Senesent Kanser Hücreleri ölçmek için bir Hassas Yöntem

Özet

Yaşlanması önler veya tümörogenez tartışmalıdır teşvik olsun. Kemoterapik ilaçlar senesce için kanser hücrelerinin neden olabilir bu yana, yaşlılık okuyan yeni tedaviler önermek için gereklidir. Ancak, standart ve geniş kullanılan β-galaktosidaz tahlil büyük sakıncaları sunar. Burada yaşlılık ölçmek için hızlı ve hassas akım sitometri bazlı analiz öneriyoruz.

Özet

İnsan hücreleri süresiz çoğalmaya yok. Dış ve / veya iç kuyrukları üzerine, hücreler ölür veya yaşlılık olarak adlandırılan sabit bir hücre siklüs hapsine girebilir. Bu telomer kısalması ve mitojenik onkogenlerin anormal ifadesi olarak çeşitli hücresel mekanizmaları, yaşlılık neden olduğu gösterilmiştir. Yaşlılık normal hücreler ile sınırlı değildir, kanser hücreleri de senesce bildirilmiştir.

Kemoterapik ilaçlar kanser hücrelerinde yaşlanmasının neden olduğu gösterilmiştir. Ancak, yaşlılık engelleyen veya tümörogenez teşvik olmadığını tartışmalıdır. Bunun sonunda hastaya özgü olabilir gibi, kanser hücresi yaşlanmayı değerlendirmek için hızlı ve hassas bir yöntem bir süre gerekli olacaktır.

Bu amaçla, standart β-galaktosidaz deney, şu anda kullanılan yöntem, büyük sakıncaları sunulur: o zaman alıcı ve duyarlı değildir. Burada li yaşlılık çalışma bir akım sitometri bazlı analiz teklifhücreleri ettik. Bu deney, hassas ve hızlı olma avantajına sahiptir, ve çeşitli hücresel belirteçlerin immün akuple edilebilir.

Giriş

Erken altmışlı ve Hayflick ve Moorhead tarafından keşfedilmesinden bu yana, yaşlılık hala bir cep merak ¹ kalır. İnsan hücreleri süresiz yaşlanma ile, Hayflick ve Moorhead yaşlanma hücresel süreci icat, çoğalırlar ve yok. Yaşlanması hücresel ölüme karşı hücrelerin metabolik olarak aktif kaldığı istikrarlı bir hücre döngüsü tutuklama olduğunu. Telomer kısalması, DNA hasarı, kromatin pertürbasyon ve mitojenik onkogenler anormal ifadesi ^2: Bugüne kadar, dört hücresel mekanizmaları yaşlanması neden gösterilmiştir. Bu, normal hücrelere değil sadece göstermekle kalmaz, ayrıca kanser hücrelerinin yaşlanmayı ³ geçmesi mümkündür. Nitekim olarak, yaşlanması geçiren kanser hücreleri daha fazla tümör ilerlemesi ^4-5 için bir engel teşkil gösterilmiştir. Ancak, bazı raporlar artık belirli koşullar altında, hücresel yaşlanma da malignite ^6-7 teşvik edebilir, dikkat çekmişlerdir. Kanser cel bir yaşlılık incelenmesils şu anda kemoterapötik ilaçların in vitro hem de in vivo ^8'de sadece kanser hücrelerinin yaşlanması yol açabilir kullanılan kanser araştırmalarında bir dürtü haline üzere.

Senil hücrelerin varlığını araştırmak için ana tahlil asidik pH değerinde β-galaktosidaz deneyidir. Bu, histokimyasal deney en yaşlı hücrelerdeki meydana lizozomal biogenesizdeki artış gösterir. Kısaca, hücreler uygulanmış ekzojen X-gal, mavi bir renk ⁹ sebebiyet veren, yaşlanmış hücrelerin lizozomlarında zenginleştirilmiş β-galaktosidaz ile yarılır. Mavi ihtiyarlık hücreler daha sonra bir parlak saha mikroskop altında ölçülebilir. Çok popüler olsa da, β-galaktosidaz deney büyük sakıncaları sunulur. İlk olarak, bu tahlil sabit hücreler üzerinde gerçekleştirilir. Bir mikroskop altında yaşlanan hücrelerin oldukça yüksek sayarak yaşlılık derecesini ölçmek için ima çünkü İkinci olarak, zaman alıcıdır. Üçüncü olarak, bu testteyaşlılık ve olmayan yaşlanan hücreler arasındaki ayrım tamamen gözlemci dayanır gibi hassas değildir.

Burada canlı yaşlanan hücrelerin varlığı için değerlendirmek için bir keşfedilmemiş, hızlı ve hassas sitometri bazlı analiz tartışmak. Bu tahlil, bir membran geçirgen molekülünün hidrolizi, 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galaktopiranosid (C ₁₂ FDG) esas alınmaktadır, β-galaktosidaz ile yaşlı hücrelerdeki zenginleştirilmiştir. Hidroliz ve lazer uyarımı sonra C ₁₂ FDG yeşil flüoresan yayan ve bu nedenle akış sitometrisi ^{10, 11} ile tespit edilebilir. Akım sitometrisi ile senil hücrelerin tespit hızlı ve hassas olma büyük bir avantaj sunar. Buna ek olarak, akış sitometrisi ile ihtiyarlık hücrelerin saptanması diğer hücresel markerlerin saptanması ile akuple edilebilir. Bu deney, kemoterapi ile tedavi edilen kanser hücrelerinin bir popülasyon içindeki senil hücrelerin tespit etmek için kullanılabilir ve rutin olarak ayarlanabilirkadar doku kesitlerinde, hücresel ayrışma sonra, klinikte.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. C12FDG bafilomisin A1 ve Hücre Kültürü hazırlanması

1. 20 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde ₁₂ C FDG toz çözülür. -20 ° C'de kısım ve mağaza DMSO uygun emniyet koşulları ile birlikte kullanılmalıdır.
2. 0.1 mM nihai konsantrasyona kadar DMSO içinde bafilomisin A1 toz çözülür. De kısım ve mağaza - 20 ° C Bafilomisin uygun emniyet koşulları ile birlikte kullanılmalıdır.
3. 37,% 10 fetal sığır serumu ve% 1 antibiyotik, ° C,% 5 _CO2 içeren bir ortam içinde, RPMI 8226 hücre hattı ile, ya da bağlı olan veya olmayan diğer hücre hatları geliştirin. Deney için gereken hücre sayısı tahmin. Akış sitometrisi analizi sırasında yeterli sayıda kayıt altına almak için, 5 x 10 ⁵ hücre gereklidir. Yaşlanan hücrelerin yüzdesini belirlemek için, üç hücre örnekleri gereklidir: etiketsiz örnek, tedavi edilmezse hücreleri C ₁₂ FDG ile boyanmış, tedavi hücreleri ile boyandıC ₁₂ FDG.
4. Hücrelerinin hücre çoğalmasını eğrisinin log-faz böylece tohum hücreleri, 24 saat önce bir deney.

2. Yaşlılık indüksiyon

1. Bir kemoterapik madde ekleyerek kanser hücrelerinin yaşlanması neden olur. İlaç konsantrasyonu ve tedavi süresi, test edilen hücre tipi için adapte edilmelidir. Yaklaşık 10 ⁶ hücre / ml 'de bir hücre konsantrasyonu 50 nM doksorubisin nihai konsantrasyonda, 48 saat tedavi ile başlar. (Negatif kontrol) tedavi edilmemiş örnek eklemeyi unutmayın.

3. Bafilomisin A1 Tedavi

1. Önceki adımda kullanılan kemoterapik ilaç hücre apoptoza yol olabilir gibi, tripan mavisi (v / v) ile karıştırılması hücreleri tarafından hücre canlılığı edin. Bir Malassez odasına doldurun ve mavi hücreleri (ölü hücreleri) ve beyaz hücreleri (canlı hücreler) sayısını. Canlılığı yüzdesi en az% 70 olması durumunda, ölü hücreler ayni olabilirsağlamak için uygun bir kiti kullanılarak çekip çıkarılmış ölü hücreleri önyargı sonraki analiz olmaz ki.
2. Kültür ortamı çıkarın ve önceden ısıtılmış taze kültür ortamı ile değiştirin. Bafilomisin A1, 100 nM bir nihai konsantrasyon hücreler ile tedavi. Bafilomisin A1 lizozomlar asidik pH hale getirmek için kullanılır. 37 ° C,% 5 _CO2 'de 1 saat inkübe edin.

4. C ₁₂ FDG Boyama

1. 2 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar önceden ısıtılmış taze kültür ortamı C ₁₂ FDG çözülür.
2. 33 uM'lik bir son konsantrasyonda hücrelere ait bileşik ekleyin ve 37 ° C'de 2 saat inkübe ° C,% 5 _CO2. Yapışmayan hücreler kullanılıyorsa, 4 ° C (hız kullanılan hücre tipi için ayarlanması sahip olabilir), 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj hücreler, PBS ile 2x yıkayın. Soğuk PBS ile 500 ul hücre pelletini. Yapışık hücreleri kullanıyorsanız, ortamı çıkarın ve PBS ile 2x yıkayın. Bir tripsin çözeltisi ve santrifüj kullanarak yapışık hücreler hasat4, 5 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri ° C (hız kullanılan hücre tipi için ayarlanabilir için) olabilir. Soğuk PBS ile 500 ul hücre pelletini. Her iki durumda da, hücre konsantrasyonu yaklaşık 10 ⁶ hücre / ml olmalıdır.
3. Daha ihtiyarlık hücre popülasyonunun, karakterize etmek için bir ko-immün gerçekleştirin.

5. Sitometrisi Analizi

1. Akış sitometresinin üretici tarafından önerilen kontrol boncuklar kullanarak akış sitometresinin kalibre edin. Tüm adımları için, en az 10 ⁴ olaylar kaydedilmelidir.
2. Etiketsiz hücreleri içeren ilk örnek çalıştırın. Iki parametre grafik görüntüleme Forward Scatter Kanal (FSC) karşı Side Scatter Kanal (SSC) hazırlayın. Photomultiplier Tüpler (Proje Yönetim Ekipleri) ayarlayın ve örnek hazırlama sırasında ortaya olabilir ölü hücreleri ve hücresel enkaz faiz hariç bir bölge tanımlar. Günlük ölçekte FL1 gösteren tek parametre histogram Gate ilgi bu bölgedex-ekseni ve y-ekseni olayların sayısını. Olayların sayısı analiz hücrelerin sayısını temsil eder. Etiketsiz hücrelerin x-ekseninin günlük ölçekte ilk on görünür şekilde PMT ayarlayın. Gerekirse hücrelerin otofloresans belirler.
3. Tedavi edilmezse hücreleri içeren ikinci örnek çalıştırın. FL1 (C ₁₂ FDG floresan) gösteren tek parametre histogramda, loş etiketli nüfusun sonra imleci. Bu eşik olmayan yaşlanan hücreleri (loş etiketli hücreleri) ve yaşlanan hücreler (parlak etiketli hücreleri) arasındaki ayrımcılığa izin verecek.
4. Tedavi edilen hücreleri içeren üçüncü örnek çalıştırın. Aydınlık hücreleri etiketli örneğin, senil hücrelerin önceki adımda belirlenen eşik üzerinde görüntülenir. Olaylarının toplam sayısı başına parlak etkinlikleri sayısına bölünmesiyle senil hücrelerin yüzdesini değerlendirmek. Gerekirse, β-galaktosidaz aktivitesi ortalama floresan kullanılarak tahmin edilebilir,yoğunluğu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Multipl Miyelom, bir hematolojik kanser, bir kemoterapik prosedür ile uyarılan yaşlanmayı değerlendirmek için kullanılmıştır. Bir ticari olarak temin edilebilen MM hücre hattı (RPMI 8226) doksorubisin, bir kemoterapik madde ile 2 gün boyunca tedavi edildi yapmak için. Hücreler daha sonra bafilomisin A1 muameleye tabi tutulur ve daha da C ₁₂ FDG ile inkübe edildi. Hücreler akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Şekil 1, senil hücrelerin yüzdesi C ₁₂ FDG kulla...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada canlı kanser hücrelerinin hücresel yaşlanma ölçmek için bir akım sitometri tabanlı bir yöntem sundu. Bu yöntem, zarın geçirgen bileşik, C ₁₂ FDG kullanımına dayanmaktadır, ve bu bileşiğin hücreler tarafından alınır gibi bu nedenle herhangi bir hücre tipinde ve uzun gibi çeşitli tedavilerden sonra kullanılabilir. Hücresel alımı üzerine, C ₁₂ FDG senil hücrelerin lizozomlarında zenginleştirilmiş β-galaktosidaz ile hidrolize edilir. Lazer uyarımı geçtikten...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside	Invitrogen	D-2893
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Bafilomycin A1	Sigma	B1793
Doxorubicin	Sandoz
Trypan blue	Sigma	T8154
RPMI 1640 cell culture medium	Lonza	BE12-702
Fetal calf serum	PAA Laboratories GmBH	A15 101
Antibiotics	Gibco	5290-018
Gallios flow cytometer	Beckman Coulter	A94291