JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz inflamatuvar aşamaları ayırt için invaziv olmayan bir görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır. Luminol sistemik teslim nötrofillerinde MPO aktivitesi bağlı akut inflamasyon alanları ortaya koymaktadır. Bunun aksine, lusigenin enjeksiyon makrofajlarda Phox aktivitesi bağlı kronik inflamasyon görselleştirme sağlar.

Özet

Inflamasyon birçok insan hastalıklarının temel bir yönüdür. Bu videoyu raporda, fare modellerinde akut ve kronik inflamasyon ayırt non-invaziv biyoparlaklık görüntüleme teknikleri göstermek. Doku hasarı veya patojen istilası ile, nötrofil akut inflamatuvar yanıt arabuluculuk önemli bir rol oynayan, ilk savunma hattı vardır. Iltihabi reaksiyon ilerledikçe, dolaşımdaki monosit yavaş yavaş yaralanma siteye göç ve kronik inflamasyon aracılık ve doku enkaz kaldırma ve anti-inflamatuar sitokinler üreterek doku onarımı teşvik olgun makrofajlar, içine ayırt. Luminol intraperitoneal (5-amino-2 ,3-dihidro-1 ,4-phthalazinedione, sodyum tuzu), büyük ölçüde dokusuna-nüfuz eden nötrofillerin aracılık ettiği akut enflamasyon algılanmasını sağlar. Luminol özellikle miyeloperoksidaz (M biyolüminesans sonuçları yana nötrofil phagosomes içinde oluşturulan süperoksit ile reaksiyona girerPO) aracılı reaksiyonu. Lusigenin (bis-N-methylacridinium nitrat), aynı zamanda biyolüminesans oluşturmak amacıyla, süperoksit ile reaksiyona girer. Ancak, lusigenin biyolüminesans MPO bağımsızdır ve sadece kronik inflamasyon sırasında makrofajlarda fagosit NADPH oksidaz (Phox) dayanır. Birlikte, luminol ve lusigenin non-invaziv görüntüleme ve akut ve kronik inflamatuar aşamalarında farklı fagosit nüfus boyuna değerlendirilmesi sağlar. Insan hastalıkları çeşitli inflamasyonun önemli rolü göz önüne alındığında, bu non-invaziv görüntüleme yöntemi patolojik durumlarda çeşitli nötrofil ve makrofaj ayırıcı rolleri araştırmak yardımcı olabileceğimize inanıyoruz.

Giriş

Iltihap, yara iyileşmesi 2, 3 diyabet, kanser, nörodejeneratif 4, kardiyovasküler 5, 6, 7 ve otoimmün hastalıklar mikrobik enfeksiyon 1 de dahil olmak üzere insan hastalıkları, çeşitli yer oldukça düzenli bir biyolojik yanıttır. Doku iltihabı patojen boşluk, doku tamiri ve hastalık çözünürlük elde etmek için çeşitli bağışıklık hücreleri düzgün koordinasyon gerektirir. Nötrofiller ve makrofajlar doku inflamasyon önemli bağışıklık mediyatörlerdir. Inflamasyon akut döneminde, nötrofil çeşitli zararlı uyaranlar ve doku hasarı 8 için ilk müdahale vardır. Nötrofil hızla hücreleri anti-mikrobiyal granül ve fagositoz bırakarak mikroplar istila inaktive nerede, dolaşımdan yaralanma siteye extravasate. Fagositoz sırasında, nötrofil hücreler süperoksit yüksek düzeyde üreten, içinde, phagosomes içine mikroplar istila yutmakide (O 2 · -). Phagosomal süperoksit birçok alt reaktif oksijen türlerinin (ROS) birincil kaynağıdır. Örneğin, süperoksit kendiliğinden dismutasyon veya süperoksit dismutaz (SOD) 9, 10 hidrojen peroksit (H2O 2) 'ye dismutated edilebilir. Nötrofiller, miyeloperoksidaz (MPO) başka bir anti-mikrobiyal hipoklorik asit (HOCI) 11 hidrojen peroksit dönüştürür. Inflamatuar yanıtları devam ederken, dolaşımdaki monosit yavaş yavaş yaralanma siteye göç ve olan fagositik fonksiyonu inaktive patojenler ve hücre enkaz kaldırmak yardımcı olgun makrofajlar 2, farklılaşırlar. Buna ek olarak, iltihap daha sonraki bir aşamasında önemli bir regülatör olarak, makrofajların anti-inflamatuar sitokinler üreterek 12 ve daha düşük bir düzeyde 9 hücre dışı ROS ile doku onarımına teşvik etmektedir. Bu daha sonraki bir aşamada üretilen ROS doku yeniden, yeni damar oluşumu ve reepithelia düzenleyenlization 13.

