Yağ Doku Bağışıklık Hücre İzolasyonu

Özet

Yağ dokusu (AT) yoğun bağışıklık hücre aktivasyonu ve etkileşim bir sitedir. Bağışıklık sisteminin hemen hemen tüm hücreleri AT mevcut olan oranını obezite etkilenir. Bağışıklık hücre popülasyonlarının AT uygun izolasyon, miktar ve karakterizasyonu immunometabolic hastalık rolleri anlamak için önemlidir.

Özet

Obez kemirgenler ve insanların yağ dokusunda artış makrofaj infiltrasyonu (AT) keşfinden lokal ve sistemik insülin direnci ile bağışıklık hücre katkı ilgi yoğunlaşmasına yol açmıştır. Yalın ve obez AT farklı bağışıklık hücre popülasyonlarının izolasyonu ve miktar şimdi immunometabolism laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılan bir tekniktir; henüz çok dikkatli elde edilen verilerin güvenilir ve yorumlanabilir bir şekilde stromal vasküler hücre izolasyonu ve akım sitometri analizi hem alınmalıdır . Bu videoda, kıyma sindirmek ve bağışıklık hücre ile zenginleştirilmiş stromal vasküler kısmını izole nasıl gösterilmektedir. Daha sonra, biz antikor etiket makrofajlar ve T lenfositler ve nasıl akım sitometri deneylerde onlara doğru kapı için nasıl gösterir. Az yağlı beslenen yalın ve yüksek yağ ile beslenen obez fareler Temsilcisi akım sitometri araziler sağlanmaktadır. Bu analizin önemli bir unsuru, mutlaka antikorların kullanımımakrofajlar AT doğal autofluorescent kanallar, hem de uygun tazminat kontrollerin kullanımı floresan değil.

Giriş

Tarihsel olarak, yağ dokusu (AT) enerji dengesi yanıt olarak genişler ve sözleşmeleri lipid depo, bir asal organı olarak incelendi. Şimdi AT aktif doğrudan beslenme davranışları ve sistemik glikoz dengesini etkileyen hormonlar, bir dizi salgılar dinamik bir endokrin organı temsil anlıyorum. Buna ek olarak, son on yıl içinde stromal vasküler fraksiyonu (SVF) yanı sıra, homeostasis katkıları için AT ikamet eden bağışıklık hücrelerinin çok sayıda nüfus için artan bir takdir olmuştur.

Ilk olarak 1964 ^1'de Rodbell tarafından tanımlanmıştır adiposit ve SVF bir kollajenaz sindirimi kullanma yeteneği ayrı ve ardından diferansiyel santri. Kollajenaz II genellikle adiposit insülin reseptörlerinin ¹ bakım nedeniyle adiposit ve SVF ayrılması için kullanılır. AT erken, enzimatik fraksiyon öncelikle adipo çalışma istihdam edildimetabolizması Eritrosit ve preadipositlerden izole etmek. Daha yakın zamanlarda, akış sitometrelerinde yaygın olarak kullanılması ve ticari fluorofor-konjuge antikor giderek artan sayıda ile birlikte bu teknik, bağışıklık hücrelerinin AT karakterizasyonu kolaylaştırmıştır.

AT iltihaplı bağışıklık hücrelerinin varlığı daha önce ² tarif edilmiş olmasına rağmen, Weisberg ve arkadaşlarının seminal kağıtları. Xu ve ark. yayınlanan 2003 yılında inflamatuvar sitokinler salgılarlar ve AT-özel ve sistemik insülin direnci ^3,4 ile ilişkili obezitede makrofajlar AT birikimi (ATM), belgelemek için ilk idi. Bu gözlemler soruşturma yeni bir alan temelinde son zamanlarda, "immunometabolism," ⁵ icat olarak görev yaptı ve dendritik hücreler ^6, mast hücreleri ^7, T hücreleri ⁸ dahil olmak üzere çeşitli bağışıklık hücre popülasyonlarının, karıştığı çalışmalarla takip edilmiştir ^-10, ¹¹ B hücreleri, NKT hücreleri, ^{12, 13} eozinofiller ve nötrofiller obezite ilişkili insülin direncinin geliştirilmesinde ^14,15.

