Fototermal Işın Sapmasına tarafından Çözülmüş Proteinler Submillisecond Konformasyonel değişiklikler

Özet

Burada mikrosaniye ve milisaniyelik dinamikleri ve nöronal kalsiyum sensör, aşağı akış düzenleyici öğe Antagonist modülatörüne kalsiyum bağlanma kapasitesi ile bağlandığı yapısal değişikliklerin enerjileri izlemek için bir kafesli kalsiyum bileşiği, DM-nitrophen ile kombinasyon halinde fototermal ışın saptırma tekniğin bir uygulama rapor .

Özet

Birlikte fotoğraf-akustik kalorimetrisinden ve termal mazgal Fototermal ışın saptırma geleneksel Dur kullanarak erişilebilir değil zaman ölçekler milisaniye mikrosaniye proteinlerin yapısal değişimlere neden ışığın zaman profil hacim ve entalpi değişimleri izlemek fototermal yöntemleri ailesine ait -akış aletleri. Hacim ve / veya genel entalpi değişiklikleri sondalandı Ek olarak, bu teknikler, bir florofor ve bir kromofor veya etiket protein eksikliği ve diğer biomacromolecules uygulanabilir. Ca ² ile ilişkili yapısal değişikliklerin dinamikleri ve enerjikliğin izlemek için ⁺ kalsiyum dönüştürücüler gibi nöronal kalsiyum sensörler, kafesli bir kalsiyum bileşiği, DM-nitrophen, fotoğraf-tetik serbest kalsiyum hızlı bir (τ <20 mikro-saniye) artışı istihdam edilmektedir bağlanma konsantrasyon ve bununla bağlantılı ve entalpi değişiklikleri fototermal ışın saptırma tekniği kullanılarak sondalandı.

Giriş

Böyle foto akustik kalorimetrisine, fototermal ışın saptırma (PDB) ve nanosaniye lazer uyarma ile birlikte geçici mazgal gibi foto-termal yöntemler kısa ömürlü ara ^1,2 zaman çözüme çalışmaları için optik spectroscopiesle geçici güçlü bir alternatif temsil eder. Bu tür geçici emme ve IR spektroskopisi gibi optik teknikler, aksine, bu çevreleyen kromofor soğurma değişimlerin zaman profilini izlemek, fototermal teknikleri optik zaman profilleri araştırılması için değerli araçlar ısı / hacim değişikliklerini gösteren bir zaman-bağımlılığı tespit etmek ve bu nedenle "sessiz" süreçleri. Şimdiye kadar, foto akustik kalorimetri ve geçici ızgara başarılı globinlerine ^3,4, oksijen sensörü protein ile ligand etkileşimlerine atomlu ligand göçü de dahil olmak üzere foto-neden olduğu işlemlerin yapısal dinamiklerini incelemek için uygulanmış FixL ^{5, 6} oksidazlar elektron ve hem-bakır proton nakliye Birnd fotosistem II olarak rodopsin ⁷ ve ⁸ kriptokrom konformasyonel dinamiğinde verilmedi-izomerizasyon.

Bir iç kromofor ve / veya flüorofor eksik biyolojik sistemlere fototermal tekniklerinin kullanılmasını genişletmek için, PBD teknik olarak, foto-tetikleyiciye kafesli bileşiğinin kullanılması birkaç mikrosaniye olan ligand / alt-tabaka konsantrasyonunda bir artış ile ya da daha hızlı birleştirildi kafesli bileşik üzerinde. Bu yaklaşım sağlar ligand / substrat bir iç flüoroforu veya kromofora eksik olan proteinler ve ticari stop akış araçlar tarafından erişilebilir olmayan zaman-ölçeğinde bağlama ile ilişkili yapısal değişikliklerin dinamikleri ve enerjilerin izlenmesi. Burada kafes bileşiğin, Ca ^{2 +} termodinamik DM-nitrophen, foto-yarılma hem de nöronal kalsiyum sensörünün C-terminal alanına ^{Ca2 +} Birliği için kinetik aşağı izlemek için PBD bir uygulamadere Düzenleyici Eleman rakip Modülatör (DÜŞ) sunulmuştur. Ca ^{2 +} 10 mikro-saniye içinde foto-serbest Ca ^{2 +} DM-nitrophen ve ~ 300 mikro saniye bir zaman sabiti ile bir unphotolysed kafesine rebinds. Diğer taraftan, apoDREAM mevcudiyetinde milisaniye ölçekte oluşan ek bir kinetik gözlenen ve proteine ​​bağlanma ligandı yansıtmaktadır. Biyolojik sistemlerde konformasyonel geçişler araştırmak üzere PBD uygulama bir şekilde etkili zorluklar nedeniyle sınırlıdır; güçlü ve yeniden üretilebilir bir PBD sinyal elde etmek için prob ve pompa ışınının, örneğin zorlu bir hizalama. Ancak, alet set-up titiz bir tasarım, sıcaklığın bir hassas kontrolü, ve prob ve pompa ışın dikkatli bir hizalama geniş bir zaman içinde çözünen hacmi ve entalpi değişiklikleri izlenmesine olanak sağlar tutarlı ve sağlam PBD sinyalini sağlamak 10 mikro saniye olduğu yaklaşık 200 msn den zaman ölçeği. Buna ek olarak, modific Invb aynı sıcaklık, tampon bileşimi, optik hücre yönelim, lazer gücü altında örnek ve referans izleri tespit sağlamak için deneysel işlemin ations anlamlı ölçülen reaksiyon hacimleri ve entalpilerinin yılında deneysel hatayı azaltır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1.. Örnek Hazırlık

1. Numune hazırlama ve istenmeyen uncaging önlemek için karanlık bir odada bütün numune manipülasyonlar yürütmek.
2. 50 mM HEPES içinde N, N, N ', N'-tetrakis [(oksi-karbonil) metil] -1,2-etandiamin) - (2-nitro-4 ,5-dimetoksi-fenil) - DM-nitrophen ((1 çözünürleştirilir tampon, 100 mM KCI, 400 uM'lik nihai konsantrasyona kadar pH 7.0 _(350m ε = 4330 ^{M-1cm-1 9).}
3. [DM-nitrophen]: ^{[Ca2 +]} arzu edilen bir oran elde etmek için 0.1 M stok çözeltiden CaCl ₂ ekleyin. 10 uM 'den büyük Ca ^{2 +} ilişkisi için _Kd ile proteinleri için, ^{[Ca2 +]} oranı: 1:1 [DM-nitrophen] Uncaged DM-nitrophen fotoğraf-serbest ^{Ca2 +} bağlanmasını önlemek için tercih edilir, . Gerçekten de, bir kalsiyum bağlayıcı proteinin% 90 ~ 10 nM ve 400 mM olmak DM-nitrophen ve ^{Ca2 +} toplam konsantrasyonu olduğu DM-nitrophen için _Kd değeri dikkate alınarakK _d = 10 uM apoform olacaktır. Öte yandan, _Kd <10 uM olan proteinlere bağlanarak Ca ^{2 +} çalışması için, ^{bu, [Ca2 +]} azaltmak için tercih edilir: ^{Ca2 +} kompleksleşmesini önlemek için 0.95 [DM-nitrophen] oranını apo- protein kafes fotoğraf ayrışma önce.
4. Referans bileşiği, K ₃ çözünürleştirilir [Fe (III) (CN) _6], ya da numune ile aynı tampon maddesi içinde Na ₂ CrO _4,.

2. Deney ayarlama

1. Temel deneysel konfigürasyon Şekil 2'de gösterilmiştir.
2. 1 mm prob kirişin çapı (He-Ne lazerinin 632 nm çıkışı, ~ 5 mW lazer gücü) ayarlamak ve bir sıcaklığa yerleştirilmiş bir hücrenin merkezi aracılığıyla prob demeti yaymak için bir pim deliği (P ₂₎ kullanarak Bir M ₁ ayna kullanarak hücre tutucu kontrollü.
3. Sonda kiriş ortalamak için örnek arkasına bir ayna ₍₂ M) kullanarakpozisyon duyarlı dedektör merkezi üzerinde.
4. En iyi iki diyotlar ve alt iki diyot gibi, dedektörün sağ ve sol tarafında, iki diyot arasındaki voltaj farkı arasındaki gerilim farkıdır ki bu şekilde detektör ortasına sonda kiriş Odak sıfır.
5. YAG lazer FWHM 5 nsn) ile nano iki 355 nm lazer ayna arasına yerleştirilmiş bir 3 mm iğne deliği (P ₁₎ kullanılarak: Daha sonra, pompa demetinin çapı, Q-anahtarlı Nd bir 355 nm çıkış şekli.
6. Şekil 2'de gösterildiği gibi küvet merkezinden pompa ışını Copropagate. Her iki lazer ışınları, ölçülebilir bir sapma açısı ve PBD sinyalin böylece yüksek amplitüdü elde etmek için, yaklaşık eş doğrusal bir şekilde optik hücrenin merkezine doğru yayılır önemlidir. Deneysel koşullar altında, prob ve pompa kiriş kesişme açısı en az 15 ° 'dir.
7. Prob ve pompayı hizalamak için bir referans bileşik kullanınuzun zaman ölçeklerinde (~ 100 msn) üzerinde iyi bir S / N oranı ve istikrarlı PBD genlik, yani tatmin edici bir PBD sinyal elde etmek için ışın.
8. 355 nm lazer aynası artımlı ayarlanması ile prob huzmesine nisbetle pompa kirişin konumunu ayarlayın.
9. Pozisyon hassas detektörü, iki üst ve alt fotodiyotlar arasında bir fark olarak PBD referans sinyalinin genliğini ölçün. PBD sinyali hızlı bir zaman ölçekli (<10 mikro-saniye) üzerinde genlik hızlı bir artış gösterir ve Şekil 3 'de gösterildiği gibi, 100 milisaniye ölçeğinde stabil kalmalıdır. PDB genlik vurdu değişkenliği atış sinyal genliğinin% 5 içinde ve sinyal uyarlık esas titreşimlerden etkilenir.
10. Emilen uyarım lazer gücü ve Einsteins sayısına PBD sinyalinin doğrusal bağımlılığı, E _a ölçerek çıkan ısı enerjisi ile ilgili olarak PBD sinyal amplitüdünün doğrusallığını kontrol= A uyarım dalga boyunda, referans absorbans karşılık gelen ^(1-10-A).
11. Lazer gücü altında, yaklaşık 1000 μJ ve multiphoton emme ve sırasıyla pompa ışını güç azalmayı önlemek için uyarım dalga boyu en az 0.5 'de örnek / referans bileşiği absorbans tutun ve PBD sinyalinin doğrusallığını sağlar.

3. PBD Ölçümler

1. Referans için PBD izlerin ölçümü ile başlayın. Bir 1.0 cm x 1.0 cm ve 1.0 cm x 0.5 cm kuvars hücrede referans bileşiği çözeltisi yerleştirin ve ısı kontrollü tutucu hücreyi yerleştirin. Her iki yol uzunlukları karşılaştırılabilir PBD genlik sağlar.
2. 3 ° C sıcaklık artışı ile 16-35 ° C sıcaklık aralığı içinde, sıcaklığın bir fonksiyonu olarak referans PBD sinyalini algılar
3. Her sıcaklık değişimi üzerine, pozisyon duyarlı dedektör prob ışınının pozisyonunu kontrol edin ve yenidenGerekirse, dedektörün merkezine konumunu ayarlamak.
4. Denklem 2'ye göre bir fonksiyonu olarak [(dn / dt) / C _p ρ] terimi PBD sinyalinin doğrusallığını kontrol edin.
5. Referans ölçümü için optik hücrenin aynı yönde tutmak referans bileşiği için olan ile aynı optik hücre içindeki örnek çözeltisi yerleştirin.
6. Referans için aynı sıcaklık aralığında, örnek PBD izleri tespit eder ve [(dn / dt) / C _p ρ] terimi ile ilgili olarak örnek PBD genlik doğrusallığını kontrol edin.

4. Veri Analizi

Sapmanın büyüklüğü nedeniyle Denklem 1'e göre numune ısıtma (ΔV _inci) ve ısısal olmayan hacim değişikliği (ΔV _nonth) için hacim değişikliği ile doğrudan orantılıdır:

Numunenin (A _S genliği) Ve referans (A _r) PBD sinyal sırasıyla Denklemler 2 ve 3 kullanılarak tarif edilebilir.

PBD sinyali gösterge yanıt parametre (K) ile doğrudan orantılıdır ve Einsteins sayısının emilen (E _a). Denklem 2'de ilk terim, (dn / dt) (1/ρC _p) Q, bağlı çözücü bırakılan ısı, sinyal değişiklik karşılık gelir. Dn / dt vadeli kırılma endeksinin sıcaklığa bağlı değişimi temsil, ρ çözücü yoğunluğu, C _p ısı kapasitesi. Tüm parametreler, damıtılmış su ile tanınırlar ve damıtılmış su içinde ve uygun bir tamponda, referans bileşik için bir PBD sinyalinin karşılaştırılması ile bir tampon çözeltisi için belirlenebilir. Q ısı returne miktarıdırçözücüye d. Ρ (dn / d ρ) terimi, 10-40 ° C'de ¹⁰ arasındaki sıcaklık aralığında, sıcaklık-bağımsız olan bir birim daha sabittir. Δn _abs terimi nedeniyle çözeltide emici türlerin varlığı kırılma indeksi değişimine karşılık gelen ve sonda ışınının dalga boyu çözelti içinde herhangi bir türün absorpsiyon spektrumları göre kaydırılır eğer bulunuyor ihmal edilebilir. Referans bileşik (A _r) kaynaklanan sinyal E _{h ν,} uyarma dalga boyunda foton enerjisi Denklem 3 ile ifade edilir E _{h ν} = 80.5 kcal / mol 355 nm uyarma için.

1. Şekil 3'te gösterildiği gibi Ön tetikleme ve sonrası PBD tetikleme sinyali arasındaki fark olarak referans PBD sinyalinin genliğini al. Benzer bir şekilde, hızlı (A _s ^hızlı) genliğini belirlemek ve yavaş faz (A _s ^yavaş) Numune PBD sinyalinin.
2. , Alet tepki parametresi K ortadan referans için PBD sinyalinin genliği ile numune PBD sinyalinin genliğini ölçeklemek için. Referans sinyalin numune sinyalinin oranı Denklem 4 verir ve benzeri gibi yazılabilir:
   
   
3. Bu denklemi kullanılarak, çözeltinin (Q) ve termal olmayan bir hacim değişikliği [bir arsa sırasıyla eğim ve kesişim noktası, bir foto-başlatılan reaksiyon ile bağlantılı (ΔV _nonth) (A _s / A _r) E bırakılan ısıyı tespit _{h ν]} sıcaklık bağımlı vadeli [(dn / dt) (1/ρCp)] karşı terim.
4. , Reaksiyon hacmi ve hızlı ve yavaş bir süreç için entalpi değişimlerini belirlemek Denklem 5-7 göre uygun kuantum verimi gözlenen hacim ve entalpi değişimi büyütmek için.
   
   
   
   
   
   
   Kinetik 10 mikro saniye olduğu ~ 200 milisaniye arasındaki bir zaman ölçeğinde meydana gelen bir çok aşamalı bir işlem için, hacmi ve reaksiyonun tek tek adımlarla bağlantılı entalpi değişiklikleri tespit edilebilir. Tek tek aşamalar için yayılmalar ve yaşam süreleri hacmi ve entalpi değişiklikleri zaman profilini açıklayan fonksiyon f (t) için veri uyması yolu ile analiz edilir.
   
   α ₀ A ^{_s, hızlı} karşılık gelir _ve bir _s ^yavaş her bir işlem için karşılık gelen ve α τ burada _i bireysel reaksiyon adımlarının ömrü vardır. Fo oranı sabitinin sıcaklık bağımlılığındanr süreçleri tek tek aktivasyon entalpi ve entropi parametreler kolaylıkla Eyring araziler kullanılarak belirlenebilir _{(i i} = 1 / τ k).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

PBD temsili bir örneği, Ca ^{2 +} DM-nitrophen Ca ^{2 +} verilmedi-serbest bırakılması için izleri, Şekil 3 'de gösterilmiştir. Yavaş faz Ca ^{2 +} nonphotolysed kafese bağlanmasını gösterir ise, hızlı faz, Ca ^{2 +} DM-nitrophen ve Ca ^{2 +} kurtuluş foto-bölünmeye karşı gelmektedir. Sıcaklık bağlı faktör [C _p ρ / (dn / dt)] bir fonksiyonu olarak referans bileşiğinin genliğine ölçekli hızlı ve yavaş bir faz için ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Fototermal yöntemleri geride fiziksel prensibi bir fotoğraf heyecanlı molekülü çevreleyen çözücü ^1,12 termal ısıtma sonuçlanan, zemin durumuna titreşim rahatlama yoluyla fazla enerjiyi dağıtacağını olmasıdır. Örneğin su gibi çözücü maddeler, bu hızlı bir hacim genişlemesi (ΔV _th) üretir. Uyarılmış hal moleküller de bağlı bağı kırma / formasyonu ve / veya molekül (ler) i (van der yani değişiklikler moleküler boyutları değiştirebilir molekül y...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid	Life Technologies	D-6814	DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid)	Sigma Adrich	0909C	HEPES buffer
Potassium ferricyanide (III)	Sigma Aldrich	702587	reference compound for PBD measurements
Sodium chromate	Sigma Aldrich	307831	reference compound for PBD measurements
He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm	Edmund Optics	54-179	use as a probe beam for PBD measurements
Oscilloscope,	LeCroy	Wave Surfer 42Xs	400 MHz bandwith
Nd:YAG laser	Continuum	ML II	pump beam for PBD measurements
M355; Nd:YAG laser mirror	Edmund Optics	47-324	laser mirror for 355 nm laser line
M1 and M2; Laser diode mirror	Edmund Optics	43-532	visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm
P1 and P2; Iris Diaphragm	Edmund Optics	62-649	pin hole to shape the probe and pum beams
L1; bi-convex lens	Thorlabs	LB1844	a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350-2,000 nm
DM, dichroic mirror	Thorlabs	DMLP505	a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm
F1; Edge filter	Andower	500FH90-25	a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm
Temperature-controlled cuvette holder	Quantum Northwest	FLASH 300