Planktonik Hücreler (MBC-P) ve Biyofilm Hücreleri (MBC-B) için Bir Antimikrobiyal Ajanın Minimal Bakterisidal Konsantrasyonunun Oluşturulması

Özet

Bu protokol, 96 kuyulu bir mikrotiter plaka kullanarak biyofilm in vitro oluşturabilen bakteriyel bir suş için planktonik ve biyofilm direnci arasında doğrudan bir karşılaştırma sağlar. Planktonik veya biyofilm bakterileri, tercih edilen antimikrobiyal ajanın seri seyreltmelerine maruz kalır. Canlılık, agar plakalarındaki büyüme ile test edilir.

Özet

Bu protokol, bir biyofilm in vitrooluşturabilen bakteriyel bir suş için planktonik ve biyofilm direnci arasında doğrudan bir karşılaştırma sağlar. Bakteriler 96 kuyulu bir mikroter plakanın kuyularına aşılanır. Planktonik test durumunda, tercih ettiği antimikrobiyal ajanın seri seyreltmeleri bakteriyel süspansiyonlara eklenir. Biyofilm testinde, aşılandıktan sonra, bakteriler belirli bir süre boyunca bir biyofilm oluşturmak için bırakılır. Eklenmemiş hücreler kuyulardan çıkarılır, ortam yenilenir ve tercih edilen antimikrobiyal ajanın seri seyreltmeleri eklenir. Antimikrobiyal ajana maruz kaldıktan sonra, planktonik hücreler büyüme için test edilir. Biyofilm tahlili için, medya antimikrobiyal ajandan yoksun taze medya ile yenilenir ve biyofilm hücreleri iyileşmeye bırakılır. Biyofilm hücre canlılığı iyileşme döneminden sonra test edilir. Antimikrobiyal ajan için MBC-P, planktonik kültürdeki hücreleri öldüren en düşük ilaç konsantrasyonu olarak tanımlanır.  Buna karşılık, bir suş için MBC-B, önceden biçimlendirilmiş biyofilmlerin 24 saat boyunca artan antimikrobiyal ajan konsantrasyonlarına maruz kalarak belirlenir. MBC-B, biyofilmdeki hücreleri öldüren en düşük antimikrobiyal ajan konsantrasyonu olarak tanımlanır.

Giriş

Antibiyotik direnci tahlilleri başlangıçta planktonik (serbest yüzme) bakteri kültürlerinin direncini test etmek için geliştirilmiştir. Birçok bakteriyel enfeksiyon biyofilmleri (yüzeye bağlı hücreler) içerdiğinden, biyofilme özgü antibiyotik direncini test etmek için bir yöntem geliştirmekle ilgileniyorduk. Bununla birlikte, antibiyotik direnci testlerinin çoğu biyofilmlerin direncini ölçmek için uygun değildir. Örneğin, minimum inhibitör konsantrasyonun (MIC) belirlenmesi, planktonik bakteri kültürlerinin antibiyotik direncini belirlemek için altın standarttır ¹. Bu test, seyreltilmiş bir planktonik kültürün bir seyreltme antibiyotik serisi ile karıştırılmasını gerektirir.  Planktonik hücrelerin görünür büyümesini engelleyen antibiyotik konsantrasyonu MIC'dir. Bu test büyümenin inhibisyonunu dayandığından, tanım olarak, önceden büyümüş bir biyofilmdeki hücrelerin antibiyotik duyarlılığını incelemeyi gerektiren biyofilm kültürleriyle çalışamaz. Burada açıklanan MBC-B tahlili, büyüme inhibisyonunu ölçmek yerine, bir biyofilmde zaten var olan hücreleri öldüren antibiyotik konsantrasyonunu belirler. Bu nedenle, bu test yerleşik biyofilm enfeksiyonlarının antibiyotik tedavilerini taklit etmeyi ve bakteriyelantibiyotik direncinin vivo daha alakalı bir görünümünü sağlamayı amaçlamaktadır.