Fagosit NADPH oksidaz (Phox) nötrofil ve makrofajlar 9 hem de süperoksit üretiminin birincil kaynağıdır. Phox olan montaj sıkı 9 düzenlenir bir çok alt birimi karmaşıktır. Holoenzyme birkaç sitozolik düzenleyici alt birimden (p67 phox, p47 phox, p40 phox ve RAC) ve membrana bağlı heterodimeri sitokrom b 558 (alt birimi CYBA ve CYBB oluşur) içerir. Sitokrom B 558 CYBB alt birimi (aynı zamanda P91 phox ve NoX2 olarak da bilinir), birincil redoks zincir reaksiyonu 9 üzerinden taşıyan içindeki reaksiyon çekirdeğidir. İlginç bir şekilde, kendi montaj siteleri nötrofiller ve makrofajlar arasında farklıdır. Istirahat nötrofillerde, sitokrom b'nin 558 hücre içi depolama granülleri 14 membran çoğunlukla mevcuttur. Fagositoz sırasında nötrofiller saat monteMPO aktivitesi yüksek düzeyde da vardır phagosomes 9, de oloenzymes. Nötrofil Phox hızla oksijen tüketir ve ROS üretimi ile kendi mikrobisidal güç uygular, bir fenomen solunum patlaması 11 adlandırılır. Bunun aksine, makrofajlar MPO ifade daha düşük bir düzeyde olması ve oda 558 çoğunlukla plazma zarı 15, 16 bulunur sitokrom. Makrofajlar düzenleyici fonksiyonları 15 daha az süperoksit oluşturmak iken Böylece nötrofil, anti-mikrobiyal aktivite için süperoksit yüksek düzeyde üretmek.

Inflamasyon in vivo sürecinde karmaşık olduğu için, inflamasyon farklı aşamaları için özel non-invaziv görüntüleme yöntemleri hastalık modelleri kantitatif ve boyuna değerlendirme olanak sağlayacak. Mekanik çalışmalar kullanılarak, daha önce iki kimyasal olarak ışık veren maddelerin kullanımı, luminol (5-amino-2 ,3-dihidro-1 ,4-phthalazinedione) ve lusigenin (bis-N-methylacridinium nitrat) göstermiştirSırasıyla 17 inflamasyon akut ve geç (kronik) aşamaları, non-invaziv görüntüleme için. Lusigenin biyolüminesans geç dönemde veya kronik inflamasyon 17 ile birlikte makrofaj aktivitesini değerlendirmek için kullanılabilir ise Luminol, inflamasyon 18-20 akut döneminde nötrofil MPO aktivite görselleştirme sağlar. Bu yazıda, bu görüntüleme teknikleri göstermek için iki deneysel inflamasyon modelleri (sc PMA ve sc LPS) kullanılır.

Protokol

Not: Tüm hayvan çalışmaları onaylanmış kurumsal protokoller ve hayvan bakımı kuralları uyarınca yapıldı.

1. Reaktifler ve Çözümler

  1. Sc aşılama için PMA çözeltisi: forbol 12-miristat 5 mg / ml 'de DMSO içinde 13-asetat (PMA) bir stok çözeltisi hazırlayın. -20 ° C'de saklayın stok solüsyonu Inokülasyondan önce, stok solüsyonu çözülme ve PBS içinde 1 mg / ml PMA ile seyreltin.
  2. Sc aşılama için LPS çözeltisi: aşılamadan önce sc, 1 mg / ml 'de steril PBS içinde çözülür lipopolisakkarid (Salmonella enterica serotip enteritidis ikinci LPS).
  3. Akut faz görüntüleme için luminol çözeltisi: 10 mg / ml 'de (% 0.9 NaCl), steril normal tuzlu su içinde (5-amino-2 ,3-dihidro-1 ,4-phthalazinedione, sodyum tuzu), luminol çözülür. Çözelti, kullanımdan önce -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
  4. Kronik faz görüntüleme için lusigenin çözeltisi: normal tuzlu su içinde steril lusigenin (bis-N-methylacridinium nitrat) içinde çözülür2.5 mg dozunda / ml arasındadır. Çözelti, kullanımdan önce -20 ° C'de muhafaza edilebilir.

