bir kez verimli virüs üretimi oluşur devam edecek beri kültürün bir başlangıç ​​büyüme primer lizat üretim üzerinde olumsuz etkileri gözlenmedi. Ancak, HEK293A hücreler tarafından virüs üretimi verimliliği azaltmak uzun ekler etkilenebilir. Bazı açık okuma çerçeveleri aslında virüs üret...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	11791020
PacI	New England Biolabs	R057S
jetPEI	Polyplus-transfection	101-10N
HEK293A Cell Line	Invitrogen	R705-07
A549	ATCC	CCL-185
6-well plates	BD Falcon	353046
14 cm tissue culture dish	Nunc	168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr	Taconic Farms	Model Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II	Miltenyi Biotech	130-094-131
DMEM	Invitrogen	41966-052
FBS	PAN Biotech	1502-P110704
PenStrep	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Lonza	BE12-167F
NaPyruvate	Lonza	BE13-115E
NEAA 100x	Lonza	BE13-114E
L-Glutamine	Invitrogen	25030
HEPES Buffer Solution (1 M)	Invitrogen	15630-056
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x)	Lonza	13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation	Invitrogen	114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1	R&D Systems	240B
Proleukin S (18 x 106IE)	Novartis
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L-23105
Mouse BD Fc BlockT	BD Pharmingen	553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE	eBioscience	12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay	Roche Applied Biosystems	4427975
LightCycler 480 Probes Master	Roche Applied Biosystems	04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Roche Applied Biosystems	4366596