Primer Ortotopik Glioma Xenografts Infiltratif Büyüme ve İsocitrat Dehidrogenaz I Mutasyonu Rekapitulate

Özet

Malign gliomalar, farklı klinik ve moleküler özelliklere sahip heterojen bir yüksek infiltive glial neoplazm grubunu oluşturur. Primer ortotopik ksinograftlar preklinik hayvan modellerinde malign glioma alt tiplerinin histopatolojik ve moleküler özelliklerini rekapitulate eder.

Özet

Malign gliomalar, farklı klinik ve moleküler özelliklere sahip heterojen bir yüksek infiltive glial neoplazm grubunu oluşturur. Primer ortotopik ksinograftlar preklinik hayvan modellerinde malign glioma alt tiplerinin histopatolojik ve moleküler özelliklerini rekapitulate eder. Transplantasyon tahlillerinde WHO sınıf III ve IV malign gliomaları modellemek için, insan tümör hücreleri immün sistemi baskılanmış farelerin ortotopik bölgesine, yani beyne ksinografize edilir. Kültürlü tümör hücrelerini kullanan ikincil ksinograftların aksine, insan glioma hücreleri resected örneklerden ayrıştırılır ve birincil ksinograftlar oluşturmak için doku kültüründe önceden geçiş olmadan nakledilür. Bu rapordaki prosedür, tümör numunesi hazırlama, bağışıklık sistemi baskılanmış farelere intrakraniyal transplantasyon, tümör engraftmentinin izlenmesi ve alıcı hayvanlara veya analize sonraki geçiş için tümör hasadını detaylandırmamaktadır. Tümör hücre hazırlama 2 saat, cerrahi işlem ise 20 dk/hayvan gerektirir.

Giriş

Malign gliomalar, beyinde ve bazen omurilikte meydana gelen merkezi sinir sisteminin primer glial tümörleridir. Gliomalar Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından astrositlere, oligodendrositlere veya ependymal hücrelere histolojik benzerliğe göre sınıflandırılır ve daha sonra malignitenin patolojik özellikleri için sayısal olarak (I ila IV) derecelendirilir. En sık görülen histolojik alt tipler astrositomlar, oligodendrogliomalar ve karışık oligoastrositomlardır. WHO'nun II ila IV sınıflarını kapsayan malign gliomalar invaziv büyüme ve mevcut tedavilere yeniden hesaplama ile karakterizedir. Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl yaklaşık 15.750 kişiye malign glioma tanısı konulmaktadır ve tahmini 12.740 hasta bu hastalığa yenik düşmektedir. Bu istatistikler, malign gliomaların özellikle ölümcül doğasını ve gelişmiş terapötik etkinlik için önemli ihtiyacı vurgulamaktadır.

Kanser modelleri tümör biyolojisi ve tedavilerinin araştırılması için gereklidir. İnsan kanser hücre hatları in vitro manipülasyonlar ve in vivo ksinografting çalışmaları (ikincil ksinograftlar) için önemli bir ilk adımı temsil eder¹. Bununla birlikte, standart kanser hücre kültürleri, ikincil ksinograftlarda geri yüklenemeyen fenotipik ve genotipik dönüşüm^2-4'e tabidir⁵. Ayrıca kanser hücre kültürlerinde izoitrat dehidrogenaz(IDH)mutasyonları⁶, farklı kök hücre popülasyonları⁷ ve anahtar sinyal yollarına bağımlılık⁸ gibi genetik değişiklikler kaybedilebilir. Genomik profiller kanser küre kültüründe daha iyi ölçüde korunabilir, ancak yine de primer tümörlerin genotipini tam olarak yansıtamaz^2,3. Doğrudan ortotopik transplantasyon in vitro kültürün etkilerini olumsuzlar, uygun bir mikroçevrme sağlar ve tümör başlatan hücrelerin bütünlüğünü korur^9,10. Bu nedenle, birincil ksinograftlar, gelecekteki klinik çalışmaların rasyonel tasarımına yardımcı olmak için hedeflenen ajanları titizlikle test etmek için güçlü ve ilgili bir preklinik modeli temsil eder^5,11,12.