Bu makalenin amacı SVF AT hücreleri izole etmek ve ATM karakterize ve akış sitometri ile T hücreleri AT için kullanılan kollajenaz özeti tekniğin ayrıntılı bir açıklama sunmaktır. Bu protokol AT fare için optimize edilmiştir, ancak, izleyiciler ¹⁶ AT insan için bu tekniğin optimizasyonu hakkında geniş detay veren mükemmel bir makale okuyarak yararlanabilir. Bu makalenin hedef kitlesi sınırlı deneyimi AT fare ile çalışan ve akım sitometri performans ile araştırmacılar içerir. Zaman ve kaynak ile hücresel verim ve canlılığı dengelemek için birkaç pratik hususlar bağışıklık hücre popülasyonlarının AT tanımlamak için de en uygun akım sitometri kontrol grubu olarak sunulmaktadır. Protokolde ek olarak, okuyucu referr vardıruygun kontrolleri ve tazminatlar ¹⁷ dahil etmek akım sitometri teknik yönlerini bazı mükemmel bir tartışma için Basu ve ark. tarafından yapılan son vallahi makaleye ed.

Protokol

1. Reaktifler ve Malzemeleri

Bundan önce deneysel protokol başlamadan, aşağıdaki reaktifler hazırlamak:

1. % 70 etanol
2. 1X PBS
3. 1X DPBS (Ca ve Mg olmadan),% 0.5 BSA ile takviye edilmiş
4. FACS tamponu: 1X DPBS (Ca ve Mg), 2 mM EDTA,% 1 FCS
5. ACK tamponu: 150 mM _NH4CI, 10 mM KHCO ₃ ve su içinde 0.1 mM EDTA _Na2

2. Yağ Doku Hasat ve Hazırlık

1. Her kurumun özel IACUC onaylı prosedürlere göre fareler Euthanize.
2. Iyice% 70 etanol ile kürk ıslak.
3. Kılıç şeklinde sürecinin seviyesinde (sternum alt kısmında) bir kesi yapmak ve herhangi bir büyük kan damarları sever özen, kalp ortaya çıkarmak için göğüs boşluğu açın.

Not: Bu noktada, kadar diyafram olduğu gibi bırakmak da yararlı olurmümkün ve kan izin ve göğüs boşluğu dışına akmasına perfüzat için göğüs kafesinin sağ tarafında bir çentik kesmek için.

4. Kan izin ve dolaşım sistemi kaçmak için perfüzat için sağ atrium klibi.

Not: AT obez fareler, aşırı perikard ile uğraşırken kalbe erişime izin vermek için kaldırılması gerekebilir.

5. Forseps ile kalp tutun ve yavaşça apeks ile sol ventrikül içine bir iğne takın. Yavaş yavaş 15 ml steril PBS ile perfüze fare.

Not: akciğer doldurmak ve genişletmek başlar eğer perfüzyon oranını azaltın.

6. Periton boşluğuna açın ve gonadal dokular önlemek için dikkatli kullanarak perigonadal yağ yastıkları kaldırın.
7. Bir yağ pedler,% 0.5 BSA ile takviye edilmiş 2 mi 1X DPBS (Mg veya Ca) olmadan içeren buz üzerinde tekne ağırlığında ve ince parçalar halinde AT kıyma.

Not: başına AT miktarını sınırlandırın 1.2 g tekne tartın. AT miktarı 1.2 g aşarsa, iki tartmak tekne arasında eşit olarak bölmek.

8. Buz üzerinde muhafaza edin örnekleri ve% 0.5 BSA, 10 mM _CaCl2, ve 4 mg / ml kollajenaz, tip II ile desteklenmiş 1X DPBS içeren örnek hızında başına 3 ml kollajenaz sindirimi solüsyon hazırlanır.

3. Kollajenaz Sindirim

1. Homojenat dökme edilir ve 1 ml DPBS (% 0.5 BSA) ve 3 ml kollajenaz sindirimi II çözeltisi ile tekne ağırlığında durulanarak 50 ml konik tüp aktarın.
2. 20 dakika boyunca 37 ° C'de döner bir çalkalayıcı (200 devir) ° C Homojenat inkübe edin.
3. Buz üzerinde konik tüpler ve yere 10 ml DPBS (% 0.5 BSA) ekleyin.
4. 10 ml'lik bir pipet kullanılarak serolojik defalarca homojenatı Karışım, ve yeni bir 50 ml'lik konik bir tüp içinde 100 mikron filtre hücre süspansiyonları geçmektedir.
5. 4 ve D 'de 10 dakika boyunca 500 xg'de hücre süspansiyonu santrifüjörneğin; C.
6. Durusu süpernatant ve tekrar süspansiyon SVF hücre pelet 3 ml ACK tampon eritrositlerin kirletici lyse.
7. 4, 10 dakika boyunca 500 xg'de 12 ml FACS tamponu ve santrifüj hücre süspansiyonu ekleyin ° C
8. FACS tampon Durusu süpernatant ve tekrar süspansiyon SVF hücre pelet.

Not: hücre pelet 50 ml konik tüp alt kapsıyorsa, 0.5-1 ml FACS tampon kullanmak içeri tekrar süspansiyon ne kadar FACS tampon için bir kılavuz olarak hücre pelet boyutu kullanın, aksi halde, 0,25-0,5 tekrar süspansiyon haline getirin ml.

9. Yer buz üzerinde örnekleri ve karışım 40 ul FACS tampon maddesi, 50 ul tripan mavisi çözeltisi (% 0.2) ve 10 ul hücre süspansiyonu ile hücre sayımı için her bir numunenin 1:10 seyreltme alikotları hazırlamak.
10. Tripan mavi dışlama göre canlı hücre sayımı ve 5-10 x 10 ⁶ hücre / ml 'lik nihai bir konsantrasyona kadar hücre süspansiyonları seyreltin.

4. Hücre Yüzey Antijen boyanması

1. 0.5-1 μg/10 ⁶ hücre nihai bir konsantrasyona kadar anti-fare CD16/CD32 antikoru (Fc Bloku) ekleyin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
2. Transferi örnekleri (≥ 10 ⁶ hücre) için 12 x 75 mm polistiren yuvarlak alt tüpler. ATM ve T hücreleri analiz ise ayrı tüpleri hazırlayın ve gerekli tazminat ve modifiye floresan eksi bir (FMO) kontrol karşılamak için tüpler yeterli sayıda hazırlamak için ekstra hücreleri birleştirir.

Not: Örnek olarak, F4/80 ve CD11b, aşağıdaki tazminat ve FMO kontroller dayalı ATM oranı miktarının zaman hazırlıklı olmak gerekir:

- Boyanmamış (hücreler)

- DAPI veya propidium iyodür (PI) tek leke (hücre; adım 5.1 kadar canlılığı boya eklemeyin)

- F4/80 APC leke tek (hücre veya tazminat boncuk)

- CD11b FITC (tek hücreler veya leketazminat boncuk)

- FMO 1 (hücre): Rat IgG2a κ izotip kontrol APC + CD11b FITC + canlılığı boya (adım 5.1 eklenir)

- FMO 2 (hücre): F4/80 APC + Rat IgG2b κ izotip kontrol FITC + canlılığı boya (adım 5.1 eklenir)

3. (Reajanlar ve malzemeler, Tablo bakınız) uygun konsantrasyonda fluorofor konjuge birincil antikor ve / veya izotip kontrolleri ekleyin.
4. 30 dakika 4 ° C'de ışık ve inkübe örnekler koruyun.
5. 4, 5 dakika boyunca 500 x g'de 2 ml FACS tamponu ve santrifüj hücre süspansiyonu ekleyin ° C
6. 2 ml FACS tamponu içinde tekrar süspansiyon ve süzün süpernatant SVF hücre pelletini.
7. ≥ 400 ul FACS tamponunda 5 4 ° C de dakika ve tekrar süspansiyon SVF hücre pelletini için hücre süspansiyonu 500 x g'de santrifüjleyin.
8. 35 mikron hücre süzgecinden tüp üstleri ile donatılmış 12 x 75 mm polistiren yuvarlak alt tüplere örnekleri aktarın.
9. 4 ışık, ve mağaza örneklerinden koruyun ° C FACS analizi kadar.

Not: En iyi sonuçlar için hücreler immeadiately analiz edilmelidir, ancak, bu protokol ile FACS analizi başarılı bir şekilde 4 ° C de 1-2 saat FACS tampon saklanan etiketli hücreleri üzerinde yapılmıştır Hücreler depolama süresi artırmak için sabit olması gerekiyorsa, etiketli hücreleri FACS analizden önce 24 saat 4 de 2% paraformaldehid ° C ile tespit edilebilir. Antikor şirketleri etiketli hücreleri bir haftaya kadar saklanabilir öneririz, ancak bu işlem kapsamında test edilmemiştir.

5. FACS Analizi

1. Önce FACS analizi, ölü / canlı hücre ayrımı sağlamak için örnekleri ve uygun kontrollerin için canlılığı boya ekleyin.

Not: Çok sayıda canlılığı boyalar ticari olarak mevcuttur, ancak DAPI ve PI uyarma / emisyon prof bağlı olarak tavsiye edilirfluorofor-konjuge antikor iles kullanılmaktadır. DAPI ve propidyum iyodür 0.2 mg / ml 'lik bir son konsantrasyonda her numuneye eklenir.

2. İlgi hücre popülasyonu (ler) ölçeği üzerinde, böylece yan dağılım (SSC) ve öne dağılım (FSC) ayarlamak için, deney örnekleri, aynı doku izole boyanmamış bir negatif kontrol örneği, tercihen de hücreleri kullanır.

Not: SVF hücrelerin AT analizi için, SSC doğrusal bir ölçekte FSC karşı bir günlük ölçekte görüntülenir önerilir. Genellikle çok büyük ve taneli olan ATM'ler, analiz ederken SSC için bir günlük ölçek kullanımı özellikle önemlidir.

3. Analiz edilen hücre (ler) türüne göre bir ilk ışık yayılımı kapısı çekmek ve lekesiz hücreler kadar (yaklaşık 10 ² merkezli) bir tek parametre histogram sol üzerinde olacak şekilde photomultiplier tüp (PMT) kazancı ayarlayın uygun kanallar için.

Not: Bu lenfositler ve makrofajlar (veya diğer miyeloid hücreleri) nedeniyle otofloresans farklılıkları ayrı ayrı analiz edilmesi tavsiye edilir.

4. Çok renkli tazminat gerçekleştirmek için tek lekeli denetimleri veya antikor yakalama tazminat boncuk kullanın.

Not: tazminat boncuk kullanılması tavsiye edilir, ancak, her antikor uyumluluğu sağlanmalıdır. Örneğin, kompanzasyon boncuk izole edilmiş hücreler, uygun bir tek leke kontrol elde etmek için gerekli olduğu durumda, tavşan antikorları ile çapraz reaksiyona olmayabilir.

5. Modifiye FMO kontroller dayalı deneysel kapıları ayarlayın.
6. Ilgi nüfusunun yaygınlığı dayalı olayların uygun sayıda toplamak ve deneysel veri kaydetmek için akış sitometresi ayarlayın.
7. İhracat FCS veri çevrimdışı analiz için dosyaları. Akış cytometr için çok sayıda program vardıry veri analizi. Biz Cytobank, investigatores internet erişimi ¹⁸ olan herhangi bir bilgisayardan rakamlar saklamak ve analiz veri ve oluşturmak sağlayan bir web-tabanlı bir platform tavsiye ederiz. Ayrıca, Cytobank veri kamu erişilebilir yapmak veya ortak erişimi kısıtlamak için olanağı sunar.

