Akut lösemi tedavisi için Tirosin Kinaz İnhibitörleri klinik öncesi değerlendirilmesi

Özet

Reseptör tirozin kinazlar, ektopik bir çok kanser olarak ifade edilmiştir ve akut lösemi terapötik hedefler olarak tespit edilmiştir. Bu makale, akut lösemi tedavisinde tirosin kinaz inhibitörlerinin klinik öncesi değerlendirilmesi için etkin bir strateji tarif etmektedir.

Özet

Reseptör tirozin kinazlar, lösemi ve katı tümörlerin her ikisi de dahil olmak üzere birçok kanser gelişimi ve ilerlemesi implike edilmiştir, ve çekici druggable tedavi hedeflerdir. Burada akut lösemi tedavisinde tirosin kinaz inhibitörleri (TKIs) klinik öncesi değerlendirilmesi için etkin bir dört aşamalı bir strateji tarif eder. Başlangıçta, western blot analizi kültürlenmiş lösemi hücrelerinde hedef inhibisyon doğrulamak için kullanılır. Fonksiyonel aktivite bu metilselüloz ya da yumuşak agar kültürlerde klonojenik tahliller kullanılarak değerlendirilir. Hücre kültürü deneylerinde etkisini gösteren deney bileşikleri, insan lösemi hücre hatları ile ortotopikal NOD-SCID-gamma (NTG) fare kullanılarak in vivo olarak değerlendirilir. İlk in vivo farmakodinamik çalışmalar kemik iliğinden izole lösemik patlamalarda hedef önlenmesini değerlendirecek. Bu yaklaşım, etkin bir hedef inhibit için gerekli uygulama doz ve programın saptanması için kullanılıriyon. Daha sonraki çalışmalar, bu şekilde, bir in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak bio-ışıldama lösemi yükü ve terapötik yanıtın değerlendirilmesi non-invazif biyolüminesans izleme sağlayan, lusiferazı ifade eden lösemi hücreleri kullanılarak in vivo TKIs etkinliğini değerlendirmek. Bu strateji, in vitro ve in vivo olarak TKIs değerlendirilmesi için etkili olmuştur ve tedavi edici potansiyele sahip moleküler hedefli maddelerin tanımlanması için veya birden fazla bileşiklerinin doğrudan karşılaştırılması ve öncelik için uygulanabilir.

Giriş

Akut lenfoblastik lösemi (ALL) çocuklarda ^1,2 en sık görülen hastalıktır. Pediatrik B-soy ALL (B-ALL) için genel sağkalım oranı yaklaşık% 85 olduğunu, ancak T-soy ALL (T-ALL) dahil olmak üzere belirli biyolojik alt tipleri, hatta güncel tedavi protokolleri ile hala kötü prognoz var. Nükseden ALL ileri tedavi bir meydan okuma ³ kalır. Akut lösemili erişkin hastaların çoğunluğu yukarı ön kemoterapi ile remisyon elde olmasına rağmen, birçok hasta hala nüks ⁴ muzdarip. Akut lösemi tedavisinde de mevcut kemoterapötik rejimler toksisite ile ilişkili kısa ve uzun süreli yan etkilere neden olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, özel olarak da normal dokular üzerinde minimal etkisi ile kanser hücrelerini hedefleyen, daha az toksik tedaviler büyük ihtiyaç vardır. Son yıllarda, vurgu roman, kanser hücreleri için spesifikliği olan moleküler olarak hedeflenen ajanlar, sıklıkla tekrarlı kimya kullanılarak geliştirilmesi üzerinde yerleştirilmiştirdaha sonra karşılaştırıldı ve ^5, öncelikli edilmesi gereken birden çok aktif bileşikler üretir. Bu makale ilaç gelişimini kolaylaştırmak amacıyla, tek bir bileşiğin değerlendirilmesi için ya da birden fazla bileşiklerinin doğrudan karşılaştırmak için kullanılabilir akut lösemi tedavisi için TKIs klinik öncesi değerlendirilmesi için etkin bir strateji tarif etmektedir.