Protokol

1. Tümör Hücre Süspansiyonunun Hazırlanması

Not: Primer ortotopik glioma ksinograftlarının kurulması ve sürdürülmesi için hasta materyali ve hayvanların kullanımı için uygun kurumsal onaylar gereklidir. Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi'nde, tanı amaçlı gerekli olandan daha fazla resected tümör materyali, bir araştırma dokusu deposu için hasta onayı ile toplanır. Örnekler randomize 5 haneli REDcap veritabanı numarası ile etiketlenir ve hastaya özgü tüm tanımlayıcılar kaldırılır. REDcap veritabanı, doku deposundaki her örnek için cinsiyet, yaş (yıl), ırk, sağkalım durumu, patoloji, kanser tedavileri, rezeksiyon yılı ve ilerleme süresini içeren düzenli klinik veriler içerir. Steriliteyi korumak ve birincil ksinograft yönteminin başarısını optimize etmek için, tüm reaktifler, buharla otoklavlanmış cerrahi aletler ve cerrahi bölge önceden monte edilmeli veya hazırlanmalıdır.

Not: Glioma örnekleri genellikle büyük miktarlarda miyelin ve döküntü içerir. Numune boyutuna bağlı olarak, miyelin ve döküntülerin yeterli şekilde giderilmesi için 4'ten fazla süreksiz gradyan tüpü kullanmak gerekebilir.

Not: İşlem, kalan veya çok az, açıkça görülebilen bir doku kalmadığında tamamlanır. Tritürasyon işlemi sırasında kabarcıkların tanıtılmasından kaçının.

Not: Ayrışmayı takiben hücre canlılığı tipik olarak %90 >. Daha düşük yükümlülükler, suboptimal doku elleçleme veya ameliyathaneden taşıma süresi, kriyoprezervasyon yöntemi veya papain ayrışma tekniği dahil olmak üzere birçok değişkeni yansıtabilir. Bununla birlikte, uygun hacimde yeterli sayıda canlı nakledilebileceği sürece, daha düşük hücresel canlılıklar hala yeterli olabilir. Her fare için 50.000-200.000 canlı hücre 2 μl hacimde implante edilir. Şırınga iğnesinin eğimli ucu nedeniyle, her enjeksiyon için şırıngaya yeterli malzemenin çekilebilmesini sağlamak için son hacme 5 μl hücre süspansiyonu eklenmelidir. Örneğin, 5 fare için 2 μl / fare enjekte etmek için son hacim 15 μl (15 μl = (5 x 2 μl) + 5 μl olmalıdır.

1. Laboratuvara taşınmak üzere buz üzerinde steril, kaplanmış bir kaba yeni resected, deidentified hasta materyali yerleştirin. Numuneyi doğrudan transplantasyon için işleyin veya sıvı nitrojende numuneyi sıvı nitrojende (aşağıya bakınız) sıvı nitrojende depolamak ve daha sonra kullanmak için kriyoprezite saklayın.
2. Papain ayrıştırma çözeltilerini (papain çözeltisi, yıkama/proteaz inhibitör çözeltisi ve süreksiz gradyan çözeltisi) kit bileşenleri ve üretici tarafından sağlanan talimatlarla steril bir kaputta hazırlayın. Steril 15 ml polistiren konik tüpleri etiketleyin ve çözeltileri aşağıdaki gibi dağıtın:
   • Tüp 1: 5 ml papain çözeltisi
   • Tüp 2: 3 ml yıkama/proteaz inhibitörü çözeltisi
   • Tüpler 3-6: Her biri süreksiz degrade çözeltisinin her biri 5 ml
3. Glioma örneğini 5 ml papain çözeltisi ile tüp 1'e yerleştirin ve 10-20 dakikalık bir süre boyunca 5 ml pipetle tritüre edin.
4. Malzemeyi 10 kez yukarı ve aşağı pipetlayın ve bir sonraki olgunlaşma döngüsünü başlatmadan önce malzemeyi oda sıcaklığında 2-3 dakika kuluçkaya yatırın.
5. 5 ml pipet ucunu konik tüpün altına yakın bir şekilde, her tritürasyon döngüsüyle birlikte, ucun son 2 döngü boyunca tüpün dibine değecek şekilde konumlandırın.
6. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj. Süpernatantı çıkarın ve peletin 3 ml yıkama/ proteaz inhibitörü çözeltisinde 10x yukarı ve aşağı pipet.
7. "Yerçekimi" dağıtım hızında ayarlanmış bir pipettör ile 5 ml süreksiz gradyan çözeltilerinin (tüpler 3-6) her biri üzerine eşit miktarda süspansiyonu dikkatlice katmanlayın.
8. Tüpleri, hızlanma hızı en düşük ayara düşürülecek ve fren kapalı olacak şekilde sallanan kova rotorlu bir santrifüje yerleştirin. Oda sıcaklığında 12 dakika boyunca 76 x g'da santrifüj. Fren kapalıyken, santrifüjleme genellikle 20 dakika sonra tamamlanır.
9. Süpernatant çıkarın, yeniden biriktirin ve her peleti 5 ml steril dengeli tuz çözeltisinde birleştirin ve hücreleri buza yerleştirin.
10. Hücre süspansiyonunun bir kısmını (10-100 μl) çıkarın ve hemositometre ile trippan mavi dışlama ile canlı hücrelerin yoğunluğunu belirleyin.
11. 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj. Süpernatant çıkarın ve hücre peletini μl başına 25.000-125.000 canlı hücre yoğunluğunda yeniden biriktirin.
12. Hücre süspansiyonunun yeterli hacmini 200 μl mikrosantrifüj tüpüne (PCR tüpü) aktarın ve buza yerleştirin.

2. Cerrahi Bölge ve Aletlerin Hazırlanması

Not: İşlem sırasında steril cerrahi eldivenler giyilir. Her kurumun gereksinimlerine bağlı olarak cerrahi önlük, kapak ve yüz koruyucu gerekebilir.

1. Hayvan hazırlama, çalışma alanı ve hayvan kurtarma için ayrılmış bitişik alanlarla kemirgen cerrahisi için dezenfekte edilmiş bir tezgah hazırlayın.
2. Cerrahi aletleri buharlı otoklavda sterilize edin. Daha sonra, bir hayvandan diğerine geçerken aletleri flaş sterilize etmek için sıcak bir boncuk sterilizatörü kullanın.

3. İndüksiyon, Anestezi ve Analjezi

Not: Farelerin uyuşturulmasından itibaren 15 dakikayı aşan ameliyatlar bir temas ısı kaynağı gerektirir. Hipotermiyi önlemek için, farelere ameliyat öncesi ve sonrası dönemlerde bir ısı kaynağı (dolaşımdaki sıcak su battaniyesi) sağlanır.

1. Ketamin/ksilazine kokteylini indüksiyon anestezisi için hazırlayın, böylece her fare ketamin 100 mg / kg ve ksilazine 10 mg / kg, vücut ağırlığının gramı başına kokteylin 10 μl enjekte ederek.
2. Tablo 1. Anestezi kokteyli.

   	Stok konsantrasyonu	Hazırlanacak birim
   		bir fare	beş fare	on fare
   Ketamin	100 mg/ml	25 μl	125 μl	250 μl
   Xylazine	100 mg/ml	2,5 μl	12,5 μl	25 μl
   İsotonic salin		223 μl	1.113 μl	2.225 μl
   toplam		250 ul	1.250 μl	2.500 μl

