Çoklu Tümör Belirteçleri Hedefleme için Polymalic Asit bazlı Nano Biopolymers: Kişiselleştirilmiş Tıp için Bir Fırsat?

Özet

Polymalic asit bazlı bir nano ilacın bir örnek kanser için de geçerlidir kişiye tıp rasyonel tasarım karşı sunulmuştur. Bu, bir çıplak fare Her2-pozitif insan meme kanseri tedavisi için bir nano ilacın sentezini tarif eder.

Özet

Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this diversity, personalized medicine is developed for silencing malignancy associated genes. Nano drugs fit these needs by targeting tumor and delivering antisense oligonucleotides for silencing of genes. As drugs for the treatment are often administered repeatedly, absence of toxicity and negligible immune response are desirable. In the example presented here, a nano medicine is synthesized from the biodegradable, non-toxic and non-immunogenic platform polymalic acid by controlled chemical ligation of antisense oligonucleotides and tumor targeting molecules. The synthesis and treatment is exemplified for human Her2-positive breast cancer using an experimental mouse model. The case can be translated towards synthesis and treatment of other tumors.

Giriş

Kanser genomları (Biyoteknoloji ve Kanser Genom Atlası için Ulusal Merkezi) sökülmüş edildiğinde post-genomik dönemde kanser gelecekteki tedavi genellikle aynı tümörün ^1-4 içindeki tümörlerin genetik çeşitliliği için hesap verecek. Biyoinformatik ve pahalı, hızlı değil DNA dizileme sağlayan bir kişisel düzeyde ^2,4,5 malign genler / mutasyonların edinimi. Genler tespit edildikten sonra, hasta malign genlerin ⁶ kendi ifadesini değiştirmek veya susturmak için kişiselleştirilmiş tıp ile tedavi edilecektir. Kanser hücrelerini hedeflemek ve bu hücrelere ilaçlar sağlamak için ihtiyaç işlevli verme sistemleri gerektirir. Açıkçası, nano ilaçlar bu gereksinimi ^7. karşılayabilir.

Keşifler kabaran dalgası olarak nanopartiküller kemoterapötik ilaçlar, proteinler ve / veya kanser hücrelerinin genetik olarak aktif madde yükleri getirmek için uygun olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, yan etkiler reklam olmaya devamgiyinmiş. Biyodegradasyon yokluğunda ilişkin Bunlardan biri hastalıkları kışkırtmak için bir olasılıkla, sağlıklı doku ve organlarda malzeme birikimi neden olabilir. Birikmesini en aza indirmek için, non-toksik ve non-imünojenik polymalic mikrobiyal kökenli olan asit ve _H2O ve _CO2 ile ⁸ biyolojik tanıtıldı. Biz nano ilacın bir all-in-one kovalent tipi sentezlemek için polimer kullanın. Bu tür temozolomid, doksorubisin, veya antisens oligonükleotit ve ekstravazasyonu, doku hedefleme endosomolitik teslim veren fonksiyonel gruplar kimyasal olarak bağlı, kemoterapi içerir. Bu sayede tam farmasötik aktivitesi yenileyici, hedeflenen tümör hücresinde geldi ilaçlar özünde nano platformdan ayrılmaktadır.

Biz, polimer nano platformun mikrobiyal üretim yöntemi, onun arıtma ve kanser için Trastuzumab (Herceptin) içeren nano ilacın kimyasal sentezini tarifHER2 aşırı engellenmesi için hedefleme ve bir antisens oligonükleotid. Çıplak fareler üzerinde ksenogenik insan Her2-pozitif göğüs kanseri için nano ilaç uygulama olarak, kanser tedavisi, yüksek verimlilik sergilemektedirler. Polymalic asit nano ilaçlar için burada sunulan tümör hedefleme ve gen susturma ilkeleri diğer kanser vakalarının tedavisinde uygulanabilir.

Protokol

Tüm deneyler in vivo yapılan ve IACUC protokolleri ile tam bir uyum içindedir cerrahi ve cerrahi olmayan prosedürler dahil olmak üzere resmi hayvan yönetmeliklere uymak.

Polymalic asit 1. Biyoüretim

1. Agarda kürelerin bir tohum kültür büyütün ve kuvöz ve bazal kültür ortamı ^8,9 belirtti Termo bir 25 ° C ile 100 ml kültür ortamına Plasmodia aktarmak.
2. Sporlanmasını önlemek için ışık altında hariç ağırlık dolu 500 ml mikro plasmodium bir miktarda üretir.
3. 10 L biyoreaktör kap içinde 8 L bazal ortam içinde süspansiyon haline getirilmiş 80 g CaCO ₃ hazırlayın. Monte edilmiş reaksiyon kabına 500 ml dolu mikro plasmodia aktarılır ve 25 ° C'de süzüldü, hava ve bir kademeli karıştırıcı ile 150 rpm karıştırma 10 L / dakikalık bir akış hızı ile 75 saat boyunca bio-işleme izin verir.
4. Kültür suyu PMLA üretim sonunu gösteren pH 4.8 olduğunda sonlandırma ve t ile PMLA içeriğini ölçmekO / Fe (III) deneyi hidroksamat.
5. 17 ° C'ye soğutun ve suyu hücreler yer çekimi ile yerleşmeye izin verir.
6. 4 ° C'ye kadar soğutulur ve pH 7.5 'e ayarlayın, 2 M NaOH kullanın. (5 ° C'de 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 ile dengelenmiş DEAE iri taneli,) üst yönde alt DEAE-selüloz 1.5 L ile doldurulmuş bir sütun üzerinden süpernatantı Pompa.
7. Yukarıdan aşağıya doğru bir yön değişiminden sonra 0.3 M NaCl ihtiva eden tampon 3 sütun ile yıkanır ve 0.7 M NaCl mevcudiyetinde PMLA elute.
8. 0.1 M _CaCl2 ayarlayın ve% 80 buz soğuk etanol ile PMLA-Kalsiyum hızlandırabilir. , 50 kDa ve tuz tamponu yokluğunda su kullanımı - 300 kDa, - 50 - 80 kDa ve 10 ila 80 arasında PMLA-kalsiyum içine Sephadex G25 üzerinde paylarına ayırmaktadır.
9. Bir Amberlite IR 120H ⁺ kolonu üzerinde her fraksiyonu geçmek ve liyofılizasyondan hemen sıvı azot içinde-akış polymalic asit dondurma.
10. Kuru aseton içerisinde çözülür. Filtre işleminden sonra çözücü madde ortadan kaldırmakEksi 20 ° C sıcaklıkta kuru hava akımı, Lyophilize ve mağaza

