Çekal ligasyon ve Farelerde Autophagy incelemek için bir model olarak Sepsis Patamaya kaynaklı

Özet

Deneysel sepsis çekal ligasyon ve delme (CLP) yöntemini kullanarak farelerde neden olabilir. CLP kaynaklı sepsis bağlamında in vivo Otofaji değerlendirmek için mevcut protokoller burada sunulmuştur: (GFP)-LC3 fareler kullanılarak Otofaji ölçülmesi için bir protokol ve elektron mikroskobu ile autophagosome oluşumunu ölçmek için bir protokolü.

Özet

Deneysel sepsis çekal ligasyon ve delme polimikrobiyaldir sepsis neden olur (CLP) yöntemini kullanarak farelerde neden olabilir. Burada, bir protokol CLP tekniği kullanılarak farelerde değişen şiddetinin sepsis uyarılması için sağlanmaktadır. Autophagy stres ve patojen istilası için temel bir doku tepkisi olduğu. Deneysel sepsis bağlamında in vivo değerlendirmek için iki Otofaji mevcut protokoller de burada sunulmaktadır. (I), yeşil flüoresan protein (GFP)-LC3 füzyon proteini ifade eden transjenik farenin CLP tabi tutulur. GFP sinyali (puncta) lokalize geliştirme, imünohistokimyasal veya konfokal tahlilleri yoluyla analiz edilmiş olarak, gelişmiş autophagosome oluşumunu algılamak ve, otofaji yolu bu nedenle, değiştirilmiş aktivasyon için kullanılabilir. (Autophagy stimülasyon bir göstergesi olarak) birim doku alanı başına (II) Geliştirilmiş otofajik küçük boşluk (autophagosome) formasyonu elektron mikroskobu kullanılarak belirlenebilir. Sepsise otofajik yanıtların çalışma kritik bir compdokular enfeksiyona yanıt hangi mekanizmaları anlamada onent. Bu alandaki araştırma bulguları sonuçta kritik bakım tıpta önemli bir problem teşkil etmektedir sepsis patogenezi, anlamaya yönelik katkıda bulunabilir.

Giriş

Sepsis, enfeksiyona sistemik inflamatuvar yanıt, eleştirmenlerce hastalarda ¹ ölüm önde gelen nedeni temsil eder. Genellikle polimikrobiyaldir sepsise yol açan karın içi enfeksiyonlar,% 60 kadar ² önemli mortaliteye sahip olan, sepsis vakalarının% 20 için hesap. Sepsis-ilişkili mortalite öncelikle sonraki organ yetmezliği ^3,4 ile çoklu organ disfonksiyonu kaynaklanır. Bu hastalığın patojenik mekanizması içine ek araştırma acil, yeni ve daha etkili tedavilerin gelişmesini teşvik etmek gereklidir.

Çekal ligasyon ve delme (CLP) yöntemi in vivo modelleme sepsis için yaygın olarak kullanılan bir işlemdir. Sonuçta çekum bakteri dolu olarak, polimikrobial peritonit onun ponksiyon sonuçları, kan (bakteriyemi) içine bakteri translokasyonu, septik şok, çoklu organ yetmezliği ve ölüm ^5. Genellikle CLP klinik yansıttığı kabul edilmektedirdaha doğru gibi kemirgenler içine endotoksin ya da saflaştırılmış bakterilerin enjeksiyonu gibi daha önceki tekniklere göre daha gerçeklik Böylece, CLP sepsis patogenezinde soruşturma dolayısıyla, deneysel indüksiyon için ⁶ (değil sınırlamalar olmadan da olsa) altın standart kabul edilir ve. Bu monografi, biz sepsis patojenik mekanizmaları Otofaji dahil olup olmadığını değerlendirmek için tasarlanmış protokolleri açıklar.

Autophagy, evrimsel olarak muhafaza edilmiş hücre işlem olup, hasar görmüş proteinlerin ve mitokondri gibi organel ciro kolaylaştırır ve bakteriler de dahil olmak üzere hücre içi ^7,8 patojenlerin temizlenmesinde önemli bir rol oynar. Otofaji sırasında sitosolik proteinler organeller ya da sonradan bozulması ⁹ lizozomlara teslim edilir autophagosomes olarak adlandırılan iki membran-sınırlayıcı kabarcıklar içine tecrit edilir. Bir dizi protein autophagy-ilişkili genlerin memeli homologları (ATG) olarak tespit edilmiştir,ilk Otofaji süreci düzenleyen maya içinde tespit edilmiştir. LC3B-I (serbest form) için mikrotübül-ilişkili protein 1 hafif zincir 3B (LC3B) (Atg8 of homologu) dönüşümü (fosfatidiletanolamin-konjuge form)-II LC3B için autophagosome oluşumu ⁹ önemli bir adımı temsil eder. Otofajik fonksiyon bozukluğu, yaşlanma ve kanser ve nörodejeneratif bozukluklar ¹⁰ de dahil olmak üzere, insan hastalıkları ile ilişkilidir. Ayrıca, otofaji bağışıklık hücreleri ⁸ antijen sunumu, lenfosit geliştirme ve sitokin sekresyonu gibi doğal ve adaptif bağışıklık etkiler. Böylece, otofaji da enfeksiyona sistemik inflamatuvar yanıt (yani sepsis) bir rol oynayabileceğini söyledi makul görünüyor.

Bugüne kadar çeşitli yöntemler in vivo doku hasarında Otofaji rolünü değerlendirmek için tarif edilmiştir. Bu yeşil floresan protein (GFP)-ifade LC3 farelerin kullanımı ve oto miktarının dahilelektron mikroskobu ile dokuda phagosomes (bu iki yöntem bu monografi açıklanmıştır). Ilave yöntemler doku homojenatlarında otofajik protein ifadesinin miktarının, ve (başka bir yerde tarif edildiği gibi) otofajik akı analizi ^11-13 içerir. Bu incelemenin amacı, deneysel sepsis bağlamında in vivo değerlendirilmesi için mevcut Otofaji protokolleri sağlamaktır.

Protokol

Not: Brigham ve Kadın Hastanesi / Harvard Tıp Fakültesi Bölgesinde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu aşağıdaki prosedürleri onayladı.

1.. Çekal ligasyon ve Delinme

Aynı arka plan fareler kullanın (C57BI / 6), 8-10 haftalık erkek. Erkek fareler sepsis tarafından başlatılan ölümlerden karşı erkeklere göre daha dayanıklıdır. 8 haftadan daha eski Fareler ÇLD'den sağkalım açısından genç farelerde daha az değişken sonuçlar üretir. Yaklaşık N karşılaştırıldığında, grup başına 10 fare hayatta kalma analizleri için kullanılmalıdır =. N = 3-5 farenin autophagy deneyleri için yeterlidir.

1. Kemirgen cerrahi için uygun olmalıdır steril küçük cerrahi aletler (yani neşter, makas ve künt anatomik forseps) kullanın.
2. Anestezi karışım hazırlayın: PBS içinde 7.95 ml'lik Xylazine (AnaSed enjeksiyonu 100 mg / ml) 150 ul ve Ketamine (Ketaset 700 ul ekle   CIII, 100 mg / ml).
3. İşlem sırasında aseptik koşulların sağlanması için, eldiven, yüz maskesi ve cerrahi önlük giyerler.
4. Hayvanlar tartılır. Intraperitoneal yolla enjekte bunları anestezi (ip) ul (10x g vücut ağırlığı) arasında bir dozda uygulanması için adım 3'te söz konusu karışım,. Örneğin, 22 g ağırlığında bir fare için, anestezi karışımın 10x22 = 220 ul yönetmek. Bu nedenle, Xylazine ve Ketamin nihai doz 17 ve 80 mg / kg vücut ağırlığı, sırasıyla. Bu anestezi yeterli olduğundan emin; ekstremite hiçbir fleksiyon ayak tutam sonra üretilen gerektiğini unutmayın:. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri oftalmik merhem kullanın.
5. Sırtlarında temiz bir çalışma yüzeyi üzerine hayvanları yerleştirin. Kuyruklar ve arka pençeleri araştırmacının yöneliktir. . Alkol (% 70 EtOH çözelti) Not kullanılarak karın cildi dezenfekte: Cerrahi alan tamamen temas yoluyla yaranın kirlenmesini önlemek için, traş edilmelidirkürk. Ayrıca, en iyi şekilde, bir sıcak su sirkülasyon ped ameliyat sırasında, anestezi uygulanmış farelerde normotermi korumak için kullanılmalıdır.
6. Bir neşter kullanılarak, küçük bir cilt kesisi boyuna paralel yapmak ve yaklaşık 1 cm orta hat bıraktı. Periton boşluğu içine henüz nüfuz etme. Ilk kesi uzatmak için küçük bir makas kullanın.
7. Karın kasları tanımlamak ve periton boşluğuna erişmek için bunları incelemek.
8. Künt anatomik forseps kullanarak, çekum belirlemek ve periton boşluğuna dışına taşıyın. (Bu öldürücü kanamaya yol açabilir) mesenteryal kan damarlarına zarar vermemek için dikkatli olun.
9. Bir orta dereceli sepsis ulaşmak için çekum% 60 Arter. Eşit veya düşük dereceli sepsiste çekum sonuç az% 25 bağlanması ise eşit veya çekum fazla% 75 bağlanması genel olarak, yüksek dereceli sepsis ile sonuçlanır. Ileoçekal valf (bu bağırsak devamlılığını engellemek olabilir) bağlanması için değil dikkatli olun.
10. A kullanarak21 G iğne, ligasyon yakın bir ile-ve-through delinme (iki delik) tarafından çekum perfore. Perforasyon yönü mezenterik gelen çekum anti-mezenterik tarafında olmalıdır. Mesenteryal kan damarlarını delmek için dikkatli olun.
11. İğneyi çıkarın. Yavaşça iki deliklerden açıklığını onaylamak için lige çekum sıkmak; dışkıların sadece küçük bir miktar bunların ekstrüde olmalıdır.
12. Periton boşluğu içine bağlanmış olan ve delinir çekum hareket ettirin.
    Not: sahte fareler için, adımları 1,10-1,12 atlayın.
13. Karın kaslarını kapatmak için kesici iğne ile ipek cerrahi dikişlerle 6-0 kullanın. Karın cilt kapatmak için kesici iğne ile ipek cerrahi dikişlerle 6-0 kullanın.
14. Isı ve işlem sırasında kaybolan hidrasyon yerine önceden ısıtılmış 1 ml (37 ° C) serum fizyolojik ip enjekte edilir. Onların resüsitasyon kadar bir ısı lambası altında fareler yerleştirin Not:. Optimal, daha güvenli bir ısınma cihazı (sudolaşımlı bir sıcak su pedi) ve ch yerine bir ısı lambası kullanılabilir.
15. Postoperatif analjezi elde etmek için (. 0.05 mg / kg vücut ağırlığı sc) Buprenorphin enjekte Not:. O sternum yatma korumak için yeterli bilince kavuşana kadar bir hayvan sahipsiz bırakılmamalıdır. Bir cerrahi tedavi geçirmiş bir hayvan tamamen iyileşti kadar diğer hayvanların şirkete iade edilmemelidir.
16. Yiyecek ve su sınırsız erişim ile tekrar kafeslerine hayvanlar koyun. Onlar (örneğin dokunduğunda hareket başarısızlık veya siyanoz gibi klinik belirtiler ile gösterilir) can çekişmekte zaman fareler ötenazi olacaktır. Onları önce ötanazi ölmek zorunda kalmamak için, farelere her 4 saat edin.

2. Doku Hasat ve Fiksasyon

1. % 4 paraformaldehid (PFA) çözeltisi hazırlayın: 889 ml için PBS% 37 PFA 111 ml ekleyin.
2. CO _2-kaynaklı narkoz veya Ketamin / Xylazine s kullanarak fareler Kurbanyüksek dozda olution.
3. Temiz bir çalışma yüzeyi üzerine fareler hareketsiz. Bunu dezenfekte etmek için% 70 EtOH solüsyonu ile karın ve torasik cilt püskürtün.
4. Karın ve göğüs cilt yanı sıra trakeal alanı kapsayan cilt kaldırmak için bir neşter ve küçük bir makas kullanın.
5. Çevresindeki dokular (kas ve bağ dokusu) kaldırarak trakea ortaya koymaktadır.
6. Trakea etrafında (kesici iğne olmadan) bir dikiş yerleştirin. Henüz sıkmayın.
7. 'Entübe' trakea küçük bir periferik venöz kateter (20 G) kullanın. Trakeal gözyaşı önlemek için kateter yerleştirilmesi sırasında dikkatli olun. Trakea en büyük çapı sadece Krikoid kıkırdak altında olduğuna dikkat edin.
8. Trakea / kateter etrafında dikiş sıkın. Trakea içine kateterin sadece plastik kanül bırakarak iğne çıkarın. İğne plastik kanül yerleştirilmesi için bir kılavuz teli olarak sadece görev yaptı.
9. Trakea içine plastik kanül tespit ettikten sonra, Şe abdominal kas, karın açmak ve diyaframı ortaya.
10. Bir iğne kullanarak, pnömotoraks (plevra boşluğuna havanın yani ekleme) üretmek için diyaframı delinme. Akciğerler sonra çökmüş olmalıdır.
11. Küçük bir makas kullanarak, sternum (sternotomi) boyunca kesilir diyafram, kaldırmak, göğüs kafesini çıkarmak ve kalp ve akciğerler ortaya.
12. Trakea içine yerleştirilen plastik kanül aracılığıyla, 30 cm _H2O basınç altında formaldehid çözeltisi ile akciğerlere sabitleyin.
13. Akciğerleri çıkarın ve 24 saat ve daha sonra% 70 EtOH çözüm için% 4 PFA içine yerleştirin işleme kadar.
14. Kalp, karaciğer ve böbrekleri belirlemek ve kaldırmak. Aynı şekilde, işlenene kadar% 70 EtOH solüsyonu, daha sonra, 24 saat için% 4 PFA içine yerleştirin ve.

3. GFP Fareler ve GFP Slaytlar görüntüleniyor

1. Adım 1 ve postoperatif prosedürde açıklandığı gibi GFP-LC3 fareler üzerinde CLP ve sahte ameliyatıs protokol aşama 2'de tarif edildiği gibi.
2. Parafin içinde dokular (yani akciğerler, kalp, karaciğer ve böbrekler) gömmek ve seri 5 mikron bölümlerde onları kesti.
3. Parafin erir ve doku yarı saydam görünür kadar, 30-60 dakika boyunca 60 ° C'de inkübe zaman GFP boyanması için hazır.
4. Ksilen veya ksilen yerine, 5 dakika ksilen 1, ksilen, 2, 3 ve ksilen standart kademeli dizi Deparaffinize sonra kademeli EtOH içinde seri 3 dakika bekletme: sonra% 100,% 95,% 75, ve distile su ile yıkayın.
   Not: Parafinden arındırma lamların örnek background artar doku kuruma, kaçının sonra.
5. 10-20 dakika boyunca mikrodalga ile, sitrik asit tamponu (10 mM sodyum sitrat asit,% 0.05 Tween 20, pH 6.0) kullanılarak antijen alma yapın. Doku kuruma önlemek için periyodik tampon değiştirmek için dikkatli olun.
6. Çözüm antijen alımı tamamlamak için bankta 20 dakika soğumasını bekleyin.
7. PBS ile 2-3 kez yıkayın. Aşırı tamponu ve tra kaldırnsfer slayt kutusu ya da kuruma önlemek için başka bir nemlendirilmiş bir odada yatay konuma raftan kayar.
8. % 10 normal eşek serumu (ayrıca% 5 sığır serumu albümini ya da ikincil antikor elde edildiği hayvan, tercihen serum) PBS içinde, oda sıcaklığında 45-60 dakika bloke eder.
9. Nemlendirilmiş bir odada 4 ° C'de gece boyunca PBS içerisinde 1:100 seyreltide GFP primer antikor içinde inkübe edin. Hafifçe doku ile temas homojen teşvik etmek ve buharlaşmayı önlemek için bir antikor ile doku üzerinde Parafilm küçük parçalar halinde uygulanır.
   Not: Geri kalan aşamalar oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
10. Primer antikor fazlasını uzaklaştırmak için PBS ile 5x yıkayın. Oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca PBS içinde sekonder antikor 1:500-1:1,000 kuluçkalayın.
11. Fazla ikinci antikorları ayıklamak için PBS ile 5x yıkayın. Eğer istenirse, bu aşamada slaytlar counterstain.
12. Floresan ikincil antikor kullanılarak ise% 70 EtOH f içinde% 0.1 Sudan Siyah inkübeya da 15-20 dk otoflüoresanı azaltmak için. Doku etrafında aşırı Sudan Siyah silin ve 20 dakika boyunca PBS ile 5x yıkayın.
13. Lamel ile örnek ve montaj çözüm seti kadar, yatay depolar.

4. Alternatif Protokol: GFP-LC3 doğrudan algılama

1. 50/50 v / v Ekim PBS bir ~ 500 ml cannulate ve şişirmek akciğerler.
2. Bir cryomold dibinde Ekim küçük bir miktar koyarak Ekim gömün.
3. Dikkatlice kalıpta kesilmiş akciğer kompleksi yerleştirin.
4. Metilbutane kuru buz kullanılarak soğutulmuş yavaş yavaş dondurma.
5. Doku tamamen kapalı ve katı donmuş kadar daha Ekim ekleyin. -80 ° C'de kuru buz ve mağaza devam
6. Bir cryomicrotome kullanarak, ışıktan bölümlerinin korunması 5-10 mikron kalınlığında kesitler kesti. Mağaza bölümleri ve -80 ° C'de kalan doku
7. , Görüntüleme için slaytları dondurucu kısmını çıkarın ve hemen kurumasını önlemek için PBS bir damla uygulamak için.
8. % 4 PFA ile 30 dakika için düzelt. PBS ile yıkayın.
9. 10 dakika için DAPI / Hoescht uygulanır. 3 kez PBS ile yıkayın.
10. Lamel ile örnek ve montaj çözüm seti kadar, yatay depolar.
11. Epifloresans veya konfokal mikroskop kullanılarak görüntü. Kadar bir ay boyunca 4 ° C'de saklayın örnekleri.

5. Elektron Mikroskopi Doku hazırlanması

1. Sabitlemek için yaklaşık olarak 1 mm küpler halinde dokuları kesin.
2. 0.1 M sodyum kakodilat tamponu, pH 7.4 içinde% 2 formaldehid,% 2.5 glutaraldehid içinde doku düzeltildi.
3. 1-2 saat süre ile 0.1 M sodyum kakodilat tamponu ile yıkayın.
   Not: Sabit doku, 4 ° C'de 0.1 M sodyum kakodilat içinde saklanabilir
4. 1 saat süre ile 0.2 M sodyum kakodilat tampon içinde% 1 ozmiyum tetroksit içinde düzeltmeyi Gönderin.
5. 10 dakika boyunca 3 x 0.2 M sodyum kakodilat tampon maddesi içinde durulayın.
6. % 70 EtOH, 20 dakika 2x kurutmak. % 90 EtOH, 10 dakika 2x kurutmak. % 100 EtOH içinde kurutmak,20 dakika 2x.
7. 10 dakika için 2X propilen oksit (epoksi propan) ile inkübe edin.
8. 1 saat süre ile propilen oksit / epoksi reçine karışımı (50:50) ile inkübe edin. Epoksi reçine karışımı: 24 g Agar 100 reçinesi, 13 g, dodesenilsüksinik anhidrit, 13 g metilnadik anhidrit ve 1 ml N-benzil dimetilamin. Ahşap bir spatula kullanılarak atılabilir bir beher içinde iyice karıştırın.
9. Kapağını açıp şişelere Epoksi reçine gece boyunca (bu, geri kalan herhangi bir propilen oksit buharlaşmasına izin verir) ile inkübe edin.
10. Taze hazırlanmış reçine ile etiketlenmiş kapsül gömme. 48 saat boyunca 60 ° C'de polimerize olurlar.
11. Elektron mikroskobu film üzerine 80 ya da 60 kV, bir transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak Fotoğraf doku kesitleri. Fotoğrafik kağıda görüntüleri yazdırmak ya da dijital medya saklamak.
12. Çekirdeğini içeren sağlam hücrelerde autophagosome oluşumu analiz edin. Düşük enerji alanları (e. G. 2000-4000 X) çekirdekli hücreleri belirlemek için kullanılabilir. Tipik 6,800-10,000 X görüntüleri th için kullanılırautophagosome miktar olduğunu. Uygun istatistiksel temsil için 15-30 alanlarda birim alan başına autophagosomes saymak. Autophagosomes geç evre autophogosomes dolu vakuoller andıran çift zar yapısı var.

Sonuçlar

Bakteremi erken CLP kaynaklı sepsis ¹⁴ 6 saat sonra farelerdeki bulunur. (Titreme, takipne ve bozulmuş motor aktivite de dahil olmak üzere) sepsis klinik bulguları işlemden sonra yaklaşık 12 saat görünür. Fareler peritonit indüksiyon sonrası yaklaşık 18 saat sonra ölmeye başlar CLP tabi. Daha ciddi fazla artan sepsis öldürücü ¹⁵ olmasıdır. CLP 7 gün sonra% 60 civarında ölüm orta dereceli sepsis sonuçları (bu sürenin ötesinde, hiçbir ölüm bekleniyor) ise detaylı, y?...

Tartışmalar

CLP büyük avantajı araştırmacıların (düşük-orta ve yüksek sınıftan itibaren yani) farklı ağırlıktaki sepsis araştırmak için izin vermesidir. Neden olduğu sepsis şiddeti bağlanmış çekum uzunluğu (en önemli belirleyicisi) etkilenir, delme için kullanılan iğne boyutu ve deliklerin sayısı ^15, gerçekleştirilir. Buna ek olarak, fare suşu ve cinsiyet sepsis şiddetine etkileyebilir; çeşitli suşlarının diğerlerine göre daha hassastır ve genellikle erkek kadınlarda...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
GFP-LC3 Transgenic Mice	Riken (Japan)	RBRC00806	GFP-LC3#53
Xylazine	Henry-Schein	568-0606	Xylazine HCl Injection Vet
Ketamine	Henry-Schein	995-2949	Ketaset Inj 100 mg/ml
EtOH	Fisher	A405-20	Histology Grade
EtOH	Fisher	A407-1	For Sterilizatiion
silk surgical sutures 6-0	Owens & Minor	2300-0078OG, 017624
buprenorphine-HCl	Henry-Schein	614-5157	Buprenex Ampules
paraformaldehyde (37%) solution	JT Baker	S898-09
xylenes	Fisher	X3P-1GAL
anti-GFP monoclonal antibody	Life Technologies	G10362
Hoescht	Sigma	944403
DAPI	Invitrogen	D1306
OCT	VWR scientific	25608-930
Sudan Black	Santa Cruz	sc-203760
EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate	Electron microscopy Sciences	15960
propylene oxide	Sigma	240397
Agar 100 resin	Agar scientific	R1045
dodecenylsuccinic anhydride	Sigma	46346
methylnadic anhydride	Sigma	45359
N-benzyldimethylamine	Sigma	185582