Biyofilmler genellikle planktonik kültürlerden daha antibiyotik dirençli olduğundan ^2-4 Bir biyofilmin antibiyotik direncini planktonik bir kültürünkiyle doğrudan ilişkilendiren bir yöntem tasarlamak gerekiyordu. Bu nedenle, bu yöntemin bir diğer amacı, planktonik ve biyofilm hücreleri arasındaki antibiyotik direnci seviyesini doğrudan karşılaştırabilmektir. Burada açıklanan MBC-P ve MBC-B tahlilleri bunu mümkün kilmektedir çünkü hücreler benzer koşullar altında kültürlenir. Biyofilme özgü antibiyotik direnci için önemli olan birkaç geni incelemek için bu yöntemi kullandık ^5-8 .

Protokol

1. MBC-B

1. Bir biyofilm yetiştirmek (O'Toole 9'dan^{uyarlanmıştır).}
   1. 37 °C'de zengin bir ortamda 16 saat boyunca vahşi tip ilgi ve mutant suşu kültürünü büyütün.
   2. Doymuş gece kültürlerini 1:100 antibiyotik direnci tahlilleri için taze ortama seyreltin. P. aeruginosa için standart bir ortam, magnezyum sülfat ve arginin ile desteklenmiş M63 minimal ortadır (bkz. Tablo 1). Bu ortam daha sağlam bir biyofilm oluşumunu uyarır.
   3. 96 kuyulu bir mikrotiter kabına kuyu başına 100 μl seyreltme ekleyin (bkz. Tablo 1). Bu tahliller tipik olarak her suş için üç taraflı olarak yapıldığı için, her suşun 24 kuyusu olmalıdır.
   4. Mikrotiter plakayı 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.
2. Önceden biçimlendirilmiş biyofilmin bir konsantrasyon gradyan antibiyotikine maruz getirilmesi
   1. 7 kuyu için 10x seyreltme antibiyotik serisi hazırlayın. Örnek: antibiyotik tobramycin için, kuyulardaki son konsantrasyonlar 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125 ve 0.006 mg/ml ^5-8'dir. 25 mg/ml'lik bir stoktan 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 ve 0,06 mg/ml'lik 10x seyreltmeler hazırlayın. Buzun üzerinde bırak.
   2. Harcanan süpernatant (planktonik hücreler içeren) çok kanallı pipet kullanarak çıkarın (bkz. Tablo 1).
   3. Tüm kuyulara 90 μl M63 (Mg/Arg) ekleyin.
   4. İstenilen son konsantrasyonları elde etmek için her 10x antibiyotik konsantrasyonunun 10 μl'sini ekleyin. Her çoğaltma ve gerinim için son kuyuya 10 μl su (antibiyotik kontrolü yok) ekleyin.
   5. Mikrotiter plakayı 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.
3. Ortamı yenilemek ve canlı hücrelerin birliğine izin vermek.
   1. Harcanan süpernatant (planktonik hücreler içeren) çok kanallı pipet kullanarak çıkarın.
   2. Tüm kuyulara 115 μl M63 (Mg/Arg) ekleyin.
   3. Mikrotiter plakayı 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.
4. Canlı hücreler için test.
   1. 96 kuyulu mikroter plaka başına iki LB agar plakası etiketle.
   2. Uçları % 100 etanol içine batırarak ve uçları bir Bunsen brülörünün açık alevinden geçirerek çok ürünlü cihazı sterilize edin (bkz. Tablo 1). yinelemek. Uçları hafifçe soğumaya bırakın. Çok yönlü cihazı kullanarak, mikrotiter plakanın her kuyusundan lb agar plakasının yüzeyine planktonik kültürün ~3 μl'yi (tipik olarak uçlarda tutulan miktar) aktarın.
   3. LB agar plakalarını 37 °C'de 16 saat kuluçkaya yatırın.
   4. Bakteri üremesi için kesileni gözle tanımlayarak antibiyotiğin minimum bakterisidal konsantrasyonunu belirleyin (Şekil 1).