2.. Polymalic asit bazlı Nano İlaç sentezi

1. Susuz aseton, 1 ml ve 2 mi dimetil formamid (DMF) içinde 1 mmol N-hidroksisüksinimid ve 1 mmol disikloheksil karbodiimit PMLA in-H ve 116 mg (1 mmol malyl birimleri) karıştırılarak PMLA (P) karboksil grubu aktive. 3 saat boyunca 20 ° C'de karıştırın. MPEG _5000-NH2 0.05 mmol trietilamin (TEA), ardından 1 ml DMF (malyl birimlerinin 0.05 mol%) of 0,05 mmol ekleyin.
2. Akıllı DMF 0.4 mmol lösin etil ester (LOEt) (malyl birimlerinin% 40 mol) içinde çözülmüş, damla ekleyin 0.1 mmol 2-tiyol-1-etilamin (2-MEA) (malyl birimlerinin% 10 mol) ve 0.5 mmol TEA, her DMF. Her eklemeden sonra, 1 saat izin ve cevap (ince tabaka kromatografisi, TLC) ninhydrin negatif reaksiyon tarafından tamamlanması için kontrol edin.
3. Fosfat tamponlu tuzlu su (30 dakika, pH 6.8) ile kendiliğinden hidroliz ile kalan NHS-ester çıkarmak mı. PD üzerinde Desalt-10 Kolon liyofilizasyon beyaz bir toz olarak "preconjugate" elde edilir. Eksi 20 ° C'de saklayın kuru
4. 100 mM sodyum fosfat, 150 mM NaCI, pH 5.5 içinde 4.5 ml 30 mg antikor (mAb, IgG2a-κ) çözülür.
5. 5 mM tris (2-karboksi etil) 20 ° C'de 30 dakika boyunca fosfin hidroklorür ile disülfıt bağlarını azaltır ve PD-10 sütun üzerinde saflaştırılması.
6. Aynı tampon, 2 ml Mal-PEG _3400-Mal çözülür ve 10 ml'lik son hacminde, indirgenmiş mAb ekleyin ve 4 ° C'de gece boyunca karışmaya Vivaspin 20, dışlanma 30 kD üzerinde 2.5 ml Konsantre ve Sephadex G75 üzerinde arındırmak. Sn-HPLC ürün üzerinde doğrulamak ve fotometrik 280 nm dalga boyunda miktarını ölçmek.
7. Mal-PEG-Mal-mAb atfetmek için "preconjugate" P / PEG ₅₀₀₀ (% 5) / LOEt (% 40) / mAb (% 0,2) / 2-MEA (% 10) elde etmek tioller. , Yukarıda belirtilen pH 5.5 tamponu içinde 50 mg (P / mPEG ₅₀₀₀ / LOEt/2-MEA) 200 nmol mAb-PEG _3400-Mal 5 ml karıştırılarak yapın sulfhy konsantrasyonunu ayarlamak2 mM Dryl ve 3 saat (verim% 98) 20 ° C'de inkübe edin.
8. Çözünürleştirilir 3'-H ₂ N-AON DMF / PBS ninhidrin testi (1:1 v / v) DMF / metanol ((pH 7.2) ile reaksiyona N-süksinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP) ) ve daha sonra su ve Lyophilize olarak, metanol içinde Sephadex LH20 üzerinde AON-PDP-saflaştırılması.
9. Disülfid değişim reaksiyonu sona kadar gece boyunca yukarıda hazırlanan Mal-PEG _{3400-Mal-mAb-preconjugate} ile pH 5.5 tampon maddesi içinde 800 nmol aktif AON inkübe edin.
10. Dahil floresan Alexa Fluor 680-maleimid polimer-2-MEA-SH ile tioeter oluşturur. 3-piridilditio-propiyonat (PDP) ile aşırı SÜLFİDRİL Blok ve Sephadex G75 üzerinde arındırmak. 4 ° C'de saklayın ya da daha fazla, kullanılıncaya kadar -80 ° C'de donduruldu.

3.. Tahliller ve Özellikleri

1. Sek-HPLC analizi ile, 4 ° C ve 37 ° C de bir saflığa ve stabiliteye PBS içinde ve serum için testler yapın. Molec olarak polistiren sülfonat kullanınular ağırlık standartları. Nano boyut dağılımı ve zeta-potansiyelleri ölçün. Ticari sistemleri kullanın.
2. 320 ul örnek 10 ul% 160 (ağırlık / hacim) hidroksil amonyum klorür ve% 10 NaOH 160 ul (w / v) ilave edin. 10-15 dakika sonra, (w / v) Fe (III) Cl ₃ 12,% 5,% 160 ul ile karıştırmak (v / v) ve hidroksamat HCl / Fe ₅₄₀ A oku (III). PMLA 1 mg / ml PMLA 2,5 A ₅₄₀ tekabül varsayarak hesaplayın.
3. 110 ° C 'de 2 M HCI içinde gece boyunca nano ilaç hidrolize örnekleri değini ile ters faz kromatografi ile ilgili deney malik asit, malik asit standartları eklendi. 100 mM ditiotreitol ile nano ilaç ayrılması ve morfolino AON standartlarına karşı kantitatif ters fazlı HPLC ile Morfolino-AON ölçer.
4. Bölünme olmaksızın nano ilaç almak ve protein analiz kiti kullanılarak antikor ölçmek. Amonyum ferrothiocyanate ile reaksiyonunu izin vererek mPEG'in ölçmek, sonra kloroform ile ayıklamak ve 510 nm dalga boyunda ¹⁰ absorbans okundu .
5. Iyi antikor aktivitesini ve colligation test başına nano ilaç (1-10 ug mAb) 5 ul ELISA gerçekleştirin. Plaka kaplanmış antijenler peroksidaz-birleştirilmiş ve sekonder antikor olarak, sırasıyla, 0.5 ug / oyuk transferin reseptörü ve HER2 kullanın.
6. (Örnekler Tablo 1 ve Tablo 2) malik asit (% 100) ile ilgili AON, mPEG'e ve mAB'nin elde% hesaplamak ve tasarımı ile amaçlanan% ile karşılaştırın.