Burada sunulan yöntem dört adımdan oluşur. İlk olarak, biyokimyasal (1) ve anti-lösemi (2), bileşik (ler) in aktiviteleri hücre kültürü içinde değerlendirilir, daha sonra hedef inhibisyonu hayvan modellerinde, (3) olarak doğrulanmıştır ve TKİ (lar) ın son olarak tedavi edici etkisi olduğu Ortotopik lösemi ksenograft modellerinde belirlenir (4). Bu çalışmalar için, en yaygın biyolojik alt tiplerinin temsilcileri uygun hücre hatları, seçmek önemlidir. Hücre çizgileri biyolojik etkiler med olup olmadığını araştırmak için, her ikisi de, ilgi konusu hedef ifade ilgilenilen hedef eksikliği olan seçilmelidirhedef inhibisyonu ile iated. Bu anti-tümör aktivitesi için önemli olabilir hedef dışı etkiler küçük molekül inhibitörleri, geliştirilmesi için özellikle uygundur. Bu tür proliferasyonu veya hayatta kalma gibi işlevsel etkileri için hedefe bağlı olan bir hücre hattını seçmek için de gereklidir. Hedefi inhibe RNA girişimi ya da diğer özel araçlar kullanılarak (bu madde kapsamı dışında) ön hedef geçerlilik çalışmaları, hedef bağımlı hücre çizgilerini belirlemek için kullanılabilir. Bu hücre kültürü sonuçlar daha doğrudan in vivo deneyler için tercüme olabilir, öyle ki, murin ksenograftları oluşturabilir hücre çizgilerini seçmek için de arzu edilir.

Lösemi hücrelerinde TKIs tarafından aracılık edilen biyokimyasal etkinliğin değerlendirilmesi için, reseptör fosforilasyon bir azalma hedef inhibisyonunun bir göstergesi olarak kullanılabilir. Western blot analizi, veya ELISA tahlilleri antikorların mevcudiyetine ve özelliğine göre, kullanılabilecektir.Hedef için yeterli özgüllüğü olan antikorlar bulunmaktadır, bunlar daha nicel ve verimli olarak, ELISA deneyleri, tercih edilir. ELISA için yeterli özgüllüğü olan antikorlar mevcut değildir durumlarda, western blot analizi gerekli olabilir. Bu durumda, lizat büyük bir miktarda immüno-çökeltme düşük bolca hedeflerin saptanması için yararlı olabilir. Bu yaklaşım, çevresel uyarılara cevap olarak sinyal hızlı değişiklikler için izin vermek için çok kısa bir yarı ömre sahip olabilir, fosfo-proteinlerin, ölçümü için özellikle uygundur. Bazı fosforilatlanmış proteinler, son derece kararsız fosfatazlar ile kompleks oluşumunun bir sonucu olarak çok muhtemeldir. Bu fosforile edilmiş proteinler, sağlam ve sürekli saptanması için, aynı zamanda önceki bütün hücre lizatları hazırlanmasına fosfo-proteinin stabilize edilmesi için, pervanadate, geri dönüşü olmayan bir protein-tirosin fosfataz inhibitörü ⁶ hücreleri tedavi etmek de mümkün olabilir.

Karşıbiyokimyasal aktivitesi anti-tümör etkilere neden olup olmadığını belirlemek, hedefe bağlı biyolojik süreçlerin hücre bazlı deneylerde izlenebilir. Lösemi hücre hatları için, TKIs tarafından aracılık edilen anti-lösemi aktivitesi metilselüloz ya da yumuşak agar ⁷ gerçekleştirilen koloni oluşumu tahlilleri kullanılarak değerlendirilebilir. Bu TKİ ile tekrar tedavinin gerekli ise manipülasyon için daha uygun olan bir katı ortam olduğu gibi yumuşak agar tercih edilebilir. , Birçok akut myloid lösemi (AML) hücre çizgileri yumuşak agar içinde koloni oluşturacak birlikte, en önemlisi hücre hatları, sadece yan-katı ortam olduğu, metilselüloz koloniler oluşturacaktır. Bu metilselüloz kültürlerde orta ve / veya TKIs yenilemek için mümkün olmakla birlikte, sadece küçük miktarlar kullanılır ve sınırlı bir frekans ile olabilir. Benzer şekilde, metilselüloz bunları bozmadan koloniler leke daha zordur. Ön çalışmalar, metilselüloz ve / veya yumuşak agar ve t koloni oluşturmak için uygun hücre çizgilerinin yeteneğini tanımlamalıdıro kültür içindeki hücrelerin optimum yoğunluk koloniler örtüşmeyen ve yeterli sayıda (35 mm tabak başına genellikle 50-200 koloni) istatistiksel olarak ilgili veri elde etmek için bu tür.