3. Stok çözeltisini (10 mg/ ml) 1:20 steril, pilojen içermeyen suda seyrelterek analjezi için ketoprofen çözeltisi hazırlayın, böylece her fare, çözeltinin gram vücut ağırlığı başına 10 μl enjekte ederek 5 mg / kg'lık bir doz alır.
4. Presurgical ağırlığı tartın ve kaydedin. Bireysel fare ağırlıkları değişir, ancak genellikle 18-22 g arasında değişir.
5. Bir insülin şırınnası ile intraperitoneal alana fare vücut ağırlığının gramı başına 10 μl ketamin / ksilazin kokteyli enjekte edin. Örneğin, 20 g fare için 200 μl enjekte edin.
6. Farenin arka bacağın ayak parmağı çimdikle tamamen uyuşturulup uyuşturulmadığını belirleyin. Farenin artık kıstırıktan çekilmemeleri genellikle 3-5 dakika sürer.
7. Bir insülin şırınnası ile kanadın gevşek cildine gram fare vücut ağırlığı başına 10 μl ketoprofen çözeltisi enjekte edin. Örneğin, 20 g fare için 200 μl enjekte edin.
8. Saç kesme makası ile kafatasının üzerinde saç tıraşı yapın, açıkta kalan kafa derisini pamuk ucu aplikatörü kullanarak povidone-iyotla ovalayın ve ardından bir alkol pedini silin. Bu adımları tekrarlayın, povidone-iyot ovma ve alkol silme, iki kez daha.
9. Farenin gözlerine oftalmik merhem uygulayın.
10. Steril bir neşter bıçağı ile kulakların arkasından gözlerin hemen önüne uzanan 1 cm'lik bir orta çizgi kesiği yapın.
11. Fareyi bir diseksiyon dürbününün altına yerleştirin ve dikiş çizgilerini tanımlamak için kafatasını ortaya çıkarın. Matkapla dairesel hareketler kullanarak, bregma'ya 2,5 mm yanal ve koronal dikişe 1 mm posterior bir çapak deliği ortala.

4. intrakraniyal transplantasyon

Not: 2,5 μl'yi aşan enjeksiyon hacimleri fareler için ölümcül olabilir.

1. Üst kesici dişleri kesici diş çubuğunun üzerine bağlayarak ve burun kelepçesini uygulayarak fareyi stereotaktik bir çerçeveye yerleştirin, böylece kafatası nötr bir pozisyonda sıkıca tutulur.
2. Süspansiyonu karıştırmak ve kabarcıkları ortadan kaldırmak için stereotaktik manipülatörün prob tutucusuna kenetlenmiş 10 μl Hamilton şırıngasına birkaç kez bir mikrosantrifüj tüpündeki hücrelerin 5-10 μl'lik kısmını yukarı ve aşağı çekin. Şırınnanın 2 μl (bir hayvana enjekte etmek için yeterli hacim) ile yüklenmesi için pistonu bastırın.
3. Çapak deliğini açığa çıkarmak için cilt kesisinin yanal kenarını çekin ve mikromanipülatör ile iğneyi çapak deliğine sokun, böylece eğimli kısım kafatası yüzeyinin hemen altındadır.
   1. İğneyi 3 mm ilerletin ve enjeksiyon için bir alan oluşturmak için iğneyi 0,5 mm çekin.
   2. Pistonu yavaşça 30 sn'nin üzerinde ilerletin ve ardından iğnenin beyinde 2 dakika daha kalmasına izin verin. 0,5 mm yükselerek ve iğneyi beyinden çıkarmadan önce 30 saniye daha bekleyerek iğneyi yavaş yavaş çekin.
4. Fareyi stereotaktik çerçeveden çıkarın ve yarayı bir otoklapla kapatın.
5. Vücut sıcaklığını korumak ve mukoza zarlarının ve açıkta kalan dokuların (ayak tabanları) solunum düzenini ve rengini sürekli izlemek için fareyi bir ısıtma yastığına yerleştirin.
6. Fareyi anesteziden (sternal ve ambülatör) tamamen iyileştikten sonra steril bir mikroisolatör kafesine yerleştirin ve hayvan barınma tesisine geri verin.

5. İmplant sonrası Hayvan Bakımı ve Gözlemi

Not: Tümör engraftasyonunun ve infiltratif büyümenin en güvenilir göstergesi, kambur duruş ve pürüzlü saç önlüğü gelişimi eşliğinde kademeli, sürekli kilo kaybıdır. Nadir durumlarda, ataksi, parez ve nöbetleri içeren nörolojik eksiklikler not edilir. Ortotopik primer ksinograftlar oldukça invazivdir ve uzun bir süre boyunca gelişir. Fareler tipik olarak nakilden 3-6 ay sonra tümör büyümesi belirtileri gösterir.

1. Kesi yerinde yiyecek ve su alımı, davranış, tımar ve enfeksiyon belirtileri için her gün ortotopik ksinograftları olan fareleri gözlemleyin.
2. Ameliyat sonrası ağrı veya sıkıntı görülürse ketoprofen (deri altından 5 mg/ kg, günde 1-2x) verin.
3. Ameliyattan 8-10 gün sonra otoklapları çıkarın.
4. Fareleri haftalık olarak tartın.
5. Tümör engraftment belirti ve semptomlarını izleyin.

6. Tümör Hasadı

Not: Bu yöntemle, ilk koronal dilim (#1) koku ampullerinin arka yönünü ve frontal lobların ön yönünü içerir. Engrafted tümör en çok sonraki 3 koronal dilimin sağ yarımküresinde (dilim #2, #3 ve #4) bol miktarda bulunur ve enjeksiyon görüşü rutin olarak koronal dilim #3 bulunur. Deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak, malzeme tümör geçişi, donmuş doku bölümleri, formalin sabit parafin gömülü doku bölümleri, ayrışmış dokunun akış sitometrisi, hücre kültürü veya DNA, RNA veya protein analizi için lizatlar için kullanılabilir. Tümörün bazı bölümleri% 80-95 arasında değişen hücre canlılığı ile gelecekteki ihtiyaçlar için kriyopreziserved edilebilir.

1. Fareleri uzun süre karbondioksite maruz kalarak ötenazi ve ardından servikal çıkık.
2. Beynin tabanındaki ötenazili farelerin kafasını daha büyük bir çift cerrahi makasla (foramen magnum seviyesi) çıkarın ve kafatasını tamamen ortaya çıkarmak için deriyi kesiden ileri çekin.
3. Beyni çıkarın.
   1. Kafatasının sol tarafındaki oksipital kemiği kesmek için sol dış işitsel meatus seviyesine foramen magnum'un yanal yönüne bir çift ince cerrahi makas yerleştirin. Sağ tarafta aynı kesimi gerçekleştirin.
   2. Koronal düzlem boyunca oksipital kemiği bir dış işitsel meatustan diğerine kesin ve beyinciği ortaya çıkarmak için kemiği çıkarın.
   3. Burun kemik plakalarını gözlerin arasından kesin.
   4. Sagittal sütür boyunca burun kemik plakalarından bregmaya kadar arka arka kesim yaparak sagittal sütürünü kesin. Lambda'dan bregma'ya kadar ön kesim yaparak sagittal dikiş boyunca orta çizgi kesisini tamamlayın.
   5. Kafatasının beyne herhangi bir dural yapışıklıklarını yırtmak için her iki taraftaki sagittal açıklık boyunca ince bir çift tokanın ucunu dikkatlice yerleştirin ve ardından beyni ve koku ampullerini dorsally maruz bırakmak için iki kafatası yarısını yanal olarak soyun.
   6. Herhangi bir yapışıklık serbest için koku ampulleri ve kafatasının ventral yönü arasında tokaları kaydırın.
   7. Beynin geri çekilmesini sağlamak için kafatasını geriye doğru eğin, böylece optik ve diğer kraniyal sinirler açığa çıkar. Beyni steril PBS içeren bir tabağa salmak için kraniyal sinirleri koparın.
4. Tartım spatulası olan beyni matris dilimleyiciye aktarın ve jiletlerle 2 mm koronal dilimler oluşturun.
5. Koronal dilimleri daha fazla görsel inceleme ve daha fazla doku işleme için steril PBS içeren bir tabakta düzenleyin.