Sonuçlar

Diferansiyel santrifüj takip AT kollajenaz sindirim az yağlı (yağ% 10 kcal) veya yüksek yağ (yağ% 60 kcal) diyet (LFD ve YYD beslenen erkek C57BL/6J farelerin epididim yağ yastıkları gelen SVF izole etmek için kullanıldı sırasıyla) 16 hafta boyunca. SVF hücreleri, daha sonra FACS analizi ile uygun bir ATM (Şekil 1) ve T-hücreleri (Şekil 2) oranını ölçmek için bir fluorofor konjuge primer antikorlar ile işaretlenmiştir. Işık yayılımı, çift ayrımcılık ve...

Tartışmalar

Obezite metabolik sonuçlara bağışıklık sisteminin rolü artan ilgi AT bağışıklık hücreleri karakterize etmek için flow sitometri yaygın kullanımı yol açmıştır. Tam protokolü kendi deneyim ve ekipmanları mevcut dayalı laboratuarlar arasında farklılık olsa da, kritik adımlar kollajenaz sindirim, diferansiyel santrifüj, ve hücre yüzey antijeni etiketleme içerir. Bu makalenin amacı AT ve / veya akım sitometri performans ile çalışan sınırlı deneyimi ile araştırmacılara SVF AT ve izol...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml	Life Technologies	14190-250
DAPI	Life Technologies	D3571
BSA	Sigma	A2153-100G
collagenase	Sigma	C6885-5G
propidium iodide solution	Sigma	P4864-10 ml
stable stack 20 microliter	Rainin	SS-L10
20 microliter filter tips	Rainin	SRL10F
stable stack 250 microliter tips	Rainin	SS-L250
1000 microliter tips	Rainin	GPS-L1000
1000 microliter filter tips	Rainin	GP-L1000F
250 microliter Filter Tips	Rainin	SR-L200F
FC Block	BD Biosciences	553142
fisher 100mn strainers	Fisherbrand	22-363-549
medium weigh dish	Fisherbrand	02-202B
aluminum foil	Fisherbrand	1213100
mincing scissors	Fisherbrand	089531B
Vortex	Fisherbrand	2215365
50 ml conical tubes	BD Falcon	14-959-49A
filter top FACS tubes	BD Falcon	352235
10 ml pipette case 200	BD Falcon	1367520
round bottom tubes	BD Falcon	352058
5 ml syringe	BD Falcon	309646
V Bottom Plates	Costar	07-200-107
transfer bulb pipette	Thermo Scientific	13-711-22
Shaker	Thermo Scientific	11 676 071
Adhesive mat	Thermo Scientific	1368750
Cell Culture Centrifuge	Sorvall	75253839
Adapters	Sorvall	75003723
Rat anti-mouse CD16/CD32	BD Biosciences	553142	Concentration: 0.5 - 1 μg/ 106 cells
Rat anti-mouse F4/80	eBioscience	17-4801	Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321
Rat anti-mouse CD11b	eBioscience	11-0112	Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031
Armenian Hamster anti-mouse CD11c	eBioscience	12-0114	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88
Goat anti-mouse MGL1/2	R&D Systems	FAB4297P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P
Goat anti-mouse CD206	R&D Systems	FAB2535P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P
Rat anti-mouse CCR2	R&D Systems	FAB5538P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P
Armenian Hamster anti-mouse TCRβ	BD Biosciences	553174	Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956
Rat anti-mouse CD8a	BD Biosciences	552877	Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784
Rat anti-mouse CD4	BD Biosciences	557956	Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963
Table 1. List of Materials and Reagents.