In vitro deneyler, sağlam ve uygun maliyetli olan ve var ise bütün hayvan deneylerinde, terapötik bileşikler arasında ilerlemesi daha az etik sorunlar, hayvan modellerinde etkinlik ve güvenlik kanıtı gerektirir. İn vivo çalışmalar, insan akut lösemi hücre çizgileri orthotopically I ^tm1Wjl / SzJ (NTG) fareler ve TKIs kolaylıkla enjeksiyon ya da ağızdan sonda ile tatbik edilebilir l2rg NOD.Cg-Prkdc ^SCID transplante edilebilir. Bazı hücre hatları ksenogratflardır kurmak için sırayla radyasyonun düşük hücre hattı bağımlı doz NSG farelerin maruz gerektirebilir ve bu durumda fareler 5-10 günde iyileşme dönemi sonrası ışınlama olmaksızın ağızdan sonda tahammül edebilir. Bu el yazması kullanılarak B-ALL ve T-ALL xenogreftler nesil açıklarama örnekler ksenograftlarının gibi özel hücre çizgileri (697 ve Jurkat) hücre hatlarının geniş bir yelpazede kullanarak NTG farelerde kurulabilir. Diğer hücre çizgileri daha uygun olması durumunda ise, ışınlama için gereksinim, organ nakli ve hastalık başlangıcı ve ilerlemesini zamanlama hücrelerin optimum sayısı deneysel olarak tespit edilmelidir. İdeal olarak, bu modelleri (hastalığa bağlı ideal olarak 20-30 gün çalışma tedavi ve kaldırma başlangıcı arasında) tam bir penetrans (nakledilen her hayvan lösemi geliştirir), tutarlı kinetiği (lösemi bütün hayvanlarda benzer şekilde ilerler) ve uygun bir tedavi penceresi olacak . Nakledilen hücre sayısı penetrans ve kinetik tutarlılığını arttırmak için artan veya gerekirse tedavi penceresi geliştirmek için azaltılabilir.

TKIs in vivo hedef inhibisyonu aracılık olmadığını belirlemek için, numuneler TKİ veya yalnızca taşıyıcı ile tedavi sonrası lösemi ksenograftları olan farelerden toplanır. İdeal olarak, bir dozBu deneyler için uygulama d programı sık sık ticari laboratuarlar tarafından gerçekleştirilen ve bu makalenin kapsamı dışında olabilir farmakokinetik çalışmalar, tarafından yönlendirilir. Eğer farmakokinetik veriler, mevcut ise, TKİ tek bir dozundan sonra, hücre kültürü içinde etkili hedef inhibisyonu ve maksimum serum konsantrasyon için gerekli olan bileşik konsantrasyonu hayvan çalışmaları için bir başlangıç ​​dozu tanımlamak için kullanılabilir. Farmakokinetik çalışmalar, aynı zamanda, farmakodinamik çalışmalarda ve tatbikat yolu için örnek toplama sonrası tedavi zamanlaması bilgilendirebilir. Hedef inhibisyonu etkilenen herhangi bir organda değerlendirilebilir fakat en kolay toplanır ve işlenir doku tercih edilir. Özel organlar etkilenir, ancak en akut lösemi hücre hatları, karaciğer, kemik iliği, dalak, periferal kan ve merkezi sinir sisteminde kurmak ve bu organlarda bütünleşme ölçüde modelleri arasında değişir. Burada sunulan protokol phosph değerlendiriyoro-protein western blot analizi kullanılarak kemik iliğinde önlenmesi, ama sağlam organ sürekli hasat için daha kolay ve örnek toplama ve işleme sırasında fosfo proteinlerin indirgenmesi için daha az olanak sağlayan, dondurulmadan önce az ya da hiç işlem gerektirebilir. İmmünohistokimya aynı zamanda, katı tümörler ya da lösemi etkilenen organların değerlendirmek için de kullanılabilir.

Son olarak, TKİ (ler) in terapötik etkinliği ortotopik lösemi ksenograft modellerinde belirlenir. Bu çalışmalar için, tedavi başladıktan zamanlaması hastalığın daha az ya da oluşturulacak şekilde, çeşitli olabilir. Tedavi başlangıç ​​çalışmaları için naklinden hemen sonra başlayabilir ve daha sonra önemli bir hastalık yükü daha yakından tanı tedavi modeli yaklaştığı tespit edilinceye kadar sonraki çalışmalarda gecikecektir. İdeal olarak, bu hayvan modelleri de hastalık yükünün non-invaziv ölçümü için kapasitesine sahiptir. Biz ateşböceği lucifer tanıtımı için yöntemler optimizeHastalık başlangıcı ve kemik iliği ve solid organ hastalık yükünün ilerlemesi ve değerlendirilmesi non-invaziv, boyuna analiz için izin virüs benzeri partikülleri kullanarak lösemi hücre hatlarının içine ase gen. Bu yaklaşım için kritik poliklonal hücre çizgilerinin kullanımı ile ilgili lusiferaz sentezleyen lösemi gelişiminde değişkenliği önlemek için monoklonal lusiferaz etiketli hücre çizgilerinin kullanımı ve TKİ ⁸ ile muamele ilgisi yoktur.