2. Cilt altı PMA Enflamasyon Model

  1. % 1-2 izofluran ile bir indüksiyon odasında NCR çıplak farelerin anestezisi. Hareket kaybına ve sabit bir solunum hızı ile genel anestezi onaylayın. Izofluran-karışım gaz ile birlikte bir burun konisi bir hayvan transferi ve anestezi altında hayvan tutun.
  2. Sol kanattan ceza enjeksiyon yeri temizlemek ve dezenfekte etmek için silin bir izopropil alkol kullanın.
  3. Steril tekniği kullanarak, sol kanattan ceza deri altı uzaya PMA aşılama solüsyonu (PMA 50 mg içeren) 50 ul enjekte. Bir izopropil alkol ped kullanarak enjeksiyon sitesinden aşırı sıvı çıkarın. Bu inflamatuar yanıtları etkileyebilir olarak analjezi kullanımını önlemek.
  4. Konut kafesine geri hayvan hareket ettirin ve yakından anestezi kendi kurtarma izlemek. Kurtarma yardımcı olmak amacıyla, hayvan sıcak tutmak için bir ısıtma yastığı kullanın.

3. Cilt altı LPS Enflamasyon Model

  1. Bir indüksiyon odasında izofluran% 1-2 ile C57BL/6J fareler anestezi. Genel anestezi kurulması sonra, izofluran gaz ile birlikte bir burun konisi bir hayvan transferi ve anestezi altında hayvan tutun.
  2. Sol ayak tabanına üzerinde enjeksiyon yerinde temizlemek için silin bir izopropil alkol kullanın.
  3. Steril tekniği kullanarak, sol ayak tabanına içine aşılama LPS çözeltisi (LPS 50 mg ihtiva eden) 50 ul enjekte edilir. Bir izopropil alkol ped kullanarak enjeksiyon sitesinden aşırı sıvı çıkarın. Bu inflamatuar yanıtları etkileyebilir olarak analjezi kullanımını önlemek.
  4. Konut kafesine geri hayvan hareket ettirin ve yakından anestezi kendi kurtarma izlemek. Kurtarma sırasında hayvan sıcak tutmak için bir ısıtma yastığı kullanın.

4. Iltihabı Biyoparlaklık Görüntüleme

  1. % 1-2 izofluran-karışım gaz ile bir indüksiyon odasında hayvan anestezisi. Cohareket kaybına ve sabit bir solunum hızı ile genel anestezi nfirm.
  2. Hayvan anestezi altında iken, intraperitoneal (ip), sırasıyla, akut veya kronik enflamasyon görüntüleme için luminol çözeltisi (10 mg / ml), ya da lusigenin çözeltisi (2.5 mg / ml) enjekte edilir. Nihai dozaj luminol lusigenin boyunca 25 mg / kg 'boyunca 100 mg / kg' dır. Lusigenin (10-15 mg / kg) daha düşük bir doz bazı fare suşları, toksisite önlemek için de kullanılabilir. Toksisite belirtileri nefes ve solunum sıkıntısı darlığı. C57BL/6J gerginlik NCR çıplak gerginlik daha düşük lusigenin tolere vardır.
  3. Bir biyoparlaklık görüntüleme sisteminin görüntüleme odasına hayvan aktarın.
  4. 1 dakika aralıklarla ardışık biyoparlaklık görüntüleme gerçekleştirin. Her görüntüleme adım 1 dakika satın alma zaman oluşur, f / stop = 1, binning = 16 ve 0 sn gecikme.
  5. Görüntü elde etme paneli içinde, sıralı çok adım görüntüleme sağlamak için, met ayarını dizisi tıklayıntton. Maksimum parlaklık çıkışı (genellikle 15 bir dakikalık adımlar yeterli olacaktır) belirlemek için satın alma profilinde yeterli görüntüleme adımları sağlar. 15 dakikalık görüntüleme bölümü yüzey emilim ve sistemik dolaşıma için yeterli zaman sağlar.
  6. Görüntüleme odasına gelen hayvan çıkarın ve konut kafesine geri hareket ettirin. Kurtarma yardımcı olmak amacıyla, hayvan sıcak tutmak için bir ısıtma yastığı kullanın.
  7. Alım sonrası analizi sırasında, ilgi standart alanları (ROI) ile en yüksek toplam bioluminescent sinyal hesaplamak için görüntüleme yazılımı paketi kullanın. Images / minimum ve maksimum eşik ile sn / cm 2 / sr belirtilen fotonlar içinde parlaklık olarak mevcuttur. Nicel veri ROI başına saniyede fotonların toplam akı olarak sunulmaktadır.

