Için Mikrometrik Sondalar uzaktan manyetik uyarılı<em&gt; In situ</emBakteriyel biyofilm Fiziksel Özelliklerinin&gt; 3D Mapping

Özet

Bu çalışma, bir ince biyolojik bakteri tabakası ve in situ ara yüzeylerde mikro-organizmalar tarafından yapılmış karmaşık yaşam malzemenin lokal mekanik özelliklerini ölçmek için özel bir manyetik cımbız geliştirilmesi tohumlanmış manyetik parçacıkların uzaktan harekete dayalı orijinal bir yöntem göstermektedir.

Özet

Arabirimlerde Bakteriyel yapışma ve bir büyüme üç boyutlu heterojen yapılar olarak adlandırılan biyofilm oluşumuna yol açar. Bu yapılar konut hücreler, hücre-dışı polimerik madde bir ağ aracılığı ile fiziksel etkileşimler ile bir arada tutulur. Bakteriyel biyofilm birçok insan faaliyetlerini etkileyecek ve onların özelliklerinin anlaşılması gelişim daha iyi bir kontrol için çok önemlidir - bakım veya eradikasyonu - bunların olumsuz ya da olumlu sonuca bağlı. Bu çalışma, şimdiye kadar, sadece bir makroskopik ve homojen malzeme açısından incelendiğinde, yerinde olmuştu biyofilm lokal fiziksel özellikleri ölçmek için hedefleyen yeni bir yöntem tarif eder. Burada tarif edilen deney, uzaktan biyofilm yapısal özelliklerini bozmadan işletilebilen lokal probları tohum için büyüyen bir biyofilm içine verilmesi manyetik parçacıklar içerir. Adanmış manyetik cımbız deve vardıbiyofilm gömülü her parçacık üzerinde tanımlı bir kuvvet uygulamak için miştir. Kurulum parçacık çekme dönemi time-lapse görüntülerin kaydını etkinleştirmek için bir mikroskop sahnede monte edilir. Parçacık yörüngeleri sonra çekme dizisinden ekstre edilir ve yerel viskoelastik parametreleri ve böylece parametrelerin 3D-uzaysal dağılımının sağlanması için, her parçacık deplasman eğrilerinden elde edilmiştir. Biyofilm mekanik profili içine anlayışlar kazanıyor mimari özellikleri ve bu yapıların belirli biyoloji arasındaki ilişkiyi netleştirmek için biyofilm kontrol amaçlı bakış bir mühendisin açısından değil, aynı zamanda temel bir bakış açısıyla esastır.

Giriş

Bakteriyel biyofilm biyolojik veya yapay zeminlerde ^1-3 ile bağlantılı bakteri toplulukları vardır. Bunlar, bu yapı ^4,5 korur ve stabilize polisakarit açısından zengin hücre-dışı matrisin üretimi ile bağlanmış bir yapışma büyüme mekanizma ile oluştururlar. Bu biyofilm yüzeylere yapışmış hücrelerin sadece pasif topluluğu değil, ama örgütlü ve dinamik, karmaşık biyolojik sistemleri. Bakteri biyofilm yaşam tarzına planktonik geçtiğinizde, gen ifadesi ve hücre fizyolojisi değişiklikleri antimikrobiklere artan direnci yanı sıra gözlenen ve bir çok kalıcı ve kronik enfeksiyonların ⁶ kökenli olmanın bağışıklığı ev sahipliği vardır. Ancak, bu canlı yapıların kontrollü gelişimi de bu tür tehlikeli atık sahalarının biyoremediasyonda, endüstriyel su veya Kirlenmiş toprağı ve yeraltı sularını korumak için biyo-engellerin oluşumu biyo-filtre olarak endüstriyel ve çevre uygulamaları için fırsatlar sunuyortirme.