7. Tümör Kriyoprezervasyonu

1. Kriyoprezervasyon ortamının bir stok çözeltisi hazırlayın.
   1. 50 ml çoğalma takviyesi, 5 ml 100x penisilin ve streptomisin çözeltisi ve 450 ml bazal ortama% 0.2 heparin 450 μl ekleyin.
   2. Stok çözeltisi 4 °C'de ışıktan korunur.
2. Kriyoprezervasyon ortamının çalışma çözümünü hazırlayın.
   1. 47,5 ml kriyoprezervasyon ortamı ve 2,5 ml steril DMSO'yu 50 ml polipropilen konik tüpte birleştirin ve iyice karıştırın.
   2. Her bir cryovial için aliquot 1.0 ml çalışma çözeltisi ve ışıktan korunan 4 ° C'de saklayın.
3. Xenografted beynin bir 2 mm'lik koronal dilimini buz üzerinde kriyoprezervasyon ortamı içeren bir cryovial içine yerleştirin.
4. Şişeyi sıkıca kaplayın ve -80 °C'de bir dondurucu kaba yerleştirin. Ertesi gün cryovial'ı daha uzun depolama için sıvı bir azot tankına aktarın.

Sonuçlar

Dissosiyatif glioma hücreleri, primer ortotopik ksinograft çizgileri elde etmek için doğrudan bağışıklık sistemi baskılanmış farelerin beyinlerine nakledilir. Her tümör örneğine, korunan sağlık bilgilerini kaldırmak için deidentifikasyon sürecinin bir parçası olarak transplantasyondan önce randomize bir sayı atanır. Bu amaçla 5 haneli bir REDcap veritabanı numarası kullanıyoruz. Şekil 1' de, izosirat dehidrogenaz 1 (IDH1) mutasyon arginin 132'den histidin'e (R132H) sahip bi...

Tartışmalar

Kültürlü hücre hatları, ksinograftlar ve genetik olarak tasarlanmış fareler gliomaları modellemek için en yaygın yöntemlerdir ve her model sistemi için farklı faydalar ve sınırlamalar vardır^3,13,14. Primer ortotopik glioma ksinograftlarının ilgili faydaları arasında yaygın gliomaları tipleyen infiltratif büyüme ve genetik değişikliklerin tutulması ve kültürlü glioma hücrelerinde bakımı son derece zor olabilecek önemli sinyal mekanizmaları sayılabilir. Örneğin, iso...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	Life Technologies	14040-133
Papain dissociation system	Worthington Biochemical Corp.	LK003150
Trypan blue solution 0.4%	Life Technologies	15250061
Ketamine HCl	Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company
Xylazine HCl
Ketoprofen
Ophthalmic ointment
Povidone-iodine	Fisher Scientific	190061617
Cryopreservation medium and proliferation supplement	StemCell Technologies	05751
0.2% Heparin sodium salt in PBS	StemCell Technologies	07980
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D6250-5X10ML
NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice	The Jackson Laboratory	005557	NSG mice
Anti-human vimentin antibody	Dako	M7020	Use 1:200 to 1:800
Anti-human IDH1 R132H antibody	Dianova	DIA-H09	Use 1:100 to 1:400
Centrifuge with swinging bucket rotor
Pipetter with dispensing speed control
Disposable hemocytometer	Fisher Scientific	22-600-100
Sterile surgical gloves	Fisher Scientific	11-388128
Disposable gown	Fisher Scientific	18-567
Surgical mask	Fisher Scientific	19-120-1256
Tuberculin syringe	BD	305620
Alcohol pads	Fisher Scientific	22-246-073
Portable electronic scale	Fisher Scientific	01-919-33
Zoom stereomicroscope
Surgical clipper	Stoelting	51465
Scalpel handle	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel blades, #10
Stereotaxic instrument	Stoelting	51730
High-speed drill	Stoelting	51449
Drill bit, 0.6 mm	Stoelting	514552
Hamilton syringe	Hamilton	80336
Autoclip, 9 mm	BD	427630
Circulating water warming pad	Kent Scientific	TP-700 TP-1215EA
Hot bead dry sterilizer	Kent Scientific	INS300850
Surgical scissors	Fine Science Tools	14101-14
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11
Spring scissors	Fine Science Tools	15018-10
Dumont forceps	Fine Science Tools	11251-30
Semimicro spatulas	Fisher Scientific	14374
Mouse brain slicer matrix	Zivic Instruments	BSMAS002-1
Cryogenic storage vials	Fisher Scientific	12-567-501