2. MBC-P

1. Bakteri suşlarının hazırlanması
   1. 37 °C'de zengin bir ortamda 16 saat boyunca vahşi tip ilgi ve mutant suşu kültürünü büyütün.
   2. Doymuş gece kültürlerini 1:100 antibiyotik direnci tahlilleri için taze ortama seyreltin. P. aeruginosa için standart bir ortam, magnezyum sülfat ve arginin ile desteklenmiş M63 minimal ortadır (bkz. Tablo 1).
   3. 96 kuyulu bir mikrotiter kabına kuyu başına 90 μl seyreltme ekleyin (bkz. Tablo 1). Bu tahliller tipik olarak her suş için üç taraflı olarak yapıldığı için, her suşun 24 kuyusu olmalıdır.
2. Planktonik hücreleri antibiyotik konsantrasyon gradyanine maruz kalma
   1. 7 kuyu için 10x seyreltme antibiyotik serisi hazırlayın. Örnek: Antibiyotik tobramycin için kuyulardaki son konsantrasyonlar 0.032, 0.016, 0.008, 0.004, 0.002, 0.001 ve 0.0005 mg/ml'dir. 25 mg/ml'lik bir stoktan 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 ve 0,005 mg/ml'lik seyreltmeler hazırlayın. Buzun üzerinde bırak.
   2. İstenilen son konsantrasyonları elde etmek için her 10x antibiyotik konsantrasyonunun 10 μl'sini ekleyin. Her çoğaltma ve gerinim için son kuyuya 10 μl su (antibiyotik kontrolü yok) ekleyin.
   3. Mikrotiter plakayı 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.
3. Canlı hücreler için test.
   1. 96 kuyulu mikroter plaka başına iki LB agar plakası etiketle.
   2. Uçları % 100 etanol içine batırarak ve uçları bir Bunsen brülörünün açık alevinden geçirerek çok ürünlü cihazı sterilize edin (bkz. Tablo 1). yinelemek. Uçları hafifçe soğumaya bırakın. Çok yönlü cihazı kullanarak, mikrotiter plakanın her kuyusundan lb agar plakasının yüzeyine planktonik kültürün ~3 μl'yi (tipik olarak uçlarda tutulan miktar) aktarın.
   3. LB agar plakalarını 37 °C'de 16 saat kuluçkaya yatırın.
   4. Bakteri üremesi için kesileni gözle tanımlayarak antibiyotiğin minimum bakterisidal konsantrasyonunu belirleyin (Şekil 2).

Sonuçlar

PA14 vahşi tipinin hassasiyetini PA14 ∆ndvBile karşılaştıran MBC-P ve MBC-B tahlilleri gerçekleştirildi. Antibiyotik olarak tobramycin kullanıldı. Adım 1.4.4 (Şekil 1) ve adım 2.3.4 (Şekil 2) 'ye karşılık gelen sonuçlar sunulmuştur. PA14 ve ∆ndvB üç taraflı olarak MBC-P ve MBC-B testlerine aşılandı. MBC-B protokolünün 1.0-1.4 ve MBC-P protokolünün 2.0-2.3. Hücrelerin solunda tobramycin(μ...

Tartışmalar

Planktonik hücrelerde antibiyotik direnci, hücrelerde kalıcı bir değişiklik (örneğin bir mutasyon) nedeniyle bir antibiyotiğin minimum inhibitör konsantrasyonunda (MIC) bir artış olaraktanımlanır. Bugüne kadar tanımlanan biyofilme özgü direnç veya tolerans mekanizmaları, biyofilmler içindeki vahşi tip genlerin ekspresyonunun sonucudur. Bu nedenle, klasik direnç tanımı biyofilmler için geçerli değildir. Bununla birlikte, başka bir tanım kümesi sunulmuştur: direnç mekanizmaları an...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x M63			Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature.  Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
KH2PO4	Fisher	P285-500
K2HPO4	Fisher	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500	Add to 1 mM final concentration.  Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
Tobramycin	Sigma		Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C.
Arginine	Sigma	A5131	Add to 0.4% final concentration.  Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize.  This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
96-well microtiter plates	Corning	3595	Sterile, flat-bottom, low evaporation
Tranferpette (multichannel pipette)	BrandTech	2703610	8-channel, 20-200 μl
Multiprong device	Dan-Kar	MC48	48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate