Erken Otofaji Etkinlikler Hücre Görüntüleme Canlı: Omegasomes ve Ötesi

Özet

Floresan etiketli otofaji belirteçlerin zaman atlamalı mikroskopi yüksek temporal çözünürlük ile dinamik otofaji yanıt izleme sağlar. 3 farklı renklerin bir kombinasyonu belirli Otofaji ve organel belirteçleri kullanarak, güçlü bir mekansal ve zamansal bağlamda autophagosome oluşumuna bir protein katkısı takip edebilir.

Özet

Otofaji besinlerin, özellikle amino asit yokluğunda eksikliği tarafından tetiklenen bir hücresel tepkidir. Otofaji sitoplazma, uzun ömürlü proteinler ve hatta protein agregatlarının, kusurlu organeller ve virüs ya da bakteri tecrit Autophagosomes adlandırılan çift cidarlı yapıların formasyonu ile tanımlanır. Autophagosomes sonunda üretilen besin sitoplazmaya geri geridönüştürülerek ile, içerik toplu bozulmasına yol açan lizozomlar ile sigorta. Bu nedenle, otofaji hücre dengesini için çok önemlidir ve otofaji bozulmasına hastalık, özellikle nörodejenerasyon, yaşlanma ve kansere yol açabilir.

Autophagosome oluşumu hücreleri çekirdek otofaji makine adı verilen proteinlerin belirli bir grup, tahsis hangi için, bir çok ayrıntılı bir süreçtir. Çekirdek Otofaji makine işlevsel olarak, çeşitli hücresel işlemleri ile ilgili ek proteinler ile tamamlanır membranında örneğin birmitokondriyal ve lizozomal biyoloji e ticareti,. Autophagosomes oluşumu ve bozulması için bu proteinlerin Koordinasyon otofaji son derece dinamik ve sofistike yanıt oluşturmaktadır. Canlı hücre görüntüleme bir tek autophagosome oluşumu olayın seviyesine her otofaji ile ilgili proteinin moleküler katkısı aşağı izlemenizi sağlar ve gerçek zamanlı olarak, bu nedenle bu teknik, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük sunuyor.

Burada bizim analiz için bir mekansal ve zamansal bağlamda kurmak için, istikrarlı bir şekilde GFP-DFCP1 ifade eden bir hücre hattı kullanın. Autophagosomes oluşumuna yol açan haberci yapılardır DFCP1 işaretleri omegasomes. Ilgi (POI) bir protein, kırmızı ya da mavi floresan etiketi ya ile işaretlenebilir. Mitokondri ve lizozomlar ER gibi farklı organeller,,, tüm autophagosome oluşumu farklı adımlar katılan ve belirli bir izci boya kullanılarak işaretlenebilir. AUTOP zaman atlamalı mikroskopiBu deneysel yukarı hagy, bilgi dördüncü boyutu örneğin, süresi hakkında ayıklanmasını sağlar. Dolayısıyla biz uzay ve zamanda otofaji için POI katkısı takip edebilirsiniz.

Giriş

Otofaji ^1-3 autophagosome oluşumunun son sonuç için proteinin çok sayıda koordine gerektiren oldukça dinamik bir işlemidir. Mikroskopi muhtemelen en sık otofaji ⁴ eğitim için uygulanan bir tekniktir. En Otofaji protein lokalizasyonu yaygın hem de endojen proteinlerin immüno-boyama yöntemi ve floresans ile etiketlenmiş eksojen proteinin ifadesi ile, sabit hücrelerinde incelenmiştir. Buna ek olarak, Elektron Mikroskobu (EM), tek başına ve immün-altın etiketleme, ile birlikte bu yapıların ^5,6 ince ayrıntıları nitelendirdi. Zaman - bu tekniklerin alanı 3 boyutlu olarak autophagosome oluşumu anlayışımızı kurduk olmasına rağmen, onlar ^4. boyut hakkında bilgi yeterli miktarda sağlamak için başarısız oldu. Bu Possi kadar yakın bir autophagosome oluşumu takip verir gibi canlı hücre görüntüleme Bu bariyer üstesindengerçek zamanlı ⁷ ble. Bu teknik ilk Yoshimori ve arkadaşları ⁸ tarafından otofaji incelemek için kullanılmıştır, ve giderek bundan sonra kullanılmıştır.