Yaşam biyofilm şekilde spesifik moleküler özellikleri giderek tarif edilirken, toplum kalkınması ve sebat sürüş mekanizmalar belirsizdir. Tarama elektrokimyasal veya floresan mikroskobu kullanarak microscale ölçümlerde son gelişmeleri kullanarak, bu canlı örgütler yapısal, kimyasal ve biyolojik heterojenite ⁷ önemli sergiledikleri gösterilmiştir. Oysa, şimdiye kadar, biyofilm mekaniği ağırlıklı makroskopik incelenmiştir. Örneğin, biyofilm flamalar gözlenmesi nedeniyle sıvı akış oranlarında ^8,9 değişimlere deformasyon, biyofilm adet tek eksenli sıkıştırma agar ortamından kaldırın veya kapak sonra ^10,11, çevreden toplanan biyofilm kesme ve bir paralel transfer slaytlar üzerinde büyüdü plaka rheometre ^12,13, AFM konsol ¹⁴ veya özel bir MICR bağlı bir bakteriyel biyofilm ile cam boncuk ve kaplamalı kullanarak atomik kuvvet spektroskopisimüstakil biyofilm parçalarının ^15,16 çekme kuvvetinin ölçülmesi için ocantilever yöntem olup, malzeme ¹⁷ viskoelastik doğası hakkında yararlı bilgi veren, son on yıl içinde uygulanmıştır. Ancak, bu madde genellikle bu yaklaşımlarda olduğu ve kendi doğal çevresi, çıkarıldığında in situ biyofilm mekanik özellikleri üzerinde bilgiler kaybolur gibi görünmektedir. Ayrıca, homojen bir malzeme olarak biyofilm tedavi toplum içinde fiziksel özelliklerinin olası heterojenliği hakkında bilgi kaçırır. Bu nedenle, yapı, biyofilm içinde mekanik ve bu gen ifadesi modelleme veya kimyasal gradyanlar gibi biyolojik özelliklerin tesisinin etkileri hemen hemen tanınabilir. Biyofilm fiziksel özelliklerinin bir mikro tanımı doğru ilerlemeye, yeni özel aletler gereklidir.

Bu kağıt elde etmek için tasarlanmış özgün bir yaklaşım detaylarıbiyofilm rahatsız ve mikro malzeme özelliklerinin mekansal dağılımı çizim ve daha sonra mekanik heterojenliğini sağlayan olmadan yerinde yerel mekanik parametrelerin ölçümü. Deneyin ilkesi, olgun biyofilm manyetik cımbız kullanarak uzaktan yükleme ardından manyetik mikro büyüyen bir biyofilm doping üzerinde durmaktadır. Mikroskop altında görüntülenmiş kontrollü manyetik kuvvet uygulaması altında parçacık deplasman yerel viskoelastik parametresi türetme, kendi yerel çevre raporlama her parçacık sağlar. Bu verilerden, biyofilm 3B mekanik profil mekansal ve çevresel durum bağımlılıkları açığa çizilebilir. Bütün deney, E. burada gösterilir Bir zorlandığı F-benzeri plazmid taşıyan bir genetiği suşu tarafından yapılan coli biyofilm. Son kağıt ^18'de detaylı sonuçlar bozulmamış biyofilm mekaniğinin iç benzersiz bir vizyon sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1.. Bakteriler Kültür ve Süspansiyon Hazırlanması

1. , Bir lizojeni Broth (LB) agar plakasından bir taze koloni yetiştirilen Seçim sıvı LB ortamı içerisinde 100 μ g / ml ampisilin ve 7.5 μ g / ml tetrasiklin ihtiva eden 5 ml içinde inoküle ve 37 ° C'de 5-6 saat süreyle inkübe bir çalkalama platformu.
2. Daha sonra, en az ortam (M63B1)% 0.4 glikoz ve aynı antibiyotik konsantrasyonları ile desteklenmiş 5 ml bakteri kültürü 100 μ ilave edin. Bir çalkalama platformu üzerinde 37 ° C 'de bu yeni seyreltilmiş kültür gece boyunca inkübe edin.
3. Kuluçkadan 16 saat sonra, 5 ml M63B1,% 0.4 glikoz, gece boyunca kültürün 100 ul ekle. 0.5 OD kadar çalkalama platformunda 37 ° C'de tüp Ol ulaşılır. Süspansiyon, biyofilm formasyonu için deney kanal içine enjeksiyon için hazırdır.

2.. Manyetik Parçacık Hazırlık

1. 10 ul manyetik parçacıkların alın -2.8 μ m çapında - stoktan ve yıkayınız manyetik örnek rafın yardımı ile 190 ul ortam içinde en az 3 kat.
2. 5 x 10 ⁶ boncuk / ml parçacık konsantrasyonu ayarlayın. Tipik olarak, yıkanmış boncuk çözeltisi 50 ul% 0.4 glukoz ile M63B1 bir başka 950 μ l ile karıştırılır.

3.. Kanal Hazırlama ve Biyofilm Büyüme

1. Kanal Montaj
   1. İki 8 cm uzun parçalar elde etmek için 10 cm uzunluğunda iki kare (800 μ m kenar uzunluğu) borosilikat cam kılcal damarları kesilmiş.
   2. Ilk yarıda kesmek - - 2 cm arayla 1 cm çıkıntı ile iki ucunda, Şekil 1 deki gibi (yani süper yapıştırıcı denir) hızlı etkili siyanoakrilat tutkal kullanarak iki cam slaytlar üzerine iki kılcal adet Tutkal.
   3. Tüm kurulum ve daha fazla kanal bağlantısı için gerekli olan boru otoklavlayın.
   4. Tüm steril malzemeler altında toplamakLaminer akış kaputu: i) monte kanal ve tuzak 1, ii) boru ve bağlantıları, iii) iki kabarcık tuzakları - kabarcık filtre yaygın çocuk damla-besleme (tuzak 1) ve ev yapımı kabarcık tuzak güvenliğini sağlamak için kullanılan daha büyük bir çapa sahip olan bir 4 cm uzun bir boru (trap 2) gibi, iv) kelepçeler, v) M63B1,% 0.4 glukoz, ve vi) atık şişe ile doldurulmuş 30 ml şırınga.
   5. Atık şişeye şırınga pompası, çocuk kabarcık filtre, ev yapımı kabarcık tuzak, kılcal (Şekil 1 Panel B) ve tüp ile kontrol edilen 50 ml M63B1 şırınga: aşağıdaki sırayla Luer Lock konnektörleriyle veya birleşme ile bütün kurulum bağlayın. Daha sonra, yaklaşık 10 ml / saat, deney oranları daha yüksek bir oranda bir şırınga pompası açmadan, steril M63B1,% 0.4 glukoz ile birlikte kurulum doldurun. Dikkatle izlemek ve devredeki tüm kabarcıklarını yok.
   6. 10-15 dakika boyunca sistem üzerinden orta akış; eş zamanlı bölüm den 0.5 OD da bakteri süspansiyonu 1 ml karıştırınBölüm 2.2 'de hazırlanan yıkanmış boncuk çözeltisi, 1 ml ile 1.3.
   7. Öncesi ve sonrası kılcal damarlar: takın (ancak kapatmayın) iki pozisyonlarda boru kelepçeleri. Akışını kapatın.
   8. Tüpü tutmak için özen hava girişini önlemek için biter, 1 ml şırınga kullanarak ev yapımı baloncuk kapanı sonra tüpün içine bakteri-boncuk karışımı tanıtmak. Tüp yeniden takın ve ardından kelepçeler kapatın.
   9. İkinci kılcal için aynı işlemleri tekrarlayın ve baloncuklar için tüm tüpleri kontrol edin.
   10. Mikroskop için transfer aparatı ve yerleşmek ve kılcal yüzeyine bağlamak için bakteri sağlamak için, 15-20 dakika boyunca bekletilmesi. Biraz daha yüksek bir düzeyde atık konteyneri mikroskop sahneye kılcal takın. Mikroskop yanında tezgah üstü üzerine şırınga pompası yerleştirin. Kabarcıklar yakalamak için kılcal düzlemine göre biraz daha yüksek bir kılcal önce kabarcık tuzak yükseltin.
2. Biyofilm Growth
   1. Genellikle 24 veya 48 saat, bu deneylerde - şırınga pompası akış hızını ayarlamak ve akışını başlatmak, biyofilm artık gerekli süre boyunca kılcal yüzeyde geliştirecektir.
   2. Kılcal alt düzlemde odaklanın ve örnek görüntülerin time-lapse kayıt başlamak - 2 görüntülerin genellikle bir toplama frekans / dk yeterli biyofilm büyüme rapor edecektir. Bu video monitörleri biyofilm büyüme sonrası-kontrol (Video 1, 2 özleri görmek ve 3).