Birlikte ele alındığında, bu adımlar tek bir TKİ değerlendirilmesi için veya birden fazla TKIs doğrudan karşılaştırılması ve sıralama için kullanılabilir. Burada yer alan protokolleri TKIs gelişimi üzerinde odaklanırken, bu yöntemler başka hedeflere göre uyarlanabilir ve deney geliştirme için düşünceler tarif edilmiştir. Böylece, bu strateji, akut lösemi tedavisi için daha geniş bir uygulama moleküler olarak hedeflenen ajanlar klinik öncesi değerlendirme olabilir.

Protokol

Hayvanları içeren tüm deneyler Colorado Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanan yönetmelik standartlarını izledi. Gösterdi protokol Colorado Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1.. Phospho-protein Western Blot

1. Lizatlarının Hazırlanması
   1. Ilgi konusu reseptör tirosin kinazını ifade eden kültür hücre hatları. Hasat hücreleri ve plaka 3-5 x 10, bir 48-yuvalı doku kültürü çanağı içinde 400 ul büyüme ortamında ⁶ hücre / örnek. 2-3 saat boyunca% 5 _CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin.
   2. Büyüme ortamı içinde 5x TKİ çözeltisi 100 ul ilave edin ve 60 dakika boyunca inkübe edin.
   3. 50 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA,% 10 (v / v) gliserol,% 1 (v / v) Triton X-100 ve protez önleyicileri ile liziz tamponu hazırlayın. Kültürler hasattan önce pervanadate ile tedavi olmaz ise, fosfataz inhibitörleri (1 mM sodyum orthova eklemekliziz tamponu için nadate ve 0.1 mM sodyum molibdat).
   4. Kullanımdan hemen önce pervanadate (PV) fosfataz inhibitörü çözeltisi hazırlayın. Buz üzerinde koyu bir tüp (% 30 stok çözeltisinden 1:100 seyreltme) soğuk fosfat-tamponlu salin (PBS) içinde hidrojen peroksit (DİKKAT) içinde bir% 0.3 çözelti hazırlayın. 0.2 M sodyum ortovanadat, 5 dakika boyunca (OV, DİKKAT) stok çözeltisi bir kısım kaynatın. Oda sıcaklığında (RT) 20 mM OV çözelti elde etmek için PBS içinde 1:10 seyreltin. % 0.3 hidrojen peroksit ve 20 mM OV 01:01 karıştırın ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edilir.
   5. Tam bir ortam (60 ul + 940 ul PV ortamı) PV seyreltin. Iyi seyreltilmiş PV / 100 ul ekleyin. 3 dakika boyunca% 5 _CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edilir ve daha sonra buz üzerinde plaka yerleştirilir.
   6. 5 dakika boyunca 2500 rpm'de mikrofuj tüpleri içerisinde soğuk hücreleri hasat. Aspire edilen süpernatan ve liziz tamponu içinde 120 ul içinde tekrar süspansiyon hücreleri. 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. 3 dakika boyunca 6,000 rpm'de bir mikrofüj içinde soğuk bir lizat açıklığa kavuşturulacaktır. Supe TransferiBir taze soğuk tüpe rnatant. -80 ° C'de saklayın
2. İmmunopresipitasyon
   1. 1 dakika boyunca 1000 rpm'de mikrofuj içinde protein G sefaroz boncuklar aşağı spin. Süpernatantı ve boncuklar 1 ml soğuk PBS ile 2x yıkayın. % 50'lik bir bulamaç yapmak için PBS eşit hacim. Her bir örnek için birincil antikor ve 20 ul% 50 Protein G boncuk ekleyin. O / N 4 ° C'de bir karıştırıcı üzerine - 2 saat boyunca inkübe edilir.
   2. 9.000 rpm'de soğuk mikrofüjde boncuk aşağı Darbe. Süpernatantı ve boncuk 150 ul soğuk lizis tamponu ile 2x yıkayın. 1 dakika 1.000 rpm'de soğuk mikrofüjde Spin. 2-merkaptoetanol (DİKKAT) ile 20 ul 2X SDS Örnek Tampon süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. -80 ° C'de hemen veya mağaza kullanın
   3. Bir SDS-PAGE Tris-glisin jel üzerinde 5 dakika ve çalıştırmak için kaynatın örnekleri. Bir nitroselüloz zara transfer proteinleri ve western blot ile bir protein fosfo-algılar.
   4. , Su ile yıkayın ve daha sonra leke,% 2 SDS içinde 62.5 mM Tris (pH 6.8), 0 inkübe edin.50 ° C'de 30 dakika boyunca 1 M β-merkaptoetanol (DİKKAT) , Su ile yıkayın ve daha sonra 2x çözeltisi sıyırma kaldırmak için TBS-T 5-6 değişiklikler 60-90 dakika boyunca yıkayın.
   5. Western blot ile total protein tespit.