Time-lapse mikroskopi canlı hücrelerde POI ve bir süre boyunca lokalizasyonu yakalar. Iyi karakterize otofaji ve / veya organel işaretleyici bu bilgileri karşılaştırarak, canlı hücre görüntüleme analizi autophagosome oluşumu büyük mekansal ve zamansal bağlamda POI koyabilirsiniz. Canlı hücre görüntüleme analizi autophagosome oluşumu tüm adımları boyunca POI lokalizasyonu tekrarlayan yakalama dayanır, sabit hücre görüntüleme tek bir yakalama dayalı iken. Sabit hücre görüntüleme sadece lifecy farklı aşamalarında aynı anda yakalanan birçok autophagosomes yılında ortalama lokalizasyonu dayalı POI rolünü, varsayabiliriz ise bu nedenle, canlı hücre görüntüleme, autophagosome oluşumunun belirli adımlar da POI katkısı kanıtlayabilirimcle.

Canlı hücre görüntüleme yüksek analitik güç bir yöntem olmasına rağmen, bu göz önüne alınması gereken bazı doğal sınırlamalar vardır. Her şeyden önce, canlı hücre görüntüleme bir ya da daha fazla dış kaynaklı floresanla işaretlenmiş proteinlerin ekspresyonu gerektirir. Floresan etiketleri boyutu büyük olma eğilimindedir ve bazen sterik nedenlerden dolayı bir protein davranışını değiştirebilir. Bu membran 2 boyutları sınırlı alanda çalışması için gereken bu durumu, membran proteinleri için vurgulanır. Önemli olan, bir Autophagosomes membranöz yapılardır ve buna göre oluşumu membran-ilişkili proteinlerin çok sayıda gerektirir.

Başka bir problem seti POI ifade seviyeleri bağlanır. Prensip olarak, bir eksojen protein endojen protein karşılaştırılabilir seviyelerde ifade edilmelidir. Bu alt hücresel yerleşimi önemli düzenleyiciler doymuş olmayacak sağlar, ve inciE analiz biyolojik ilgili olacaktır. Onlar endojen seviyelerinin üzerinde ifade edilir, onlar otofaji yanıt ⁹ inhibe eğilimi olarak Ayrıca, otofaji proteinlerin aşırı, kaçınılmalıdır. Tersine, POI ifadesi düzeyleri yana fotoğraf beyazlatma olmadan zaman iyi bir süre için yerelleştirme aşağıdaki sağlayacak kadar yüksek olmalıdır, bir uzlaşma gerekmektedir. Memelilerde hücrelerin bir eksojen proteinin en iyi ifade seviyeleri elde ince ayar bir sürü gerektirir, ancak stabil POI farklı düzeylerde ifade hücre hatları kurulması ve tarama ile mümkündür.

Standart floresan mikroskobu ile elde edilebilir uzaysal çözünürlüğü başka bir sınırlayıcı faktördür. Çözünürlük nedenlerle bir dizi için sınırlı olabilir, ama en iyi, yanal çözünürlük 250 nm civarında olacak. Bu, daha küçük bir mesafe ile ayrılmış herhangi bir nesne (veya tek olarak bağlı görüneceği anlamına gelirnesne) ve 250 nm daha küçük nesneleri olduklarından daha büyük resimde temsil edilecek. Bu nedenle görüntülerin her zaman bu düşünce ile yorumlanmalıdır ve bu EM gibi tamamlayıcı teknikler ince ultra-yapısal detay çözmek için gerekli olacaktır.

Sonuç olarak, canlı hücre görüntüleme doğal olarak, uzun bir zaman süresi için potansiyel olarak, hafif bir hücre açığa gerektirir. Bu bir hücre, fotoğraf-toksisite olarak bilinen bir olgu fizyolojik tepkileri değiştirebilir.

Biz başarıyla autophagosomes ER teller ^10,11 ile yakın ilişki içinde olan PI3P zengin halka benzeri yapılar olarak adlandırılan omegasomes, köken, ilk kez açıklamak için PI3P-bağlayıcı protein DFCP1 canlı hücre görüntüleme kullandık. Biz açıkça LC3 pozitif yapıları omegasomes ile yakın ilişki içinde oluşmaya başlar göstermiştir. Biz burada bir hücre hattı istihdam stabil canlı hücre için GFP-DFCP1 ifade öneririzilgi protein görüntüleme, autophagosome oluşumunda rolü karakterizasyonu için sağlam bir mekansal ve zamansal çerçeve kurar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Hücre Hazırlanması

1. (2 sonra% 80 bir confluency için amaç% 30-40 bir confluency için, Dulbecco'nun Modifiye Eagles Orta (DMEM) gece boyunca kültür hücreleri; HEK-293T hücreleri Tohum düşük geçit sayısı istikrarlı bir şekilde 22 mm yuvarlak lamelleri GFP-DFCP1 ifade gün - canlı hücre görüntüleme gün).