4. Manyetik Cımbız Kurulum

1. Elle kontrol XYZ mikromanipülatörler manyetik cımbız vida ve nispeten kılcal cımbız konumunu ayarlamak için mikroskop sahnede mikromanipülatörler vida. Uygun manyetik alan gradyanı gözlem bölgesinde üretilen sağlamak için, Şekil 2'deki gibi cımbız yerleştirin.
2. Cımbız t bağlayıno güç amplifikatörü ile fonksiyon jeneratörü 24 saniye sıfır sinyal ve 4, bir dizi sinyal senkronizasyon sağlamak için 20 saniye sonra parlak saha ışık çekim gönderilen bir tetikleyici doğru akım ile 16 saniye yapılmış bir zaman 40 saniye süre üretmek için Şekil 3'te gibi olaylar.
   Not: Bu iki işlem kılcal yükleme ve ölçüm başı arasında her zaman elde edilebilir. Şekil 4'te genel kroki deney bakın.

5.. Sünme Eğrisi Edinme

1. Sol taraftaki manyetik kutup ve aynı gözlem alanında kılcal sol taraftaki kenar kenarını getirmek için mikroskop kademesinin xy hareket kontrolü kullanın. (Şekil 2), sırasıyla, kılcal kenarı tarafından belirlenen x-ve y-eksenleri kesiştiği ve kutup parçasının kenarında analizi, Referans kökenini al.
2. Ince odak c kullanarak kılcal dikey konumunu ayarlamakmikroskop pozisyon ontrol topuzu. Genellikle ilk muayene uçak μ 4-7 m arasında kılcal alt üzerinde yer almaktadır. Video 1. mekansal göndergesel kökeni onun sol üst köşesi vardır xy alanına karşılık gelir.
3. Mevcut jeneratörün üzerinde ve aynı zamanda geçiş yaparak Bölüm 4.2 ve Şekil 3'te anlatılan olayların 40 sn dizisini tetikleyecek, elle video 1 görüntü toplama dizisini tetikleyebilir.
4. Gerekli videoları elde etmek böylece sola mikroskop aşamasında bir 250 μ m çeviri tarafından komşu hakkı alana kılcal hareket ve dilim 2 video 2 oluşturmak için bölüm 5.3 olarak çalışan ve. 250 x 250 μ m ² Tipik haliyle 3-4 alanları uçak değiştirilmesi ve yeni bir uçak için aynı işlemleri tekrar önce, x-ekseni boyunca toplanır.

6.. Kuvvet Kalibrasyon

1. Bi-damıtılmış su 190 μ l ve 2 x 10 ⁹ parçacıklar / ml 'de manyetik parçacıklar 10 ul gliserol 39.8 g karıştırarak bir gliserol çözeltisini hazırlayın ve bu karışım ile deneysel kanalı doldurmak ve mikroskop sahne üzerine yerleştirin biyofilm örnek için tarif edildiği gibi.
2. 4. bölümde belirtildiği gibi manyetik cımbız kurduktan sonra, bölüm 5.4 'de belirtildiği gibi manyetik kuvvet uygulamak ve kalibrasyon dosyasını elde etmek için kılcal her bir parçacık hızı (v) ve konumunu ayıklamak için zaman atlamalı görüntüler olun. Bu dosya stokes hukukuna göre kılcal analiz bölgesinde konumunun bir fonksiyonu olarak uygulanan kuvveti içermelidir, F = 6πRηv (R: partikülün çapı).

7. Analizi

1. 5. bölümünde belirtildiği gibi kazanılmış görüntülerin tüm yığınları için her karede parçacık konumları ile metin dosyalarını almak için bir "parçacık izci" yazılımını kullanın. Istimalg görüntü yığını elde etme sıklığı, zamanın bir fonksiyonu olarak parçacık yer değiştirme (örneğin, Şekil 5 ve Video 4) hesaplar.
2. Kuvvet kalibrasyon dosyasını kullanarak, uyum eğrilerine yer değiştirme eğrileri dönüştürmek (- J (t) - malzemenin toplam uyum zamanın bir fonksiyonu olarak) uyum formüle göre:
   
   bu malzemenin gerilme arasındaki ilişkiyi verir ve daha önce Schnurr ve iş ¹⁹ tarafından tespit edilen bir sıkıştırılamaz, homojen bir viskoelastik bir ortam içinde gömülü yarıçapı R bir sonda parçacık için stres uygulanan.
3. Viskoelastik malzemeler için genel Burgers modeline uyum sürünme eğrileri ayarlayın ve viskoelastik parametreler, J ₀ türetmek, J _1, η _0, her parçacık için η ₁ ( Şekil 6) Burgers formüle göre:
   
   Not: Bu olgusal analizi daha önce böyle makroskobik rheolojisi Verilere ^20-22 yorumlamak biyofilmlerin gibi biyolojik malzemeler dahil geniş bir malzeme yelpazesi için istihdam edilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Tipik bir analiz orijinal düzeni bozmadan canlı bir biyofilm üzerinde mikron ölçeğinde viskoelastik parametrelerin dağılımını sağlar. Elastik uyumluluk - - derinliği boyunca ve biyofilm bir yan boyut boyunca y-ekseninin z-ekseninin bir fonksiyonu olarak verilir Tipik sonuçlar J ₀ değerleri Şekil 7 'de gösterilmiştir. Her nokta sürünme eğrisi analizi J ₀ değer sağlamıştır bir boncuk karşılık gelir. Veri neredeyse üç büyüklükte emir ama aynı zam...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu manyetik parçacık tohumlama ve özgün durumuna büyüyen bir biyofilm viskoelastik parametrelerinin yerinde 3D ​​haritalama etkin deney çekerek. Bu yaklaşım E. mekanik heterojenitesini ortaya coli biyofilm burada büyüyen ve güçlü bir temel hücre dışı matrisin anlamı ve çapraz bağlama derecesini daha doğrusu düşündüren, biyofilm fiziksel özellikleri destekleyen biyofilm bileşenleri işaret ipuçları verdi.

Biyolojik bakteri ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: Reagents and cells
Magnetic particles	Life technologies	14307D	Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter
Ampicillin (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	A9518
Tetracycline (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	87128
Bacterial strain MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, France		Produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline.
Table 2: Capillaries and tubing
Filters for pediatric perfusion	Prodimed-Plastimed	6932002
Hollow Square Capillaries	Composite Metal Scientific	8280-100	Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8 mm x 0.8 mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0512	Diameter 1 mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0700	Diameter 3 mm
Table 3: Biofilm growth
Lysogeny Broth (LB) solution	Amresco-VWR	J106-10PK	Standard medium used to grow bacteria.
M63B1 solution	Home-made		Standard minimum medium used to grow bacteria.
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose.
Table 4: Electronics
Camera EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
Heater controller	World precision instruments	300354
Function generator	Agilent technologies	33210A
Power amplifier	Home-made		It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.
Syringe pumps	Kd Scientific	KDS-220
Shutter	Vincent Associates	Uniblitz T132
Magnetic tweezers	Home-made		Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Figure 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.
Table 5: Optics
Inverted microscope	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		This a long working distance objective enabling observation of the biofilm in the depth.
Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20  2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.
Table 6: Image analysis
ImageJ	NIH - particle tracker plugin