2. Metilselüloz Deneyi

1. Steril bir büyük delik künt uç iğne kullanarak 50 ml konik tüpler içine metilselüloz insan taban ortamının Kısım 4 ml. (Not:. Metilselüloz kullanım öncesinde RT O / N ° C'de çözülme parçalara ayrılmış ve -20 ° C'de muhafaza edilebilir)
2. 10 saniye boyunca girdap metilselüloz ve 4 ml büyüme ortamı içinde 10x TKİ veya aracın 500 ul ekleyin.
3. Hasat ve sayım hücreler. Nihai hücre konsantrasyonu 10 kat daha yüksek olan bir konsantrasyonda, büyüme ortamı içinde bir hücre süspansiyonu hazırlanır. Metil karışımına 500 ul hücre süspansiyonu ekleyin. 10 saniye için Vortex ve kabarcıklar çıkarmak için 10 dakika bekletin.
4. 5 ml'lik bir şırınga ve steril bir larg kullanılarak metil 4 ml hazırlayınE künt uç iğne deliği. Kabarcıklar yukarı çizim kaçının. Üç adet 35 mm doku kültürü plakaları merkezine metilselüloz karışımının 1 ml dağıtın. Alt tamamen metilselüloz ile kaplıdır kadar bulaşıkları çalkalanır.
5. Her bir plaka için metilselüloz, nemli bir ortam sağlamak için, steril su ile doldurulmuş iki ek 35 mm doku kültürü plakaları bir steril 10 cm doku kültürü plakası hazırlanır. Su içinde yer kültürler 10-14 gün boyunca% 5 _CO2 içinde 37 ° C'de kuluçka ceketli.
6. 1-2 hafta sonra kolonileri sayın. Koloniler, 20 den fazla değildir ve üst üste hücre olmalıdır. Koloniler, bir ızgara ile bir mikroskop aşaması ile donatılmış içbükey bir mikroskop kullanarak ya da otomatik bir koloni sayacı kullanılarak sayılabilir. TKİ ile tedaviye yanıt olarak koloni büyüklüğü ve morfoloji açısından değişiklikler de değerlendirilmelidir. (4,5-Dimetil-2-tiyazolil) -2,5-difenil-2H-tetrazolyum bromid sol - (3 60-100 ul ekleyerek koloni sayacı, leke koloni tarafından tespit geliştirmekution (MTT, -20 ° C'de ₂ H, O, mağaza içinde 5 mg / ml, ışık, DİKKAT koruma) damla damla her plakanın yüzeyi üzerinde ve% 5 _CO2 içinde 37 ° C'de 8 saat boyunca inkübe.

3. Yumuşak Agar Tahlili

1. Alt katman, üst tabaka için% 0.7 asil agar ve 2x büyüme ortamı için% 1 asil agar hazırlayın. Bir 42 ° C su banyosu içinde 2 x büyütme ortamı dengelenmesi. Isı% 1 ve bir mikrodalga (yaklaşık 1 min/100 ml)% 0.7 agar asil ve 42 ° C su banyosunda dengeye. % 1 agar ve orta ve 2x 50 ml conicals ayrı olarak,% 0.7 agar ve 2x ortamının eşit parçaya karıştırın. Her bir katman için yumuşak agar karışımı, / altı oyuklu plakanın Plan 10 mi.
2. Etiket 6 oyuklu doku kültürü plakaları. 1.5 ml% 1, yumuşak agar karışımı ile de her doldurun. Kaplama sırasında kabarcıkları kaçının. 30 dakika süreyle steril kaput kapakları kapalı olarak kuru plakalar.
3. Hücreleri saymak. Nihai hücre konsantrasyon derecesinden daha 500x daha yüksek olan bir konsantrasyonda, büyüme ortamı içinde bir hücre süspansiyonu hazırlamaküzerinde. % 0.7 agar karışımına hücre süspansiyonu ekleyin, iyice karıştırın ve% 1 agar tabakasının üstüne agar hücre karışımı, 1.5 ml dağıtmak. Üst tabaka 30 dakika boyunca katılaşmaya edelim.
4. TKİ veya araç kontrolü içeren 1x büyüme ortamı hazırlayın. Üst agar tabakasının üstüne TKİ istenen konsantrasyonuna sahip orta 2 ml ilave edilir.
5. % 5 37 ° C'de 10 gün boyunca inkübe kültürler _CO2. Her 3 günde bir çıkarın ve kaplanacağı orta yerine.
6. Koloniler çıplak gözle, aspire bindirilirken orta görülebilir ve (4 ° C, H ₂ O, mağaza 1 mg / ml NBT ışık, DİKKAT korumak) 200 ul nitro-tetrazolyum mavi çözüm eklediğinizde. 24-48 saat için inkübatör dönmek. Sayılmadan önce en az 2 saat boyunca 4 ° C'ye kadar gider. Lekeli plakalar bir ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir. Bir mikroskop ya da otomatik bir koloni sayacı kullanılarak kolonileri sayın.

4. In vivo olarak, Phospho-protein önlemesinin değerlendirilmesi

1. C toplayınarşın 5 dakika boyunca 1500 rpm'de bir masa üstü santrifüj içinde log fazında büyüyen. Steril bir kez PBS ile yıkayın hücreleri ve uygun bir konsantrasyonda PBS içinde tekrar süspansiyon (tipik olarak 1-5 x 10 ⁷ hücre / ml). Bir 28 G insülin şırıngası kullanılarak kuyruk damarının içine damardan enjeksiyonu ile 6-12 haftalık NTG farelere 100 ul bir hacim içinde nakli hücreler. Damarları genişletmek için sıcak su bir beher içinde kuyruk ısı ve enjeksiyondan önce bir klorheksidin çubukla kuyruk temizlemek, süzgeç hayvan yerleştirin. Enjeksiyonundan sonra, kanama durana kadar steril gazlı bez ile enjeksiyon yerinde baskı uygulamak. Transplant en az 3 hayvan / grup. 1 mg / ml gentamisin sülfat içeren su fareler koruyun.
2. On dört gün post-transplant, hedef inhibisyonu analizi için TKİ veya sadece araç ve hasat örnekleri ile hayvanları tedavi. Hayvanlar tartılır ve uygun bir doz TKİ veya aracın (vücut ağırlığının mg / kg) ile tedavi edilir. 5 ml / k hacminde tedavi yönetmeoral gavaj ile intraperitoneal (ip) enjeksiyon ya da 10 ml / kg vücut ağırlığı ile g vücut ağırlığı. Ip enjeksiyon için, el ile tutmaya ve fare bir 29 G iğne kullanılarak karnın sağ alt kadranda enjekte edilir. Oral gavaj için, elle fareyi dizginlemek ve dik hayvan tutun. Dil üzerinde ve ağız arkasına ağız gavaj tüpü yerleştirin. Yemek borusu yoluyla ve mideye tüp geçmek için hafif bir baskı uygulayın. Tedavi yönetmek için şırınga pistonu basınız. Piston kolayca bastırın etmezse gavaj iğne çıkarılır ve tekrar yerleştirilmelidir. Kullanımdan hemen önce TKİ formülasyonları hazırlayın.
3. Pervanadate tedavi isteniyorsa, (aşama 1.1.4) yukarıda tarif edildiği gibi, hasattan önce PV çözelti 20 dakika hazırlamak ve 1 uM ^MgCl2 ve 100 U / ml DNase (120 ul PV + 880 ul ortam) ile ortam içine seyreltin. Not: PV seyreltildikten sonra en az 1 saat boyunca stabildir.
4. Ap CO ₂ narkoz tarafından hayvanların Kurbanpropriate süresi (ler) tedavi sonrası. Kemikleri tamamen maruz böylece tüm bacak kürk, deri ve kas kaldırarak femur teşrih. Sadece kalça eklemi altında ve yine diz eklemi üzerinde diseksiyon makas ile kırpma ile femur çıkarın. Bir şırınga ve bir 27 G iğne kullanılarak 1 ml soğuk PBS veya seyreltilmiş PV çözeltisi ile bir Petri kabı ve floş kemik iliği transferi. PV ile muamele halinde, 10 dakika boyunca, karanlıkta, oda sıcaklığında inkübe edilir.
5. Lizatlarını hazırlayın ve (adımlarla 1.1.6-1.2.5) yukarıda belirtildiği gibi phospho-protein ve total protein düzeyleri analiz.
6. Densitometrisi kullanılarak her numune için göreli fosfo-protein ve toplam protein seviyelerini belirlemek. Araç ile muamele edilen hayvanlar için ortalama phospho-protein/total-protein değerine phospho-protein/total-protein göreli olarak hesaplayın.