2. Hücre transfeksiyonu

1. İt serum, orta, 3 ul X-tremeGENE 9 DNA Transfeksiyon Reaktif ve pECFP-LC3 plazmid DNA, 0.5 ug azaltılmış 100 ul OptiMEM içeren, her plaka için transfeksiyon kompleksi karışımı hazırlayın. Ve aşağı yukarı pipetleme hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. [Not: defalarca bu Lipofectamine 2000 gibi diğer transfeksiyon reaktifler, toksisite çok şey var bulduk, ve, ek olarak, birçok mikroskopi teknikleri ile müdahale kendi floresan parçacıklar üretmek.]
2. Plakalardan ortamı aspire ve taze DMEM önceden ısıtılmış 37 ° C de eklemek
3. Tran Ekle24 saat inkübe hücreleri; pipetleme hücrelere karmaşık sfection.

3. Organel Marker (opsiyonel) ile hücre Kuluçka

1. 75 nM'lik bir son konsantrasyonda DMEM Mitotracker / Lysotracker ekleyin ve ışığa maruz kalma ve tekrarlayan dondurma ve eritme döngüsü önlemek için, bütün deney günü boyunca, alüminyum folyo ile kaplı bir Falcon tüpüne, buz üzerinde tutmak.
2. Mitotracker / Lysotracker-ihtiva eden ortam 2 ml 'lik bir kısım çıkarın ve 37 ° C'de ısıtmak; transfekte hücrelerden aspire orta ve Mitotracker / 30, orta ve inkübe hücreleri içeren Lysotracker ile değiştirin - 60 dak.

4. Canlı Hücre Görüntüleme için Kuluçka Odası hazırlanması (Şekil 1)

1. Temiz metal ve% 75 etanol ve metal O-ring kenarında silikon gres uygulamak ile O-ring plastik.
2. Forseps plakadan lamel kaldırmak ve lamel alt taraftan ortamın aşırı kuru kullanarak,Bu gibi, yağ ile çok fazla orta karıştırma önlemek için sızıntı olasılığını artıracaktır.
3. Kapalı bir oda oluşturmak için, arasında sıkışmış lamel ile, plastik O-ring bir çıkıntı üzerinde dinlenme ve plastik O-ring üstüne metal O-ring uygun lamel bırakın.
4. Plakadan ortamı ile iyi odası; DMEM bikarbonat tampon sistemi yapay _CO2 konsantrasyonu gerektirir ve bu noktadan ve üzerine, meydana pH değişiklikleri önlemek için, bir tampon madde içermeyen DMEM ortamı içinde hücrelerinin uzun süreli inkübasyondan kaçınmak % 5-10 arasında ve ortam havasının _CO2 konsantrasyonu çok daha düşüktür.

5. Hücre Açlık

1. Mikroskop sahnede kuluçka odasına koyun.
2. Tam orta aspire ve açlık orta 2 ml 3 kez yıkayın, hiçbir amino asitler sonunda otofaji yanıt engeller DMEM, kalma emin olmak için; ayarlayınON zamanlayıcı.

6. Mikroskopla inceleme

1. Canlı hücre geniş alan epi-floresan için yapılandırılmış uygun bir görüntüleme sistemi gerekecektir. Bu genellikle bir araştırma dereceli ters bir mikroskop çerçeve, floresan proteini (ler) / ilgi çekici boya (lar), yüksek kaliteli objektif lens, hassas bir CCD / sCMOS için özel yoğun bir geniş spektrumlu ışık kaynağı, ayna ve filtre oluşacaktır kamera ve bir kuluçka odası. (Bütün büyük mikroskop üreticileri canlı hücre görüntüleme için uygun tam bir geniş alan sistemleri sunuyoruz, ancak bu üreticilerin çeşitli bileşenleri kullanarak bir sistem ev inşa da mümkündür ve bu mikro-Müdürü olarak açık kaynak kodlu yazılım kullanarak kontrol : http / / valelab.ucsf.edu / ~ AA / MMwiki / ). Bizce en önemli yönü floresan gazetecilere ifade seviyeleri en aza böylece yüksek hassasiyet bir sistem kullanmaktır.
2. Selgörüntüye uygun hücrelere ecting.
   1. Daha autophagosome oluşumu olayları çekilecek sağlayacak büyük ve düz hücreleri seçin. Aynı zamanda, daha önce omegasomes daha büyük bir sayı üretmek başlamıştır hücreleri için tercih.
   2. Videoyu autophagosome oluşumu olayların daha büyük bir oranı yakalamak için, 30 dakika sonra ya da iyi otofaji yanıt içine video yakalama başlatın.
3. Görüntüleme.
   1. Bir yüksek büyütme lens (100x 1.4 NA) kullanın.
   2. Fotoğraf beyazlatma önlemek için en fazla% 10-20 uyarma ışık yoğunluğunu ayarlayın.
   3. 100-500 msn maruz kalma, 2x2 binning ve 100 kazanç için kamera (Hamamatsu ORCA ER, piksel boyutu 6.45 mikron) ayarlayın.
   4. Görüntü elde etme oranı 1 kare her 10 saniye olarak ayarlayın.

7. ImageJ ile Autophagosome Oluşumu Etkinlikler Montajları oluşturma

[Bu sadece e birleştirilen videoyu tarayarak bir sistematik olmayan bir şekilde yapılabilirilgi delikleri, ama aşağıda belirtildiği gibi o da sistematize olabilir.]

1. 3 (veya 2) açık görüntü yığınlarının ImageJ / Fiji kanalları ele geçirdi.
2. Ilgili kanala, yeşil, kırmızı ve mavi LUT (Arama Tabloları) uygulayın; 3 renk birleştirme ve kaydedin.
3. Analiz sekmesinden, Araçlar> ROI yöneticisi seçin ... > Belirtin, sonra yığının ilk görüntü tanımlanan boyutu rastgele bir alan seçin.
4. Görüntü sekmesinden, yığının seçilen alanı çoğaltmak için, yinelenen seçin.
5. Görüntü sekmesinden, Yığınlar seçin> montaj olun ... içeren geçici bir montaj oluşturmak için tüm kareleri ele geçirdi. Tam autophagosome oluşumu olay için montaj tüm kareleri tarama, olayın ilk ve son kare notlar tutun.
6. Analiz sekmesinden, Araçlar> ROI yöneticisi seçin ... diğer 2 renk için yığının ilk görüntü hem de birleştirilmiş renkleri görüntü için aynı alanı seçmek ve yığınlar yinelenen.
7. To sekmesinde Dosya, Yeni> Görüntü seçeneğini belirleyin ve yükseklik için belirlenen yatırım getirisi yöneticisi kullanarak başlangıçta seçilen piksel, sayısına göre genişliği için belirlenen 4 kez ROI yöneticisi belirlenen yüksekliği artı 3 renk ve arasında boşluk için 3 piksel Her yığın kare sayısı olarak birleştirilmiş ve set Dilimleri.
8. Görüntü sekmesinden seçin Yığınlar> Araçlar> Ekle ..., sonra arasında 1 piksel boşluk bırakarak, üst üste her alt yığın bir takın.
9. Görüntü sekmesinden, Yığınlar seçin> montaj olun ... Bir montaj başlayan ve yakalanan autophagosome oluşumu olayın ilk ve son kare ile biten oluşturmak için.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Protokol açıklanan olarak, dengeli bir şekilde Otofaji indükleyici koşullar altında, GFP ile işaretlenmiş olan DFCP1 ifade eden bir hücre hattı CFP-etiketli LC3 lokalizasyonu takip zaman atlamalı mikroskobu kullanılmıştır. Bu deneyin sonucu 2 serisi veya GFP-DFCP1 ve CFP-LC3 karşılık gelen görüntüler, yeşil bir ve mavi kanaldan biri olan yığınlarının yakalama olduğunu. Daha ileri olarak, protokol bölümünde açıklanan tek autophagosome oluşumu olaylar, karşılık gelen montajı oluşturm...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokolde tarif edildiği gibi bir yöntem autophagosome oluşumu sırasında protein lokalizasyonu görselleştirme sağlar. Biz olaylar, disk konfokal ve Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskopi iplik gelin-tarama konfokal dahil olmak üzere açıklanan görselleştirme çeşitli yöntemler denedim. Biz genel amaçlı standart geniş alan epi-floresan hassasiyet ve çözünürlük arasındaki en iyi dengeyi sağlar bulduk. Bu gürültü, az photo-bleaching/photo-toxicity ve hızlı satın alma için iyi bir...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	41965
OptiMEM I	Invitrogen	31985-062
MitoTracker Red FM	Invitrogen	M22425
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	L-7528
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent	Roche Applied Science	6365787001
22 mm coverslips	VWR	631-0159
35 mm plates	Fisher NUNC	153066
Silicon grease	RS Components Ltd.	RS 494-124
O-rings			Custom made
Attofluor Cell Chamber	Invitrogen	A-7816	Suggested alternative to custom-made O-rings
Microscope	Olympus	IX81	Inverted microscope
Objective	Olympus	UPLSAPO 100XO	N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5
Camera	Hamamatsu	ORCA-R2 C10600 10B	Progressive scan interline CCD
Illuminator	TILL Photonics	Polychrome V	Ultrafast monochromator
Incubation chamber	Solent Scientific	Cell^R IX81
Software	Olympus	SIS xcellence