Boyuna MRG Ardından Meme Kanseri Beyin Metastaz bir Fare Modeli geliştirmek için ultrason görüntüleme eşliğinde intrakardiyak enjeksiyon

Özet

Bir meme kanseri beyin metastazı fare modeli MDA-MB231/Br-GFP hücreleri ultrason görüntüleme kılavuzluğunda intrakardiyak enjeksiyonu ile kurulmuştur. Multifokal intrakranial metastaz gelişimi, yüksek çözünürlüklü 9.4 T MR kullanılarak uzunlamasına izlenir olmuştur.

Özet

Meme kanseri beyin metastazı, evre IV meme kanseri hastalarının% 30'unda görülen, yüksek mortalite ile ilişkilidir. Medyan sağkalım sadece 6 aydır. Bu, klinik senaryo olarak metastatik hücrelerin yayılmasını hemodinamik taklit etmek için uygun hayvan modelleri olması önemlidir. Burada, atimik çıplak farelerin sol ventrikül içine, beyin tropikal göğüs kanseri hücrelerinin doğru bir kılavuz enjeksiyon için küçük bir hayvan ultrason görüntüleme kullanımını sunuyoruz. Boyuna MRG intrakranial başlatılması ve beyin metastazlarının büyümesini değerlendirmek için kullanılır. Ultrason eşliğinde intrakardiyak enjeksiyon doğru enjeksiyon ve bu vesile ile daha yüksek bir oranda başarılı değil sadece sağlar, aynı zamanda bizim önceki el yordamı ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak mortalite oranı azalmıştır. In vivo yüksek çözünürlüklü MRI gibi küçük, hiperintens multifokal lezyonların görülmesini sağlar 310 mikron T üzerinde çapı 3 hafta sonrası enjeksiyon görüntüleri _{2-ağırlıklı.} Follow-up MR intrakranial tümör büyümesini ve tüm beyin çapında dağıtmak metastaz artan sayısını ortaya koymaktadır.

Giriş

Beyin metastazı erişkinlerde en sık görülen intrakranial hastalıktır. Prognoz bile agresif tedavi ile 4-6 aylık bir medyan sağkalım, son derece kötüdür. Meme kanseri beyin metastazı ^1-3 yüksek morbidite ile üç büyük temel kanserlerden biridir. Çeşitli beyin-tropik meme kanseri hatları intrakardiyak veya intracarotid enjeksiyondan sonra ⁴ beyin metastazı geliştirme yeteneğine sahiptir. Sol ventrikül içine tümör hücrelerinin direkt enjeksiyon akciğer kılcal yatak atlamak ve böylece visseral metastaz en aza beyin metastazı oluşturan sıklığını artırabilir. MDA-MB231Br hat kemirgen modellerinde ^5,6 beyin metastazı geliştirmek için en yaygın olarak kullanılan insan göğüs kanser hücre dizilerinde biridir.

Diğer birçok çalışmalarda ^4,7 gibi, bizim daha önceki çalışmalarda intrakardiyak enjeksiyon manuel işlem gerçekleştirdik. Ancak sadece% 50 başarılı oran kılavuzu ile elde edildiönceki denemeleri başarısız olursa enjeksiyon ve farelerin bir kısmı tekrarlanan invaziv prosedürler öldü. Burada, atimik farelerde sol ventrikül içine, beyin arayan meme kanseri hücrelerinin enjeksiyonu sağlamak için bir görüntüleme rehberliğinde prosedürünün kullanımını sunuyoruz. Boyuna yüksek çözünürlüklü MRI beyin metastazı intrakranial gelişimini takip uygulanır.

Protokol

Bütün hayvan prosedürleri Teksas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

1.. MDA-MB231/Br-GFP Hücreler hazırlanması

1. % 10 FBS,% 1 glutamin ve% 1 penisilin / streptomisin içeren DMEM ortamı içinde (nazik Dr. Palmieri ve Steeg, NCI tarafından sağlanan) MDA-MB231/Br-GFP hücrelerini almak ve kültür.
2. Hücreler ve ortamın rengi durumunu dikkate alınız, ve her 2-3 günde bir ortam değiştirin.
3. Tripsinize ve adımda tarif edildiği gibi% 80 izdiham 1.3.1-1.3.5 ulaşıldığında hücreleri toplamak:
   1. Tamamen eski orta çıkarın ve yavaşça Hücreleri yıkamak için 5 ml PBS (1x) ekleyin. Çanak PBS çıkarın.
   2. Çanak 1.5 ml Tripsin ekleyin, tüm hücreler tripsin tarafından karşılanmaktadır sağlamak için hafifçe çanak eğin. Geri hücre kuluçka makinesi için çanak koyun ve 1 dakika boyunca 37 ° C'de tutun.
   3. Kuluçka çanak alın ve gözlemlemekhücreler sağlamak için bir optik mikroskop altında, hücreler çanak ayırmak.
   4. Tripsin etkisini durdurmak için 3 ml orta ekleyin. Bir santrifüj tüpüne hücre karışımını toplamak. 5 dakika boyunca 2,000 rpm'de santrifüje karışımı.
   5. Dikkatlice Ortamı çıkarın ve homojen hale gelinceye kadar 5 ml serum barındırmayan ortam içinde hücreler tekrar süspansiyon haline getirin.
4. Uygun hücre sayısını ve 100 ul hacim içinde 1.75 x 10 ⁵ hücre bir son konsantrasyona bulunan serumsuz DMEM ortamı içine tekrar süspansiyon.
   1. 50 ul hücre karışımı alın ve 50 ul Trypan Mavi ekleyin. Karıştırma işleminden sonra, 10 ul karışımı almak ve dikkatli bir şekilde hücre sayımı slayta ekleyin. Doğru hücre sayısı tahmini sağlamak için birden çok örnekleri kullanın.
   2. Hücre sayımı slayt, bir seferde bir uç ile otomatik hücre sayacı saymaya başlar sopa. Bütün sayma sonuçların ortalama alın ve toplam hücre sayısını hesaplayın.
   3. Yine hücreler santrifüj ve bunları tekrar süspansiyonhacim ul 1.75 x 10 ⁵ hücre/100 nihai konsantrasyonu ile sonuçlanması serumsuz ortamda uygun hacmi.
5. Önce intrakardiyak enjeksiyon için buz üzerine yerleştirin hücreleri.

2. Ultrason görüntüleme eşliğinde intrakardiyak enjeksiyon

1. Eski 6-8 hafta arası kadın çıplak fareler (BALB / c nu / nu) kullanın.
2. Görüntüleme sistemi oturum açın. Dönüştürücü 704 (40 MHz) başlat.
3. Yeni bir çalışma başlatın ve bilgileri doldurun.
4. Anestezisi (indüksiyon odasında% 3 isoflurane/100% O ₂₎ ve bir burun konisi yoluyla tüm prosedür esnasında% 100 O ₂ (1 dm ³ / dak) izofluran (% 2) ile hayvanları korumak. Hiçbir geri çekilme refleksi ayak tutam ile görülmektedir zaman anestezi teyit edilir.
5. 37 ° C için görüntüleme tablo sıcaklığını ayarlama Sırtüstü pozisyonda ısıtılmış görüntüleme masaya anestezi fare bantlayın.
6. Im önce 37 ° C 'de, ultrason jel Olyaşlanma. Fare göğüs jel uygulanır.
7. Tutucuya vericiyi. Istenen görüntüleme derinlik ulaşana kadar dönüştürücüyü indirin. Sol ventrikül dönüm noktası olarak çıkan aorta (Şekil 1A) ile tespit edilene kadar sahne taşıyın. Sol ventrikül net bir manzara görüntülenmiştir sahne kilitleyin.
8. Bir 22 G iğne ile bir 1 ml şırınga içine hücre karışımı 100 ul çizin. Yerleştirin ve montaj şırınga şırınga düzeltmek.
9. Fare göğüs doğru ileri şırınga taşımak ve iğne ucu (fareyi girmeden önce) görüş görüntüleme alanında olduğu kadar dikkatli tarafına tarafına taşımak.
10. Sol ventrikül aşağı hedefliyoruz iğne yüksekliğini ve açısını ayarlayın.
11. Ultrasonografi rehberliği altında sol ventrikül içine derhal cilt ve kas katmanları üzerinden intercoastal uzaya şırınga iğnesi nüfuz.
    Sol ventrikül içine iğnenin sokulması başarılı bir göstergesicle şırıngaya taze arteriyel kan (koyu kırmızı kan venöz aksine pembe renkli) reflü
12. Hücre karışımı yavaş yavaş (Şekil 1 B) enjekte edilir.
13. Tamamlanmasından sonra, iğneyi dönüştürücüyü yukarı kaldırın, nemli gazlı bez ile ultrason jeli temizlemek ve bandı çıkarın.
14. Önceden ısıtılmış pad ile temiz bir kafes hazırlayın.
15. Pad üzerinde hayvan koyun ve tam iyileşme kadar hayvan gözlemlemek.
16. Hayvanın davranışı iki gün boyunca her 24 saat izleyin.
17. Genel şartlar ve deney farelerinde komplikasyonlar nörolojik bulgular rutin izlenir.

3. İntrakraniyal Tümör Kalkınma MRG takibi

1. Beyin metastazı intrakranial gelişimini izlemek için 9.4 Tesla mıknatıs kullanın.
2. Iki hafta Tümör implantasyon sonrası MRG başlatmak ve üç hafta boyunca haftada bir kez tekrarlayın.
3. % 3 izofluran ile hayvanları sakinleştirin ve gen altında onları korumakral anestezi (% 1.5 izofluran).
4. Monitör ve deney boyunca hayvanın vücut ısısı ve solunum sabit tutmak.
5. Yüksek çözünürlüklü kesitli (1 mm ile 14 dilim kalın, hiçbir boşluk) T ₁ - ve T ₂ ağırlıklı koronal posterior fossa frontal lob gelen bölgeyi kapsayan görüntüleri, aşağıdaki parametreleri ile elde edilir: T _{1-ağırlıklı} görüntüler: echo birden dilim (SEMS) dönmeye, TR / TE = 400 msec/20 msn, matriks: 256 x 256, uçak çözünürlükte FOV 20 x 20 mm, 78 x 78 mikron ^2. T _{2-ağırlıklı} görüntüler: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, düzlem çözünürlüğü: 78 x 78 mikron hızlı spin birden dilim (FSEMS) dizileri, TR / TE = 2500 msec/48 msn, 8 yankı trenler, matris echo ^28,9.
   Tümör lezyonlar T _{2-ağırlıklı} görüntülerde normal beyin dokusuna göre daha parlak görünür.
6. Tümör boyutu elle donanımı tak özetleyen T _{2-ağırlıklı} görüntülerde belirlenirBizim ⁸ tarafından yazılmış MATLAB programlarını kullanarak her bir resmin üzerine kitle bölümünü dans ediyorum.
   Çapı, kesit kalınlığı (1 mm) 'den küçük olan, tümörün en çok göz önüne alındığında, tümör boyutu oldukça hacimden düzlemi alanında olarak sunulmuştur.

4. H & E Boyama Metastazlari Onaylanması

1. Tümör taşıyan beyinleri incelemek hemen son MR taradıktan sonra fareler feda ve Ekim ortamı içine gömmek ve -80 ° C de donduruldu
2. Bölüm 10 mikron kalınlığında koronal beyin bir dizi kriostat sahip örnekler.
3. Beyin kesitlerinde H & E boyama yapın.

Sonuçlar

MRG (düzlem çözünürlükte 78 mikron) yüksek uzaysal çözünürlüğü ile hiperintens lezyonlar (Şekil 2) çapı 310 mikron kadar küçük tespit edilebilir. Bu çalışmada metastaz çok küçük ve nekroz ve ödem gelişme olduğu _T-2 ağırlıklı görüntülerde hiperintens lezyon gerçekten tümör kitlesini temsil az.

Uzunlamasına MRI çalışmaları, tümör büyümesinin vivo noninvaziv değerlendirilmesinde sağlar. Şek...

Tartışmalar

Bu çalışmada, bu çalışmada geliştirilen beyin metastazı her hayvan ve hayvansal ölüm gözlenmedi böylece ultrason görüntüleme rehberliğinde sol ventrikül enjeksiyon doğruluğunu garanti olduğunu göstermiştir. Görüntü kılavuzlu enjeksiyon güzelliği deri ve son olarak da, sol ventrikül içine iğne penetrasyon yolu izlenir ve takip etmek katı anatomik yerler gerektiren Manüel prosedür ayrıdır görüntüsü altında ayarlanabilir olmasıdır.

Beyin metastazı int...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	HyClone	SH30022.01
Trypsin	Mediatech	25-051-C1
Automatic cell counter	BioRad	TC10
Isoflurane	Baxter International Inc.	1001936060
VisualSonics Vevo 770 High-Resolution Imaging System	Visual Sonics Inc.
9.4 T horizontal bore magnet with a Varian INOVA Unity system	Agilent
O.C.T Compound	Sakura Finetek USA	4583