Sonuçlar

Biz deneysel inflamasyon modellerinde akut ve kronik inflamasyon değerlendirmek için uzunlamasına biyoparlaklık görüntüleme yapılmaktadır. Forbol 12-miristat 13-asetat (PMA), süperoksit anyon üretimi için Phox aktif hale getirir ve 21 şiddetli akut iltihabik cevaplar tetikler güçlü bir protein kinaz C (PKC), agonistidir. Ncr çıplak farelerde, PMA, 50 mg SC enjeksiyon enjeksiyon bölgeleri 18, 22 de hızlı cilt tahrişi ve akut enflamasyon, 23 yol açmıştır. Biz PMA ...

Tartışmalar

Bu yazıda, canlı hayvanlarda inflamasyon non-invaziv görüntüleme için bir biyolüminesans yöntemi göstermektedir. Iki parlak yüzeyler, luminol ve lusigenin yararlanarak, yöntem inflamasyon farklı aşama olabilir. Lusigenin biyolüminesans kronik aşamasında makrofajlar tarafından aracılık ise Luminol biyolüminesans, inflamasyon akut döneminde nötrofil ile ilişkilidir. Nispeten küçük (MW = 177.16 g / mol) ve elektriksel olarak yüklü olmayan, luminol kolayca plazma ve phagosomal membran 25-29<...

Açıklamalar

Yazarlar bu çalışmada herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim.

Teşekkürler

Bu çalışma Nancy Lurie Marks Vakfı tarafından desteklenmiştir. Biz yazının eleştirel okuma Dr Nancy E. Kohl teşekkür ederim. Bu videoyu rapor hazırlanmasındaki yardımları için Kin K. Wong teşekkür ederim.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MOP8139 
Lipopolysaccharide from Salmonella enterica serotype enteritidisSigma-Aldrich Co., St. Louis, MOL2012 
Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt)Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MOA4685 
Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate)Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MOM8010 
IVIS Spectrum imaging system with Living Imaging 4.2 software packageCaliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA 