4.. In vitro test

1. (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5 - - (3-karboksimetoksifenil) -2 - (4-sülfofenil sarı bir reaktif [3 azaltma etkinliği zaman içinde yaşamda kalan hücrelerin kanser hücreleri ve kültürlenmiş bir ölçü ile nano ilaç inkübe )-2H-tetrazolyum, iç tuz] (MTS), bir mavi boya ve bir fotometre ile göreceli absorbansını. Kit tedarikçi tarafından yönergeleri izleyin.
2. In vitro ya da Western blot analizi için ex vivo hücre ekstreleri hazırlayın. Buz çıkarma b kullanınSDS ve proteaz inhibitörü kokteyli içeren uffer. SDS-poliakrilamid jel elektroforezi azaltarak ayrı proteinler.
3. Numune ekstrelerinde ilgi proteinler için western blotting yapın. Alkalin fosfataz konjuge sekonder antikor kullanın.
4. Floresan etiketleme kullanarak hücre alımını ve nano ilaç polimer platformu, AON ve Endozomlar co-lokalizasyon göstermek için konfokal mikroskopi kullanın. Floresan etiket olarak AON için nano konjuge platformu ve Lissamine için Alexa Fluor 680 takın. Etiketlenmiş moleküllerin dağılımının görselleştirmek için bir mikroskop 5X spektral tarayıcı ve oturma kanser hücrelerini kullanma
5. Leke endozom Stiril Kırmızı floresan boya ile membranlar ve endozom ko veya salınımını göstermektedir.

5. In vivo test

1. Insan HER2-pozitif meme kanseri fare modeli (: Cr: (MCr)-Foxnnm çıplak fare Tac) hazırlayın. Pelet salan bir 0.72 mg 17β-estradiolu takın (90-gün release) subcutaneously her fare boyun.
2. Daha sonra deri altından sağ böğrüne 1 x 10 ⁷ BT-474 tümör hücresinin enjekte edilmesi ve tümör büyümesine izin.
3. Tümörler, kuyruk damarına her bir antikorun 2.5 mg / kg AON ve / veya 4.5 mg / kg ihtiva eden 150 | il nano konjugat püskürtülmesiyle boyutunda 120 ^mm3 olduğunda tedavi başlatın. Tedavisi için, haftada iki kez toplam altı kez enjekte.
4. Iki zayıf çap pergeli ile tümör boyutu ölçülür ve formülün (uzunluk x genişlik x derinlik) x (π / 6) kullanılarak hacimlerini hesaplamak. 2 hafta son enjeksiyondan sonra servikal dislokasyon Ketamin ve Deksmedetomidinin çözeltisi ile sedasyon sonra hayvanlar Euthanize.
5. Morfolojik değerlendirme için H & E ile tümörleri ve leke bölümleri izole.
6. Bir hayvan ölçekte ilaç dağıtım değerlendirmek için, bir flüoresan görüntüleme sistemi kullanır. 24 ve 48 saat sonra Alexa Fluor 680 etiketli nano ilaç ve resim enjekte edilir.
7. Hayvan Euthanize ve Fluor tespitizole edilmiş perfüze edilmiş ve tümörler ve organlarda Escence.

Sonuçlar

HER2 reseptör ifadesini susturma ve ^HER2-12, sinyal bloke insan HER2-pozitif meme kanserinin engellenmesi

Strateji

Insan göğüs kanseri farklı biçimleri arasında, HER2-pozitif tümör kötü klinik sonuçları vardır. Biz, çıplak fare modelinde insan HER2-fazla sentezleyen meme kanserinin başarılı bir şekilde tedavi sunar. Bu strateji, reseptörün HER2-mRNA bağımlı sentezi (Şekil 1) bloke edilmesi için Herceptin ve HER2 özgü AON kullanılarak HER2 sinyal yolunun hemen susturulması hem de aktif olan nano ilaç içerir. Herceptin ve anti-HER2 AON talebi içeren nano konjugatı birlikte Herceptin veya AON'in ya yoksun olan iki kontrol grubu ile, Şekil 3 'de gösterilmiştir. Kurşun bileşik bir uçtan bir uca transsitoz aktif ekstravazasyonunu ulaşmak için anti-MsTfRmAb içeriyorduöf tümör damarlarının TfR endotelyal hücre. Tümör içine çok daha az alım antikorun yokluğunda not edildi ve tümör etkisine bağlı EPR ¹³ atfedilmiştir. Alexa Fluor 680 ihtiva eden nano konjugatların Floresan versiyonları görüntüleme çalışmaları için sentezlendi.

. HER2-pozitif meme kanseri hücrelerine AON teslimat ve tümör büyümesi inhibisyonu Şekil 1 mekanizması sol üst köşe:. Nano konjuge Şekil 3 uyarlanmıştır. Sol alt köşesi: yüzeyinde TDH ifade Fare tümör damarları. Nano ilaç reseptörüne bağlanan ve transsitoz ile tümör girer. Buna ek olarak, tümör erişimin bir dereceye tümöründe bağımlı gelişmiş alımını ve retenti katılma düzensiz endotel katmanları ile mümkündür(EPR) ^13. Daha sonra, nanodrug insan kanser hücreleri üzerinde ifade HER2 bağlanan ve erken endozomlar içine içselleştiren. Bağlama da bloklar HER2 sinyal yolu. Endozomların olgunlaşması ve asitleştirildikten sonra, nano ilacın endozom kaçış mekanizması devreye girer. Nanodrug sitoplazmasına giren disülfid ara parçasının redüktif klivajı ile nano platformu salınır ve HER2-sentezini bloke HER2-mRNA'ya bağlanan edilir. Sentezinin bloke edilmesi HER2-sinyal bloke uzanır ve tümör büyümesi inhibisyonu neden olur.

Polymalic asit platformun mikrobiyal üretimi

Nano eşlenik platformu polymalic asit (PMLA), kültürlenmiş Physarum polycephalum arasında microplasmodia ve Protokol tarif edilen ve Şekil 2'de gösterildiği gibi, sıvı kültür ortamından saflaştırılır üretildi. Üretim ve arıtma için düzgün ve tekrarlanabilir. Bu Devam için önemli olduğunu rol zaman, pH ve polimer kendiliğinden bölünmesini önlemek için sıcaklık. Dikkatli yıkama ve DEAE-sütun elüsyon DNA, karbonhidrat, toksinler ve renkli malzemenin çıkarılması için tavsiye edilmektedir. Aşırı saflık, susuz aseton içinde eritilmesi ve çözünmeyen malzemenin ayrılması sonra elde edildi. Üretilen PMLA toplam tutarı kampanya başına 5 ± 1 g idi. 1.5 ± 0.5 g miktarları çok 10 L biyoreaktör kullanılıyorsa 80,000-100,000 tekrarlanabilir elde edilmiştir _w M PMPLA arıtıldı. Sec-HPLC elüsyon profilleri simetrik idi. Sayısal dağılımının göre dinamik ışık saçılı analizi 8 ± 1 nm'lik bir hidrodinamik çapına karşılık gelen bir tek tepe ve PDI polidispersite endeksi = 0.10 ± 0.02, kabul küresel parçacıklar için alet kullanılarak hesaplanır gösterilir. Zeta-potansiyeli olduğunu -22 ± 2 mV (pH 7.5).

/ 50668/50668fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 2,. Üretimi ve (Lee et al. ⁹ uyarlanmıştır) Physarum polycephalum içinde kültürlenmiş mikro plasmodium ikinci polymalic asidin saflaştırılması. Polymalic asit (PMLA) bir biyoreaktör içinde Physarum polycephalum arasında plasmodium üretilen ve anyon değiştirici (DEAE) bağlayıcı ile kültür süpernatanından toplanır. Yıkama sıvısı kalsiyum tuzu olarak etanol-çökeltilir. Kalsiyum tuzu çözeltileri Sephadex-G25 fazla Mw-fraksiyonlanır. PMLA ihtiva eden fraksiyonlar Amberlite IR-120H ⁺ fazla asit içine Ca-tuzuna dönüştürülür. Serbest PMLA son olarak kuru beyaz bir toz elde etmek üzere liyofilize edilir.

Kurşun nano konjügatın kimyasal sentezi

P / mPEG _5.000 (% 5) / LOEt (% 40) / AON (% 2.5) / Herceptin (% 0,2) / a nti-MsTfRmAb (% 0,2)

Kurşun nano ilacın ve iki ön-madde nano konjugatlarının şematik yapısı Şekil ure 3 'de gösterilmiştir. Ön AON _HER2 veya Herceptin antikor ya da eksikliği için tasarlanmış iken kurşun, tüm bileşenleri içerir. AON'in mAbs ve yanı sıra, bileşikler, plazma proteinlerine bağlanma en aza indirmek için, polietilen glikol, bir mPEG'in ₅₀₀₀ içeren, enzimatik bölünme ile retikülo-endotelial sisteme (RES) ve bozulma ile çekme. Antisens dizisi 5'-CAT-GGT-GCT-CAC-TGC-GGC-TCC-GGC-3 'Her2 mRNA'ya tamamlayıcı olan ve dikkatli bir şekilde HER2 bloke karşı yüksek özgüllük elde etmek için çeşitli HER2-ifade eden hücre hatlarında in vitro olarak test edilmiştir sentez ve off-hedef etkilerini gösteren değil.

8/50668fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 3.. Nano insan HER2-pozitif meme kanseri tedavisinde eşleştirilmelerin. Lider nano ilaç (üst yapı) iki ilaç (Herceptin, _HER2 AON) içerir. Versiyonlar 2 ve 3, ilaçların sadece birini içerebilir. Insan HER2-aşırı ifade eden tümör hücrelerine 1 ve 2'nin Uptake Herceptin bağlanma tarafından yönetilmektedir. Herceptin içermeyen Nano eşlenik 3, insan hücreleri tarafından endozom alımı için anti-HuTfRmAb aldı. Alexa Fluor 680 ile birleşme görüntüleme amaçları için isteğe bağlı oldu. Kırmızı çubuk nano konjugat platformu PMLA / LOEt (% 40) temsil eder. % Belirtilen ligand (nanodrug =% 100 malik asit kalıntılarının toplam miktarı) bağlanmasını tüketilen malik asit kalıntılarının bir kısmını gösterir.

Şekil 4. Nano kimyasal sentezikonjugatlan P / LOEt / AON _HER2 / anti-MsTfR/Herceptin yukarıdan aşağıya doğru:. kolye karboksilatlardan (kimyasal aktivasyon) arasında PMLA-N-hidroksi succinimidyl ester (PMLA-NHS) sentezi. 2-merkapto-1-aminoethan (2-MEA) ile amid formasyonu NHS değiştirilmesi, metil-PEG _{5000-amin (5.000 mPEG-NH2),} trileucine (LLL) ya da lösin etilester (LOEt). Bu, "preconjugate" bölünebilir disülfid bağlarının oluşumu ile tioeter oluşumu ve AON'in ile mAb-Mal-PEG-Mal vermektedir. Kalan 2-MEA amidoetil-ditio-propiyonik asit oluşturan sınırlıdır. Tek mAb'nin sadece bağlanma gösterilmiştir. Çoklu ekleri mAb'lerin karışımları kullanılarak yönetilir. Yüzde% çeşitli ligandlar (serbest PMLA için% 100) bağlanmıştır karboksilatlar fraksiyonlarını gösterir.

Şekil ure 4'te belirtildiği gibi nano konjugatlar sentezlendi. Kurşun hesaplanan molekül ağırlığıeşlenik 719,000 idi. Sentezin genel verim malik asit içeriği ile ilgili olarak 45 ±% 5 idi. 100 kDa PMLA platformun 862 malyl birimi (=% 100), ortalama olarak,% 40 LOEt,% 5, MPEG,% 2 AON% 2,% 0.2 ve% 0.2 arasında Herceptin anti-MsTfR mAb gerçekleştirilir. Her bir antikor miktarı PMLA platformun molekülü başına 1.7 moleküllerinin ortalama karşılık geldi. % Tasarlanmış ve grup analizi ile doğrulanmıştır% ±% 5 dahilinde aynıydı. Bir örnek tasarım içeriği ile karşılaştırılmasını göstermektedir malik asit, AON, mAb ve mPEG ₅₀₀₀ ve Tablo 2'de deneysel içeriğinin hesaplanması için Tablo 1 'de verilen bir durumdur. Bölüm 3 altında kriterlere göre yüksek saflıkta yüksek reaksiyon verimleri ve boyut dışlama ile etkin bir biçimde ayrılması (örneğin, mAb ve mAb serbest-nanoconjugate sec-HPLC üzerinde, 1 dakika ile ayrılır) ve çözücüler içerisinde seçici çözünürlük bazında elde edilmiştir. Monoklonal antikorların etkinliği oldu nano ilaç sentez boyunca muhafaza edilmesi gösterilmiştir ve bu antikorların bu iki çeşit aynı polimer platformu üzerine monte edilmiş olduğu doğrulandı. Atipik ELISA deneyinin sonuçları Şekil ure 5'te gösterilmiştir. Genel olarak, malik asit, AON, protein, PEG için kantitatif grup analizi için ve ELISA tahlilleri için bildirilen sentezi durumunda, sadece farklı personel ve enstrümantasyon tarafından gerçekleştirilen zaman yeniden üretilebilir sonuçlar elde edilmiştir, sağlam, ama aynı zamanda analiz için kullanıldığında Diğer sentezlenen nanoconjugates arasında.

Malik asit içeriği referansla nanodrug bileşimin Tablo 1.. Hesaplanması.

668table2.jpg "width =" 600 "/>
Tasarlanan bileşim ile deneysel nano ilaç bileşimi Tablo 2.. Karşılaştırması.

Şekil 5,. ELISA kimyasal sentez sonra ve farklı antikor çoklu bağlama gösterilmesi için antikor afinite ölçümü için. Nano ilaç antikor, mAb, sırasıyla A ve B antijenleri, karşı (A) ve antikor mAb (B) içerir. ELISA plakaları antijen (A) ile kaplanır. Free mAb (A), serbest mAb (B), ve nano ilaç ELISA plakalarına uygulanır. Yalnızca mAb (A) antijen (A) bağlı ise yıkamadan sonra, antikorlar, mAb (A) veya mAb (B) her biri için belirli bir ikincil peroksidaz bağlanmış antikorlar ile test edilir. Bu, serbest ve nano ilaç mAb (A) ile konjüge edilmiş ve dolaylı olarak, nano ilaç molekülünün mAb (B) konjüge edilmiş, ancak serbest mAb (B) değil görülmektedir, Plaka üzerinde muhafaza edilir. Konsantrasyon bağımlılığı kimyasal eşleştirme antikorun bağlanma etkinliğini etkilememiştir belirten, serbest ve konjuge mAb (A) için benzer bağlanma çekim güçlerini göstermektedir. Ayrıca, aynı fiziksel bir varlık (nano platform) mAb antikoru (B) tespiti sonuçları üzerinde mAb (A) ile mAb (B) 'nin birlikte ligasyon. Burada gösterilen deney sonuçları, anti-insan TfRmAb (A) ve anti-fare TfRmAb (B) bakın. Benzer sonuçlar, anti-MsTfR mAb ve anti-HER2 mAb (Herceptin) ve test edilen diğer antikor çiftler için gösterilmiştir.

Fiziksel ve araştırma hidrodinamik çapı belirtilmedikçe 22.1 ± P / mPEG (% 5) / LOEt (% 40) / AON (% 2) / Herceptin (% 0,2) / anti-MsTfRmAb (% 0.2) (kurşun, iki 2.3 nm ilaç versiyonu), 20.1 ± P / mPEG (% 5) / LOEt (% 40) / AON (% 2) / anti-MsTfRmAb (% 0.2) / anti-HuTfRmAb (% 0.2) (AON ilaç sürüm) 2,4 nm ve 15.1 ± P / mPEG'e (% 5) / LOEt (% 40) / Herceptin (% 0.2) (Herceptin ilaç sürüm) için 1.2 nm. PH 7 Zeta-potansiyeli.5 Bu sipariş -5.2 ± 0.4 mV, -5.7 ± 0.6 mV, ve -4.1 ± 0.4 mV idi. Bu nano konjugatların ölçülen hidrodinamik çapı serbest bileşenler için ölçülen çaplar toplamsallık takip ki söz edilmelidir.

Tümör hücre zarından nano ilaç teslimi ve 0 saat ve 3 saat sonra, r sitoplazma içine serbest

Endozom alımı ile hücre zarından nano ilacın teslimat ure Şekil 6'da gösterilmiştir 0 saat ve 3 saat sonra. Flüoresan etiketler (yeşil Alexa Fluor 680) nano ilaç platforma ve (kırmızı Lissamine,) AON'in bağlıdır. Bunların üst üste D & L ve panellerin G ve O. etiketlenmesine endozomlar (mavi) floresans ile panelinde gösterilmektedir Pearson korelasyon katsayıları (R (r) platformu / endozomların eş-lokalizasyonu, AON / endozomlar, 0 saat ve 3 saat için bir platform / AON. T ilişkin görüntüleri hesaplandıo 3 saat görüntü sitoplazmada glutation-bağımlı bölünmeye disülfid ile nano ilaçtan AON'in sitoplazma ve ayrışma içine endozomlardan salınmasını göstermektedir.

Şekil 6,. (Ding ve diğ. ¹¹ uyarlanmıştır) hedef hücreler tarafından alımı için nano eşlenik Konfokal mikroskopi. Hücreler, iki polimer platformu ve Lisamin AON'in bağlı (kırmızı) ile Alexa Fluor 680 (yeşil) ile etiketlenmiş olan nano ilaçla 37 ° C'de 30 dakika inkübe edildi. Buna ek olarak, endozomlar FM1-43 (mavi) ile boyandı. Lokalizasyon 0 saat (A) ve 3 saat (B) inkübasyon sonrasında gösterilmektedir. Paneller A, ab, ve B, yalnız nano konjuge floroforlar tarafından ij gösterisi boyama, veA, cd & B, kl kendi co-lokalizasyon. Buna ek olarak, endozomların boyama panel A, e ve B, m ve nano birleşmiş ve endosomesin paneller A, ko gösterilir fg ve B, no. Panellerin paneller A, H & B, p gösteri faz kontrast. (C) Pearson korelasyon platform Endozomlar, AON-Endozomlar, 0 saat ve 3 saat için hesaplanan platform AON ko için R (r) katsayıları. tıklayınız Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.

In vitro ve in vivo insan meme kanserinin engellenmesi

Com HER2 aşırı ifade eden hücre soyu BT-474 in vitro büyüme inhibisyonuDüşük sentezleyen hücre soyu MDA-MB-231 ile parison ure Şekil 7 'de gösterilmiştir. Inhibisyon derecesi kurşun nano konjugat P / MPEG / LOEt / AON _HER2 / Herceptin / anti-MsTfRmAb sırasıyla% 50 ve% 30, olduğunu. Diğer bileşikler ile engellenmesi MDA-MB-231 hücreleri için daha BT-474 için daha az, ancak daha yüksektir. BT-474 hücre hattı, ksenojenik fare meme kanseri tedavisi için seçildi.

Şekil 7,. HER2 BT-474 göğüs kanseri hücrelerinin aşırı ifade eden ve düşük HER2 BT-474 göğüs kanseri hücre hattı aşırı ifade eden büyüme inhibisyonu. Karşılaştırılması (Inoue et al. ¹² uyarlanmıştır) MDA-MB-231 hücrelerinin (eksprese In vitro büyüme inhibisyonu sol) ve HER2 ifade eden düşük meme kanseri hücre soyu MDA-MB-231 (sağ). TfR (ler) anti-MsTfRm gösterirAb ve TfR (Hu / Ms), anti-HuTfRmAb ve anti-MsTfRmAb gösterir. Kurşun nano ilaç, P / MPEG / LOEt / AON _HER2 / Herceptin / TfR (Ms) ve Herceptin veya AON _HER2'nin ya yoksun nano ilaçlar PBS, Herceptin ve AON _HER2 ile karşılaştırılmıştır. Herceptin yokluğunda, anti-MsTfRmAb tümör hücreleri tarafından alınmasını sağlamak endozom konjüge edildi. Konsantrasyonlar antikorlar AON _HER2, 4 uM endoporter (AON'in uygulama) ile ilgili olarak 4 uM ile ilgili olarak 40 ug / ml idi. Önemi * ile gösterilen, p <0.05: ** P <0.02: *** P <0.003, PBS ile karşılaştırıldı.

Şekil 8 'de in vivo tedavi sonuçları, insan meme kanseri aşırı ifade eden BT-474 Her2'yi taşıyan fareler için sunulmuştur. Büyüme sadece PBS (Şekil ure 8) ile tedavi edilen kontrollere kıyasla Herceptin ve HER2 özgü AON içeren kurşun nanodrug ile>% 95 inhibe edilmiştir. Engellemeyalnız Herceptin, P / MPEG / LOEt / Herceptin veya P / MPEG / LOEt / AON / anti-MsTfRmAb / anti-HuTfRmAb ile% 60 ya da daha az oldu. Tümör ekstrelerinin Western blot analizi, HER2 sentez ve Akt fosforilasyonunun hem inhibisyonunu gösterdi, ancak toplam Akt değişikliği ve temizlik enzim yok GAPDH. PARP apoptoz artan seviyesi ile uygun olarak ayrılır. Tedavisi ve tümör gerilemesini gösteren H & E ile boyandı doku bölümleri sonra tümör Resimlerde Şekil ure 9'da gösterilmiştir.

(Inoue et al. ¹² uyarlanmıştır) talebi ve ön-madde ilaçlar ile nano tedavi sırasında Şekil 8,. Tümör boyutu ve proteinler. Çeşitli tedaviler (Günlük 42, toplam 8 enjeksiyonları gün 21) için. Tümör boyutu. Barlar standardını göstermektedirortalamadan sapma. Anti-Her2 AON'in ve Herceptin ile konjuge talebi tek başına Herceptin veya tek bir ilaç ihtiva eden nano konjugatlarının. B ya da daha üstündür. HER2, fosforile Akt, toplam Akt'nin, Parb ifadesi üzerine çeşitli tedavilerin etkisi, yarılır Parb ve GAPDH western blot ile gösterilmektedir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Çıplak fareler üzerinde HER2-pozitif BT-474 insan göğüs kanseri Şekil 9. Tedavisi (Ionue et al. ¹² uyarlanmıştır) doku kesitlerinde. Tümör nekroz regresyon ve / apoptoz. Üst: tümör (kırmızı oklar) Çekme. Tümör büyümesini (mavi ok) desteklemek için östrojen pelet göstergesidir. Lower: Tümör bölme hematoksilin ve Eosine (H & E) boyama. Çoğalan tümör tümör hücrelerinin yoğun bir ambalaj ile gösterilmiştir. Nekrotik doku tümör hücrelerinin elimine edilmiş yerlerde görülür. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Biyolojik olarak parçalanabilir bir doğal polimer nano ilaçların hazırlanması için deney yol kişiselleştirilmiş tıp sentezinde kullanılabilecek sunulmuştur. Açıklama nano ilaç sentezi için bir çok yönlü bir platformdur polymalic asit, kontrollü üretimi ve saflaştırılması ile başlar. Tekrarlanabilir teknikleri kullanarak, polimer, yüksek moleküler ağırlığa sahip ve ilaç sentezler için uygun aşırı saflıkta elde edilir. Sentez, verimli bir şekilde HER2-pozitif göğüs kanseri tedavisinde gösterilen bir nano ilaç için tarif edilmektedir. Açıklama kanser tedavisi için diğer birçok nano ilaçların sentezleri tercüme edilebilir. Hedefleme örneğin HER2 proteini ya da etkili bir şekilde içselleştirilir başka bir tümör markeri olarak bir tümör-spesifik antijeni bağlayan örneğin Herceptin gibi antikorlar içerir. Nano ilaç etkin bir tre altında kanser büyümesini inhibe edecek antisens oligonükleotitlerin ve kemoterapi bir seçim sunannuları ailenizle konuşmak. Bu örnekte, Herceptin HER2 ile spesifik antisens oligonükleotid tavlama bağlanabilen HER2-kodlama mRNA HER2-sinyalizasyon ve HER2-pozitif göğüs kanserinin şiddetli azalma sürekli engellenmesi ile sonuçlanmıştır. Tümör hedefleme ve antisens oligonükleotidler ile gen sentezlenmesinin engellenmesi için temel ilkesine dayanarak güncel birçok nano ilaçlar ve başarılı bir şekilde inhibe klinik öncesi insan glioblastoma ve üç negatif meme kanseri ^11,14-18 sentezledik.

Sentetik çalışma Physarum polycephalum ("balçık kalıp" familyasından bir tür) bir kültür süpernatanından polymalic asit olduğu yüksek düzeyde saflaştırılmış nano ilaç platformunun hazırlanması ile başlar. Preparat çok antikorlar, peptidler, oligonükleotidler ve aktif ilaç dağıtım ve tümör büyümesinin önlenmesi işleyen diğer moleküllerin ataşmanına imkân veren, ilke olarak, polimerin yüksek molekül ağırlıklarına vurgulamaktadır. Followikontrol kültürlenmesini ve arıtma ng, tahmin edilebilir verimlerde polimer tekrarlanabilir kalitede imal edilmiştir. Polimer herhangi bir zaman için uygun koşullar altında depolanır.

Polimer-kolye karboksilatlar kimyasal aktivasyonu ile başlayan PMLA nano konjugatlarının sentezi birkaç sentetik aşamalarda gerçekleştirilir. Adımlar arasında, sentez ara ürün, isteğe göre keyfi miktarda hazırlanmasını sağlayan beklemeye yerleştirilebilir ve böylece ölçek büyütme kullanılabilir. Sentezin ilerlemesi TLC ve sec-HPLC ile takip edilir, ve nano ilacın bileşimi ve etkinliği hem de grup spesifik kantitatif kimyasal tahliller, ELISA ve fiziksel ölçümler, çeşitli tarafından kontrol edilir. Deneyimlerimiz bu sentezler mükemmel verim ve saflık ile sorunsuz ve tekrarlanabilir ilerledi edilmiş olmasıdır. Pe gerektiği gibi antikor ve anti-duyarlı oligonükleotitlerin özgünlüğünü seçerek nano ilaç herhangi bir varyantı olumlu sentezlenirtıp rsonalized.

Insan HER2-pozitif göğüs kanserinin başarılı tedavi modaliteleri fare kanser modelleri hazırlanması, nano ilaçlar, görüntüleme ve tümör büyümesinin analizin uygulanması için geçerlidir temsilcileridir. In vitro canlılığı testlerin sonuçları hücre hattı ve hayvan deneyinde kullanılacak öncü ilaç seçimi faydalıdır. In vivo görüntüleme Xenogen nano ilaç gerçekten tümör içine teslim olduğunu doğrular. Western blot sonuçları bazı proteinlerin düzeyi kanser tedavisi sırasında öngörülen moda yanıt olmadığını ortaya koymaktadır. Tümör boyutunun ölçülmesi, yani önlenmesi, durgunluk veya gerileme ile ilgili tedavinin başarısı hakkında bilgilendirir. Tarif edilen örnek öngörülebilirlik, tekrarlanabilirlik ve kayda değer toksisite yokluğu yüksek derecede gösteren diğer polymalic asit bazlı nano ilaçlar ile deneyim yansıtır. Toksisite ve birden t etkinliği üzerinde son sonuçlarüçlü-negatif meme kanseri tedavisi için argeted polymalic asit konjugelerin kavramı ¹⁸ güçlü desteği vardır. Tümör interstisyum içine ekstravazasyonun tarafından endotel bariyer, endozom alımı ile tümör hücre zarı ve lösin ethylester veya trileucine grupların eylem tarafından endozom zar bozulma: Bir önemli özelliği bizim nano ilaç biyo-engelleri nüfuz edebilir olmasıdır. Ekstravazasyonu ve endozom alımı güvenilir bir nano ilaca bağlı özel antikorlar ile gerçekleştirilir. Anti-fare transferrin reseptör antikoru, reseptör en tümör damar sistemi üzerinde aşırı eksprese olduğu muhtemelen, transsitoz ile tümör içine etkili akışını aracılık eder. Farklı bir antikor, spesifik olarak tümör alıcı hücre içine nano ilaç yönlendirilmesinde aynı nano eşlenik molekülü fonksiyonları üzerinde eklenmiş. Her bir antikor varlığı, transsitoz için bir ve endozom alımı için, diğeri, optimum çalışması için gereklidir. M Kantitatif analizalic asit ve antikor yüksek nano ilacın optimum bileşimi kontrol etmek için önerilmektedir. Son olarak, her-bir kovalent nano ilaç alıcı tümör hücresi içine ana damar içinden geçirmek en kimyasal olarak bağlı formda bir ilaç sunar unutulmamalıdır. Onlar hedeflenen yerinde nano eşlenik platformdan bölünme ile ücretsiz ilaçlar olarak yeniden kadar kimyasal eki (ön ilaçlar) en ilaçların inaktif hale getirir. Reaktivasyon yöntemi teslimat ve zararlı yan etkileri uyandırmak için bir asgari şans sırasında güvenlik yüksek derecede sağlar, çünkü bu önemlidir. Çok yönlülük, etkililik ve güvenlilik iyi kişiselleştirilmiş tıp vazgeçilmez özellikleridir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercapto-1-ethylamine (Cysteamine; 2MEA)	Sigma-Aldrich	30078-25G
4’,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories, Burlingame, CA
90-Day release 17β-estradiol pellet	Innovative Research of America
Alexa Fluor 680 C2 maleimide	Invitrogen	A20344
Amberlite IR 120H	Sigma-Aldrich	6428
Antifoam Y-30 Emulsion	Sigam-Aldrich	A5758
Anti-laminin-411 chain mAbs	Santa Cruz	SC-59980
Anti-pAkt mAb	Cell Signalling	9271S
Anti-PARB mAb	BD Biosciences	556494
Anti-von Willebrand Factor antibody	Abcam	AB6994
Bacto Yeast Extract	Bacto, Dickinson/Sparks, MD	212720
Beta-actin	Cell Signalling	3700
BT-474	ATCC	HTB-20
Calcium Carbonate	Alfa Aesar	36337
Cell Proliferation Assay kit	Promega, Madison, WI, USA	PR-G3580
Centriplus 100	Millipore	4414
Dicyclohexylcarbodimide	Fluka	36650
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
Eosin	Cardinal Health	S7439-4
Galardin (MMP-inhibitors)	Santa Cruz	SC-994
GAPDH	Cell Signalling	2118
Hematoxilin	Cardinal Health	S7439-3
Hemin from porcine	Sigma-Aldrich	51280
Herceptin	Genentech	15534
Herceptin (Western blotting)	Cell Signalling	2165S
IgG2a-kappa murine malignoma	Sigma	M77695X5m
Immun-Star AP Substrate Pack	Biorad	170-5012
Immun-StarTM AP Substrate Pack	Biorad	170-5012
LAL Reagent water	Lonza, MD	W50-1000
Laminin-411 mAbs	Abcam
Leucine ethyl ester (LOEt)	Sigma-Aldrich	61850-10G-F
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 tests	Cambrex BioScience	N384
Lissamin-Morpholino AON	Gene Tools	Custom made
L-malic acid	Sigma-Aldrich	M6413
Malate dehydrogenase	Sigma-Aldrich	M2634
Mal-PEG-Mal	Laysan	mal-PEG-mal-3400
Matrigel	BD Biosciences	354248
Milk, nonfat powdered	Proteomics	M203-10G
Morpholino oligonucleotides	GeneTools	custom made
mPEG5000	Lysan	mPEG-NH2-5000
N-hydroxysuccinimde (NHS)	ACROS Organics	15727100
Ninhydrin	Merck	1.06762.0100
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich	Invitrogen	LC2001
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich, 0.45 µm	Invitrogen	LC2001
Novex ® Tris-Glycine Transfer Buffer (25x)	Invitrogen	LC3675
Nude Mice [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm]	Taconic
PBS pH 7.2 10x	Gibco	10010-49
PBS pH 7.2 1x	Gibco	70013
PD-10 desalting columns	GE Healthcare	17-0851
Physarum polycephalum M3CVII	ATCC	204388
Pierce BCA protein assay	Thermo Scientific	23225
Protease inhibitor cocktail	Roche	1.18362E+11
Protein Detector ELISA Kit	KPL	54-62-18
Sephadex G-25 superfine	GE Healthcare	17-0031
Sephadex G-75	GE Healthcare	17-0050
Sephadex-LH20	GE Healthcare	17-0090
SKBR-3	ATCC	HTB-30
SPDP	Proteochem	C1116
Streamline-DEAE	GE Healthcare	17-0994
Styryl Red FM 1-43	Life Technologies	T-3163
TBS 10x	Bio-Rad	170-6435
TCEP	Sigma-Aldrich	C4706-2G
TLC, silica coated aluminia sheets	Merck, Darmstadt, DE	60F254
Trileucine (LLL)	Bachem	H-3915
Triton X-114	Sigma-Aldrich	X114
Tween®20	Sigma-Aldrich	P1379
Vivaspin 20	VWR	14005-302
DAPI	Vector Laboratories, Burlingame, CA
Dexmedetomidine	Pfizer
Atipamezole	Pfizer
Carprofen	Pfizer
Betadine	Foster and Smith, Wisconsin