5. ALL Ksenograft Modeller TKIs anti-lösemi Aktivitesinin Değerlendirilmesi

1. Gerekirse, bir RS-2000 irradyatör bir gün prio radyasyonun 200 cGy fareler ortayanakli için r. (Adım 4.1) yukarıda tarif edildiği gibi lösemi hücre hatları ile farenin Transplant. Grup başına nakli en az 6 farenin. Kulak zımba tarafından fareler tanımlayın. Seçenek olarak ise, siyah bir işaretleyici kuyruklarını karma işaretleri fareler belirlemek için kullanılabilir. Çalışma sırasında kafes arkadaşı saldırganlık potansiyelini azaltmak için kafeslerine zenginleştirme ekleyin.
2. (Adım 4.2) yukarıda tarif edildiği gibi tek bir TKİ veya araç ile tedavi fareler. Fizik muayene ve kilo tespiti üzerinden günlük farelerin sağlık durumunu izlemek. Lösemi Beklenen semptomlar (aktivite düzeyi, kilo kaybı, arka bacak felci ve göz enfeksiyonları azalır). Kilo kaybı% 10'dan fazla% 15, genellikle iki gün içinde fare ölümü ile ilişkili olan ve tipik olarak standart IACUC şartlara uygun olarak ölüm için bir vekil uç nokta olmasıdır.
3. Haftalık 2 kata varan bir in vivo biyoparlaklık görüntüleme sistemi ile uyumunu ve lösemi gelişimini izleyin. Steri bir 200x D-lusiferin stok solüsyonu (30 mg / ml) hazırlayınle su. D-lusiferin tamamen eriyene kadar inversiyon yolu ile yavaşça karıştırın. -20 ° C'de kullanarak, hemen ya da kısım ve donma Önce oda sıcaklığında D-luciferase alikotları çözülme ve 15 mg / ml ve filtre bir 0.2 mikron filtre içinden sterilize bir son konsantrasyona PBS içinde 1:02 seyreltilmiş, bir in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak bio-ışıldama görüntüleme için.
4. Oksijen% 1.5 inhale izofluran ile görüntüleme önce fareler anestezi. Kas gevşemesi, hareket kaybı ve ayak tutam uyarılmasına tepki kaybı ile karakterize yeterli anestezi, izleyin.
5. Görüntülemeden hemen önce, ip enjeksiyonu (vücut ağırlığı 15 mg / ml lusiferin / g 10 ul) ile 150 mg / kg vücut ağırlığı D-luciferase yönetmek.
6. Ardışık 30, 60 ve 90 sn pozlama ve 120 sn pozlama ile bir nihai görüntü ile görüntülerin 2 serisi yakalamak için bir in vivo biyoparlaklık görüntüleme sistemi kullanın. Görüntüleme sonra kafeslere fareler dönmek ve anestezi kurtarma için monitör. Bağlı olarak,biyoluminesans yoğunluğu, maruz kalma süreleri değiştiirlebilir. Optimal etki süreleri belirli bir model için önceden belirlenmiş ve bireysel zaman noktaları için sinyal yoğunlukları, tüm çalışma boyunca karşılaştırılabilir olduğunu tutarlı gibi tutulmalıdır.
7. Yaşayan Image 3.2 toplama ve analiz yazılımı kullanarak her bir fare için biyoışıldama yoğunluğunu belirlemek. İkinci Her fare üzerinde aynı boyutta ilgi (ROI) bölgeleri çizerek fotonlar / ölçülen toplam akı değerlerini belirleyin.
8. % 15 den daha fazla kilo kaybı durumunda, felç sergileyen, can çekişen veya çalışmanın sonunda ise _CO2 maruz kalma ve servikal dislokasyon ile fareler kurban. Fareler ve kayıt gözlemler (; kemik iliği soluk dalak, karaciğer, lenf düğümleri ya da örneğin büyütme) teşrih. 27 G iğne kullanılarak femur ve soğuk PBS ile yıkayın kemik iliği teşrih.
9. 5 dakika boyunca 2500 rpm'de bir mikrofüj içinde hücreleri toplamak. 2% FBS içeren PBS içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.20 mg / ml DAPI (4,6-Diamidino-2-fenilindol dihidroklorür, 1:1000) ve FITC-konjuge α-hCD45 (1:100) veya fare IgG ₁ izotip kontrol antikoru (1:100) ile hücreler ve leke toplayın . Akım sitometri kullanarak lösemi engrafmanda değerlendirin. Canlı nüfus Kapısı (DAPI negatif) ve CD45 + hücrelerin (% kemik iliği blast) yüzdesini belirler.

Sonuçlar

Burada sunulan deneyler, TKIs tarafından aracılık edilen biyokimyasal ve fonksiyonel etkisini değerlendirmek ve in vitro ve in vivo hedef inhibisyon derecesi göre yeni bileşikler sıralama için kullanılabilir, koloni oluşumunun azaltılması ve NTG farelerde lösemi gecikmesi, lusiferaz-transplante lösemi hücrelerini etiketledi.

Bağışıklık beneklenme analizi TKIs ile tedavi sonrası lösemi hücrelerinde hedef proteinin aktif fosforilatlanmış biçimde önl...

Tartışmalar

Bu makale, akut lösemi tedavisinde yeni tirozin kinaz inhibitörlerinin değerlendirilmesi için etkili bir strateji tarif etmektedir. Bu yaklaşımı kullanarak, biyokimyasal ve anti-lösemi etkinlikleri in vitro hücre bazlı deneylerde ilk olarak değerlendirilir ve daha sonra in vivo ksenograft modellerinde edilir. Bağışıklık beneklenme analizi başarılı TKIs ile tedavi sonrasında lösemi hücrelerinde hedef tirosin kinazın engellenmesini göstermek için doğrudan hücrelerde çok sayıd...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
Hydrogen Peroxide	MP Biomedicals	#02194057	GHS05, GHS07, H302-H318
Sodium Orthovanadate	Sigma	#S6508	GHS07, H302+ H312+H332
2-Mercaptoethanol	Sigma	#M7522	GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410
ColonyGel Human Base Medium	ReachBio	#1101
3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)	Sigma	#M5655	GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341
Difco Noble Agar	BD Biosciences	#214883
Nitrotetrazolium Blue Chloride	Sigma	#N6639	GHS07, H302
D-Luciferin Firefly, Potassium Salt	PerkinElmer	#122796
4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride	Sigma	#D9542
FITC CD45	BD Bioscience	#347463
FITC Mouse IgG1 Isotype control	BD Bioscience	#51-35404X-2
Gentamycin Sulfate	Sparhawk	#NDC58005-633-04
Protease Inhibitors	Roche	#11836153001
DNase	Sigma	#D4263
Protein G Beads	Invitrogen	#10-1242
Isofluran	VETONE	#NDC13985-030-60
			Equipment
Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm	Nunclon	#D7804-500EA
Cell culture dishes, diam. 100 mm x  H 20 mm	Nunclon	#D8429-1CS
6-well plates	BD Bioscience	#353046
14 gauge x 4 inch blunt-end needles	Cadence science	#7956
5 ml syringe with luer-lok	BD Bioscience	#309646
GelCount automated colony counter	Oxford Optronix
In vivo bioluminescence imaging system	PerkinElmer	#IVIS200
Scout pro portable balances, scale	Ohaus	#SP202
Broome style rodent restrainer	Plas-labs	#551-BSRR
Ear punch, punch diameter: 2 mm	FST	#24210-02
Chlorhexidine swabs, Prevantics	PDI	#B10800
Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2	Monoject	#8881500042
Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile	Instech	#FTP-20-38
1 mL Luer-Lok disposable syringe	BD Bioscience	#309628
Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle	BD Bioscience	#329465
Extra fine bonn scissors	FST	#14084-08
Student fine scissors	FST	#91460-11
Moria ultra fine forceps	FST	#11370-40
Extra fine graefe forceps	FST	#11150-10
Scalpel handle	FST	#10003-12
Scalpel blades	FST	#10011-00