Referanslar

  1. Premack, B. A., Schall, T. J. Chemokine receptors: gateways to inflammation and infection. Nat. Med. 2, 1174-1178 (1996).
  2. Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N. Engl. J. Med. 341, 738-746 (1999).
  3. Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Inflammation, stress, and diabetes. J. Clin. Invest. 115, 1111-1119 (2005).
  4. Weitzman, S. A., Gordon, L. I. Inflammation and cancer: role of phagocyte-generated oxidants in carcinogenesis. Blood. 76, 655-663 (1990).
  5. Ridker, P. M., Cushman, M., et al. Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men. N. Engl. J. Med. 336, 973-979 (1997).
  6. Wyss-Coray, T., Mucke, L. Inflammation in neurodegenerative disease--a double-edged sword. Neuron. 35, 419-432 (2002).
  7. Hamilton, J. A. Colony-stimulating factors in inflammation and autoimmunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 533-544 (2008).
  8. Harlan, J. M. Leukocyte-endothelial interactions. Blood. 65, 513-525 (1985).
  9. Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).
  10. Rest, R. F., Spitznagel, J. K. Subcellular distribution of superoxide dismutases in human neutrophils. Influence of myeloperoxidase on the measurement of superoxide dismutase activity. Biochem. J. 166, 145-153 (1977).
  11. Hampton, M. B., Kettle, A. J., et al. Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. Blood. 92, 3007-3017 (1998).
  12. Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nat. Immunol. 6, 1191-1197 (2005).
  13. Jiang, F., Zhang, Y., et al. NADPH oxidase-mediated redox signaling: roles in cellular stress response, stress tolerance, and tissue repair. Pharmacol. Rev. 63, 218-242 (2011).
  14. Calafat, J., Kuijpers, T. W., et al. Evidence for small intracellular vesicles in human blood phagocytes containing cytochrome b558 and the adhesion molecule CD11b/CD18. Blood. 81, 3122-3129 (1993).
  15. Johansson, A., Jesaitis, A. J., et al. Different subcellular localization of cytochrome b and the dormant NADPH-oxidase in neutrophils and macrophages: effect on the production of reactive oxygen species during phagocytosis. Cell. Immunol. 161, 61-71 (1995).
  16. Kumar, A. P., Piedrafita, F. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma ligands regulate myeloperoxidase expression in macrophages by an estrogen-dependent mechanism involving the -463GA promoter polymorphism. J. Biol. Chem. 279, 8300-8315 (2004).
  17. Tseng, J. C., Kung, A. L. In vivo imaging of inflammatory phagocytes. Chem Biol. 19, 1199-1209 (2012).
  18. Gross, S., Gammon, S. T., et al. Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat. Med. 15, 455-461 (2009).
  19. Kielland, A., Blom, T., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).
  20. Zhou, J., Tsai, Y. T., et al. Noninvasive assessment of localized inflammatory responses. Free Radic. Biol. Med. 52, 218-226 (2012).
  21. Karlsson, A., Nixon, J. B., et al. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. J. Leukoc. Biol. 67, 396-404 (2000).
  22. Taylor, R. G., McCall, C. E., et al. Histopathologic features of phorbol myristate acetate-induced lung injury. Lab Invest. 52, 61-70 (1985).
  23. Fukaya, S., Matsui, Y., et al. Overexpression of TNF-alpha-converting enzyme in fibroblasts augments dermal fibrosis after inflammation. Lab Invest. 93, 72-80 (2013).
  24. Lu, Y. C., Yeh, W. C., et al. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
  25. Aitken, R. J., Buckingham, D. W., et al. Reactive oxygen species and human spermatozoa: analysis of the cellular mechanisms involved in luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence. J. Cell. Physiol. 151, 466-477 (1992).
  26. Allen, R. C., Loose, L. D. Phagocytic activation of a luminol-dependent chemiluminescence in rabbit alveolar and peritoneal macrophages. Biochem. Biophys. Res. Commun. 69, 245-252 (1976).
  27. Caldefie-Chezet, F., Walrand, S., et al. Is the neutrophil reactive oxygen species production measured by luminol and lucigenin chemiluminescence intra or extracellular? Comparison with DCFH-DA flow cytometry and cytochrome c reduction. Clin. Chim. Acta. 319, 9-17 (2002).
  28. Dahlgren, C., Aniansson, H., et al. Pattern of formylmethionyl-leucyl-phenylalanine-induced luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence in human neutrophils. Infect. Immun. 47, 326-328 (1985).
  29. Dahlgren, C., Karlsson, A. Respiratory burst in human neutrophils. J. Immunol. Methods. 232, 3-14 (1999).
  30. Aerts, C., Wallaert, B., et al. Release of superoxide anion by alveolar macrophages in pulmonary sarcoidosis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 465, 193-200 (1986).
  31. Zhang, N., Francis, K. P., et al. Enhanced detection of myeloperoxidase activity in deep tissues through luminescent excitation of near-infrared nanoparticles. Nat Med. , (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm nolojiSay 78EnfeksiyonT pH cresel BiyolojiMolek ler BiyolojiBiyomedikal M hendisli iAnatomiFizyolojiKanser BiyolojisiK k H cre BiyolojisiiltihapFagositlerfagosits peroksitlerMolek ler G r nt lemekemil minesansIn vivo G r nt lemes peroksitbiyol minesanskronik enflamasyonakut enflamasyonfagosit h crelerg r nt lemehayvan modeli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır