Şiddetli Spinal Kord Yaralanması sonra fibrin ve Büyüme Faktörü kokteyller ile Nöral Kök Hücre Survival ve Farklılaşma Tanıtım

Özet

Büyüme faktörlerini içeren fibrin matrisi tam omurilik kesisi sitelerine aşılı nöral kök hücrelerini korumak için kullanılmıştır. Aşılı hücreler tamamen lezyon boşluğu doldurdu ve uzun mesafelerde konak omuriliğe aksonlarını uzatıldı nöronlar da dahil olmak üzere birden fazla nöral hücre tipleri, ayrışmıştır.

Özet

Nöral kök hücreler (NSC'lerde) kendini yenilemek ve nöronlar ve glia içine ayırt edebilirsiniz. Nakledilen NSC'lerde spinal kord yaralanması (SKY) sonra kaybolan nöronlar ve glia değiştirebilirsiniz, ve bir lezyon üzerinde ve altında omurilik segmentleri yeniden bağlamak için fonksiyonel röleleri oluşturabilir. Nöral kök hücreler aşılama Önceki çalışmalar, spinal kord lezyon boşluğuna içinde eksik greft sağ kalımı ile sınırlı kalmıştır. Ayrıca, greft hücre canlılığı, farklılaşması, ve süreç uzatma izleme optimize olmasaydı. Son olarak, önceki çalışmalarda, kültürlü sıçan NSC'lerde genellikle kader belirli bir hücre tipine sürüldü sürece, yerine nöronların daha yaralı omurilik, aşılı zaman Gliadaki içine ayırt etmek bildirildi. Bu sorunları çözmek için, hatta şiddetli SCI sitelerine NSC'lerde yaşam, entegrasyon ve farklılaşmayı artırmak için yeni yöntemler geliştirdi. NSC'lerde taze yeşil fl eksprese eden stabil bir transgenik Fischer 344 sıçan çizgisinden embriyonik gün 14 omurilik (E14) izole edilmiştiruorescent protein (GFP) ve büyüme faktörlerini içeren bir fibrin matrisi içine gömülü edildi; Lezyon boşluğunda aşılı hücreleri korumak ve hücre yaşamını destekleyen amaçlanmıştır, bu formülasyon. Fibrin / büyüme faktörü kokteylinde NSC'lerde böylece inflamasyon tepe sürelerinin önüne, iki hafta torasik seviye-3 (T3) tam omurilik kesilerde sonra implante edildi. Ortaya çıkan greft tamamen lezyon boşluğu doldurdu ve konak spinal oldukça uzun mesafelerde kablosu ve glia içine aksonlarını genişletilmiş hem de nöronların, ayrışmıştır. GFP ifade kültürlü insan NSC'lerde greft benzer bulgularla sonuçlanmıştır. Bu nedenle, yöntem nöral kök hücre aşılama, hayatta kalmasını ve in vivo bulguların analiz geliştirmek için tanımlandığı gibidir.

Giriş

Spinal kord yaralanması (SKY) genellikle zarar değil sadece internöronlar ve motor nöronların segmental kaybına neden beyne ve sinyaller taşıyan beyaz madde yolları, aynı zamanda merkezi gri madde. SCI sonucu motor ve lezyon altındaki duyusal fonksiyonu hem kaybıdır. Ne yazık ki, yetişkin merkezi sinir sistemi (CNS) kendiliğinden sürekli işlevsel bozukluklarının ^{1 'de} elde edilen, yeniden değildir. Bu nedenle, yaralı yetişkin omurilik ve iyileştirme motor, duyusal ve otonomik fonksiyon yeniden SCI araştırmanın önemli bir hedeftir. Nöral kök hücreler (NSC'lerde), doğrudan embriyonik veya yetişkin CNS izole edip, kayıp nöronlar ve glia değiştirmek için zorlayıcı aday hücrelerdir. Ayrıca, bu hücreler, lezyon Alanı ^2,3 arasında aksonal yeniden iletimi için yeni bir fonksiyonel röleleri oluşturmak için potansiyele sahiptir.

Bugüne kadar, anatomik ayrıntılı bir aydınlatılması, electrophys olmamıştıriological ve ağır yaralanmasından sonra nakledilen NSC'lerde nöronal röle oluşumu davranışsal etkileri. İlk, nakledilen NSC'lerde veya fetal MSS doku geniş lezyon boşlukları içine aşılı zaman kötü hayatta: Bunun birkaç nedeni vardır. Önceki çalışmalar büyük boş kistik lezyon ^{boşluklannın, 4,5} bırakarak, önemli bir erken hücre kaybı göstermektedir. Bazı çalışmalarda aşılanan hücrelerin sonradan bölmek ve lezyon ^{oyuk, 4,5} doldurun, ama bu hafta gün gecikmeden sonra oluşabilir ve sonraki lezyon sitesi dolum tam veya tutarlı olmayabilir olacaktır. İkincisi, hücresel hayatta kalma, farklılaşma / olgunlaşması ve nakledilen NSC'lerde akıbet ses verileri sağlar verimli bir izleme sistemi yoktu. En erken çalışmalar antegrad ve nakilleri ^2,3 dan aksonal projeksiyonlar iz retrograd etiketleme kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu teknikler sadece kısmen ve çoğu zaman açık olmayan işaretli aksonal aşılanmış hücrelerden kaynaklanan çıkıntılar ve izleme yöntemleri vardır subjekimplante hücrelerin ötesine boya sızıntıdan kaynaklanan eserler için t. Diğer gruplar yaralı kemirgen omurilik ^5,6, insan fetal NSC'lerde naklinden sonra aksonal projeksiyonlar etiketlemek için insan spesifik nöronal belirteçler kullanılır. Ancak, bu çalışmalarda, ksenogratflardır sürekli iyi hayatta değildi. Son zamanlarda, GFP raportör genin viral teslim kültürlenmiş NSCs ^7,8 etiketlemek için kullanıldı. Bununla birlikte, GFP ifade genellikle tutarsız ve ^7, aşağı-regüle edilebilir. Son zamanlarda, stabil bir şekilde, raportör geni, GFP veya insan plasental alkali fosfataz ifade eden transjenik fareler ya da donör sıçanların kullanılması önemli ölçüde, in vivo ^9,11 transplante nöral kök hücre / progenitörlerin izleme geliştirdi. Üçüncü olarak, bazı çalışmalar, dokunulmamış ya da yaralı yetişkin omurilik cor ortamına transplante zaman embriyo veya yetişkin ya da CNS türetilen in vitro kültürlenmiş sıçan NSC'lerde sadece glial soy içinde farklılık gösterirBu nöral kök hücreler, yerel ortamlarında kök hücrelerin kaderini belirleyebilir belirten nöronların ve in vitro glial hem de farklılaşma yeteneğine sahip olmasına rağmen d ^7,12,13. Alternatif olarak, kültürlü NSC'lerde, yetişkin CNS türetilmiş özellikle, in vivo ¹³ glial soy içine ayırt etmek için içsel defaulty özelliğine sahip olabilir.

Çünkü yukarıda tartışılan sınırlamaları, bizim grup son zamanlarda ağır yaralı erişkin omurilik embriyonik MGK izleme, hayatta kalma ve farklılaşma / olgunlaşmasını geliştirmek için yeni bir protokol geliştirdi. Kısaca, bizler, in vivo nakli ¹⁴ sonra GFP ifade sürdüren bir GFP raportör geni ifade eden stabil bir transgenik fare Kendilenmiş Fischer 344 hattı ile başladı. Sonra, embriyonik günden itibaren 14 Fischer 344 omurilik, nöronlar ve glia üretmek hem de potansiyelini koruyan bir gelişme aşamasına taze izole NSCs kullanılır. Son olarak, gömülübüyümeyi içeren bir fibrin matriks içine taze ayrışmış NSC'lerde hücrelerini korumak ve eşit greft hücre yaşama, farklılaşma ve entegrasyonu desteklemek amacıyla, büyük bir lezyon boşluğuna içinde onları dağıtmak için ^15-17 faktörleri. Greftler T3 tam Transeksiyon, omurilik yaralanması sonrası iki haftalık sitelerine yerleştirildi. Bu aşılı hücreler sürekli tam transeksiyonu siteleri dolu ve uzun mesafelerde ¹⁸ üzerinden barındıran omurilik içine akson çok sayıda genişletilmiş bol nöronların içine farklılaşmış. Benzer sonuçlar bağışıklık-eksikli fareler ¹⁸ kültürlenmiş insan nöral kök hücre nakli kullanılarak elde edilmiştir.

Protokol

Tüm hayvan protokoller VA-San Diego Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Laboratuvar hayvan bakımı ve güvenliği için NIH kurallar sıkı takip edilir. Hayvanlar, çalışma boyunca gıda ve suya serbest erişimi vardır ve yeterli ağrı ve rahatsızlık en aza indirmek için tedavi edilir.

1.. Fibrin Bileşenleri hazırlanması Büyüme Faktörü Kokteyller İçeren

1. (Malzemeler tabloya bakınız) 50 mg / ml 2x stok çözelti elde etmek için 0.5 ml PBS içinde 25 mg fare fibrinojen çözülür. Fibrinojen çözünmesi zor olan ve bir 37 ° C su banyosu veya inkübatör içine yerleştirildi ve 1-2 saat boyunca her 5-10 dakikada çalkalanmalıdır.
2. 50 U / ml 2x stok çözelti elde etmek için 10 mM steril _CaCl2 içinde 2 ml 100 BM sıçan trombin çözülür.
3. 100 ul stok solüsyonu elde etmek için, aşağıdaki konsantrasyonlarda PBS içinde çözülür büyüme faktörleri: 1 mg / ml: BDNF; In vivo intratekal infüzyon olarak NT-3 (yüksek stok konsantrasyonu ^{19); 200 ug / ml: GDNF; IGF; bFGF; EGF; PDGF; aFGF; HGF (hücre kültürü için kullanılan yaklaşık 1000 x daha yüksek).}
4. 50 mM DMSO stok çözelti elde etmek için 1.3 ml DMSO'da 25 mg MDL28170 (kalpain inhibitörü) çözülür ve daha sonra 1 mM stok çözeltisi elde etmek için PBS içinde 50x seyreltin.
5. 1000 ul büyüme faktörü kokteyl çözeltisi (Şekil 1) üretilmesi için her büyüme faktörü bileşenin 100 ul ve MDL28170 (1 mM stok çözelti) 100 ul karıştırın.
6. -70 ° C de depolama için 10 ya da 20 ul içine büyüme faktörleri ve kısım içeren 25 mg / ml fibrinojen çalışma çözelti elde etmek için 500 ul büyüme faktörü kokteyli ile 500 ul 2x fibrinojen stok solüsyonu karıştırın Çözelti, -70 ° C'de 12 aya kadar stabildir
7. Benzer şekilde, depolama a benzer 10 veya 20 ul hacimleri içine büyüme faktörleri ve kısım içeren 25 U / ml trombin çalışma çözüm elde etmek için 500 ul büyüme faktörü kokteyl ile 500 ul trombin 2x stok çözüm karıştırmakt -70 ° C için 12 aya kadar.
8. Hücrelerle karıştırılır kadar aşılama gününde, buz üzerinde fibrinojen ve trombin içeren büyüme faktörü kokteyl yerleştirin.

2.. T3 Omurilik Kesisi

1. Olarak kabul edilebilir bir yöntem kullanılarak yetişkin dişi Fischer 344 fareleri veya atimik çıplak sıçan anestezisi. Kuyruk ve pençe tutam yanıt tamamen yok olduğunda Konular derin anestezi uygulanır. Not: tipik haliyle 150-200 g Fischer sıçan ya da 180-220 g atimik sıçan ve ketamin anestezisi bir kokteyl (2 ml / kg) (25 mg / ml), ksilazin (1.3 mg / ml) ve asepromazin (0.25 mg kullanın / ml).
2. Hayvanlar anestezi altında iken kuruluk veya gözlerde yaralanmayı önlemek için göz merhemi sürün.
3. Üst torakal bölgeyi tıraş ve Betadine ile cildi temizleyin.
4. , # 15 bıçak kullanarak cilt ve kas kesmek cerrahi ekartör kullanılarak T3 vertebra maruz ve bir rongeur kullanarak T3 / 4 omurilik maruz T3 vertebra bir laminektomi gerçekleştirmek.
5. Bir lon yapın11. Bir bıçak kullanılarak yaklaşık olarak 2 mm uzunluğunda, dura içinde gitudinal orta hat kesimi.
6. Sağ lateral tüm omurilik kesmek için dura altına iridektomi makas yerleştirin. 1.5 mm daha fazla cadually aynı tarafta başka bir kesim olun.
7. Orta şiddette vakum bağlı bir künt 23 G iğne ile iki kesim kesimleri arasındaki aspire omurilik dokusu. Ventrale ve yanal tamamen kesilmesini sağlamak için görsel doğrulama kullanın. Bu yanal Hemiseksiyon tamamlayacak.
8. , Tam genişlikte omurilik kesisi için lezyon uzatmak sol hemicord içine ayna kesiler yerleştirmek için. İki hafta sonra aşılı zaman lezyon sitede firma greft / fibrin matrisi korumak için, ilk kesim dışında, sağlam dura bırakmak deneyin.
9. , Kas dikin antibiyotik tozu ve elyaf deri uygulanır.
10. Laktatlanmış Ringer (3 mi) enjekte edilir, Bannamine (2.5-5 mg / kg) ve ampisilin (80-100 mg / kg) ameliyattan hemen sonra ve mai (Malzemeler tabloya bakınız)sıcak bir inkübatör ntain fareler thermoregulation yeniden kuruluncaya kadar.
11. Mesane boşaltın ve (Şekil 1B) boşalma refleks mesane kurulana kadar yaklaşık iki hafta boyunca günde iki kez Ringer ve Ampisilin çözüm enjekte.

3.. Taze Disosiye Embriyonik Günü Hazırlık 14 Omurilik Sinir Kök Hücre

1. Kendilenmiş transgenik GFP F344 sıçan Rat Kaynağınızdan (F344-Tg (UBC-EGFP) F455Rrrc) ve Araştırma Merkezi, University of Missouri edinin.
2. 40 ug des-Gly ¹⁰ enjekte edilir, [D-Ala ^6]-lötenize edici hormon sonra 2 200 'lik bir konsantrasyonda ug / olgun dişi fare (8 hafta veya daha büyük) başı (IP) intraperitonal ml' de PBS içinde seyreltilmiş etilamid hormon (LHRH) Releasing Embriyo toplama senkronizasyonu için -3 saat ışık indüksiyon.
3. 4 gün enjeksiyonundan sonra olgun bir GFP homozigot veya heterozigot erkek sıçan gecede çiftleşmek.
4. Gün 13,5-14,5 postcoitus embriyolar toplamakYa da bir floresan mikroskop - soğuk HBSS tamponu (pc), bir "NightSea" el feneri ve filtre gözlük (BlueStar El feneri ve Model VG1 bariyer filtre BLS1) altında GFP ifade inceleyin.
5. Her GFP pozitif fetus aseptik omurilik incelemek ve örten meninks ve iridektomi makas ve ince forseps ile bağlı spinal ganglionlar kaldırın.
6. 15 ml cornical tüp içinde 2 ml soğuk HBSS tampon içine disseke omurilik toplayın ve buz üzerinde tutmak.
7. Disseke omurilik ayırmak için referans # 20 izleyin:
   1. Kısaca, (birkaç kabloları 1 kablosu, bir öznenin graft için yeterli hücreleri oluşturabilir birlikte sindirilebilir) parçalara ayrılmış omuriliklerden kablolarını içeren tüpe% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve 2 ml, 10-12 dakika boyunca 37 ° C 'de özet.
   2. Tüp ve santrifüj 2 dakika boyunca 2500 rpm'de doku için% 10 FBS ihtiva eden DMEM içinde 10 ml ilave etmek suretiyle reaksiyonu durdurun tripsin.
   3. 2 mi, Neuro temelli vasat co doku yeniden süspanse% 2 B27 ntaining, ve giderek daha küçük yangın cilalı Pasteur pipetlerini kullanarak omurilik dokusu çiğnemek.
   4. Santrifüj, bir 40 mikron hücre filtre süzgeci ile 2 dakika, B27 içeren, Neuro temelli vasat 2 ml tekrar süspansiyon ve filtre hücreleri için 2500 rpm'de hücreler.
8. Bir hemositometreyle ile hücrelerin sayısı ve eşit iki Eppendorf tüpleri içine hücreleri bölmek.
9. Hücreleri santrifüj ve tamamen süpernatan (1-2 dakika düşük vakum ucu ile tüm süpernatant geri gerekmektedir) bu nedenle büyüme faktörü kokteyl hücre yeniden süspansiyon sonra kalan yüzer seyreltilir olmayacaktır.
10. (Yaklaşık ⅓ son hacim için, hücre topağı kere) 250,000 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda, büyüme faktörleri, ihtiva eden fibrinojen ya da trombin çalışma çözeltisi içindeki hücrelerin her yarım yeniden süspanse edin ve (Şekil 1A), transplantasyon öncesinde buz üzerine yerleştirin. Hücre ile karıştırıldığında bu fibrinojen kendiliğinden jel Nots lezyon / greft yerinde trombin ile birleştirerek önce; erken jelleşmeye önlemek için hemen in vivo hücre aşılanma öncesi fibrinojen hücreleri karıştırın.

4. Transplantasyon

1. İki hafta sonra, omurilik transeksiyonu lezyonlu T3 / 4 omurilik Reexpose.
2. 5 ul fibrinojen-hücreleri ve 5 ul trombin hücreler, doğrudan doğruya lezyon yerinin yeniden açmadan kapalı yara dokusu ve sağlam dura boyunca lezyon yerinde dokuz nokta enjekte edilebilir.
3. Merkezde 3 (orta noktasında bir ve lateraller iki ve birbirinden 0.5 mm aralıklı) ve rostral hem de 3: skar dokusu ve bozulmamış dura 1-2 hafta sonrası lezyon yüzeyindeki 9 delik oluşturmak için bir 27 G iğne kullanın ve kaudal arabirimi (lezyonun merkezinde yaklaşık 0.5 mm ya da rostral kaudal) içerisinde 3.
4. Sonra rostral arayüzü ve sulu 3 puan içine lezyon yerinde ve çeyrek hacminin üç merkezi noktaları içine fibrinojen hücre çözümü yarım hacim enjektekaudal arabirimi 3 noktalara uarter hacmi.
5. Sonra hemen aynı noktalar içine throbmbin hücreleri enjekte. Fibrinojen hücreleri ve lezyon site içindeki trombin hücrelerinin karışımı, lezyon yerinde tutmak için hücreler içine fibrin jel oluşturur ve büyüme faktörü kokteyller hücrelerin hayatta kalma destekleyecektir. Hücreler, Picospritzer (Genel Valve, Inc) bağlı çekilmiş bir cam pipet ile enjekte edilir.
6. Transplant kültürlenmiş insan NSC'lerde, yukarıda tarif edilen aynı prosedür ²¹ ve insan reaktifler yapılmış fibrin ve büyüme faktörü kokteyller kullanın.

Sonuçlar

GFP immünohistolojik etiketleme aşılı fare NSC'lerde yalnızca lezyon / ana kenar ekleme olmadan boş lezyon yerinde en bırakarak, T3 transeksiyonu sitedeki kötü hayatta fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) (a fibrin matrisi ve büyüme faktörleri içermeyen) içinde yeniden süspansiyon haline gösteriyor aşılanmış hücreleri (Şekil 2A). Yalnız fibrin matrisler ile birlikte aşılı zaman NSC'lerde hayatta kalma geliştirilmiş, ancak greft tamamen büyük bir lezyon boşluğu (veriler ...

Tartışmalar

Yaralı omurilik MGK nakli için önemli engellerden biri lezyon merkezinde yoksul hayatta kalabilmek. Lezyon yerinde herhangi bir boşluk veya boşluklar potansiyel olarak azaltmak veya supraspinal akson ve yaralanma altında ayrılmış spinal kord segmentleri arasında fonksiyonel nöronal röleleri oluşumunu zayıflatabilir. Ek olarak, aşılanmış NSC'lerde zayıf yaşama konak doku ile entegrasyonu etkiler ve bu nedenle ana nöronlar ile aşılanmış nöronların bağlantı azaltabilir. Hücre kaybını aç...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibrinogen (rat)	Sigma	F6755-25MG	2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml
Thrombin (rat)	Sigma	T5772-100UN	Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml
bFGF (human)	Sigma	F0291 (25 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
EGF (murine)	Sigma	E1257 (0.1 mg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
BDNF (human)	Peprotech	452-02 (1 mg)	Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl
NT-3 (human)	Peprotech	452-03 (1 mg)	Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl
GDNF (rat)	Sigma	G1401 (10 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
IGF-1 (mouse)	Sigma	I8779 (50 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
aFGF (human)	Sigma	F5542 (25 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
PDGF-AA (human)	Sigma	P3076 (10 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
HGF (human)	Sigma	H9661 (5 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
MDL28170	Sigma	M6690 (25 mg)	Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM
PBS	Millipore	BSS-1005-B	Stock Concentration: 1x Final Concentration: 1x
DMSO	Sigma	D2650
Ketamine	Putney	26637-411-01	40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml
Xylazine	Lloyd	0410,	2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 5.8 mg/ml
Acepromazine	Butler	003845	0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml
Betadine	Healthpets	BET16OZ
Ringers	Abbott	04860-04-10	2-3 ml/inj
Banamine	Schering-Plough	0061-0851-03	2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml
Ampicillin	Sandoz	0781-3404-85	80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml
LH-RH	Sigma	L4513	200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml
HBSS	Gibco	14175-096
Trypsin	Gibco	25200056	Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 %
DMEM	Gibco	11995073
FBS	Gibco	16000044	Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 %
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
B27	Gibco	17504044	Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x
Note, use human reagents for grafts of human NSCs