Fare Kornea Neovaskülarizasyonunun bir Alkali-yanık Yaralanma Modeli

Özet

Korneanın neovaskülarizasyon (NV) çoklu görsel patolojileri karmaşık hale getirebilir. Kontrollü, alkali-yanık yaralanması modeli kullanılarak, korneal NV bir ölçülebilir düzeyde neovasküler hastalıkları için potansiyel tedavilerinin kornea NV ve değerlendirme mekanik çalışma için üretilebilir.

Özet

Normal koşullar altında, kornea avasküler, ve bu iyi bir şeffaflık görme keskinliği korumak için gereklidir. Travma, keratoplasti veya bulaşıcı hastalığa neden olabilir kornea, Neovaskülarizasyon (NV) korneanın sözde 'Anjiyojenik ayrıcalığı' ayırır ve hatta körlüğe neden olabilir birden fazla görsel patolojilerin temelini oluşturur. Çeşitli tedavi seçenekleri olmasına rağmen, kornea neovasküler patolojilerin tarafından sunulan temel tıp ihtiyacı karşılanmamış kalır. Güvenli, etkili ve hedefli tedaviler geliştirmek amacıyla, kornea NV ve farmakolojik müdahale güvenilir bir model gereklidir. Burada, fare içinde bir alkali-yanık yaralanması korneal neovaskularizasyon modeli açıklar. Bu protokol, kornea, ilgi konusu bir farmakolojik bileşik uygulaması, ve sonuç görselleştirilmesi için kontrollü bir alkali-yanık uygulanması için bir metot sağlar. Bu yöntem instrumen olabilecektal kornea NV ve diğer neovasküler bozukluklarında müdahale mekanizmaları ve fırsatları eğitim için.

Giriş

Kornea körlük tüm olgularda ¹ yaklaşık 4% sorumlu körlüğün en yaygın dördüncü nedenidir. Kornea neovaskülarizasyon (NV) herpetik keratit (Batı'da körlüğün en önde gelen nedenidir bulaşıcı) ve trahom (dünya çapında bulaşıcı körlüğün önde gelen nedenidir) ² dahil olmak üzere bu patolojilerin, çok önemli bir rol oynar. Mevcut tedaviler steroidler, steroidal olmayan anti-enflamatuar ilaçlar (NSAID), anti-VEGF terapileri, A ve yanı sıra, geleneksel lazer ya da cerrahi teknikleri ³ siklosporin içerir. Ancak, kornea NV bazlı patolojilerin ciddi zayıflatıcı doğa, cerrahi kornea NV tedavi edebilen tesisleri ve güçlü bir performans farmakolojik seçeneği eksikliği yetersizliği, kaybolmamış tedavilere rağmen, temel tıbbi ihtiyacı olduğu sonucuna yeni bir uzman yuvarlak masa açtı Bu patolojilerde tarafından sunulan ⁴ karşılanmamış kalır.

Insan kornea5 kat, 3 hücre tabakaları (epitelyal, stromal ve endotelyum) ve 2 arabirimi (Bowman ve zar Descemet) oluşur. Bu göz için mekanik bir engel ve refraktif yüzeyi olarak işlev görür. Onun şeffaf doğası onun bileşenlerinin hassas bir denge sonucudur ve doğru fonksiyon ⁵ ayrılmaz bir parçasıdır. Normal avasküler, kornea ve göz siliyer arterlerden beslenir dış kenarı boyunca uzanan kılcal kan alır. Bir uyarıcı onları kornea merkezine doğru büyür ve böylece görme ⁶ sınırlamak için izin Bu damarların anjiyojenezi teşvik zaman korneal NV oluşur. Kornea anjiyojenez kornea merkezine doğru limbal damar pasajı kan damarları ve lenf damarlarının büyümesinin neden olan hemangiogenesis ve lenfanjiyogenezin içerir. Bu kornea "Anjiyojenik ayrıcalık", korneal opasite ve fibrozis bir artış, korneal la bozulması bozulmasına yol açarkuramsal ve ödem ^7. Kornea NV'nin kesin tetikler geleneksel ilaçlar, endüstriyel kimyasallar, hatta kimyasal savaş ajanları neden olduğu bulaşıcı hastalığa bir tepki böyle trahom gibi bir kimyasal kaynaklı durumuna kadar çoktur.

Bu sürecin moleküler mekanizmalar, henüz tam olarak karakterize edici özelliği değildir; Ancak, birkaç anahtar oyuncular tespit edilmiştir. Normal koşullar altında, kornea (örneğin, çözünür VEGF-R1 gibi) anti-anjiyojenik faktörler ⁸ bir yedek dizisi tarafından tutulan bir benzersiz bir 'anjiyojenik ayrıcalık' sahiptir. Bununla birlikte, (örneğin, bir yaralanma gibi) harici bir uyarana yanıt olarak, pro-anjiyojenik faktörler (VEGF-A) yerel bir yukarı-regülasyonu olacaktır. Bu ipuçları kornea Anjiyojenik ayrıcalığını yatan ve bu nedenle kornea patolojisi ve hatta körlüğe neden ^9, hemangiogenesis, lymphangeogenesis ve inflamasyona neden olur yanlısı ve anti-anjiyogenik faktörlerin dengesi.

Bu son derece zayıflatıcı patolojinin karşılanmamış tıbbi ihtiyaçları göz önüne alındığında, bu kornea NV güvenilir bir hayvan modeli var alanına ilgi. Kontrollü alkali-yanık: İşte biz böyle bir model sunuyoruz. Filtre kağıdı yüzük kullanmaya dayalı çeşitli göz yaralanması modelleri 1970'lerden ¹⁰ beri kullanılmaktadır. 1989 yılında, Harvard Medical School oftalmologların bir grup, sodyum hidroksit (NaOH) ile yuvarlak bir filtre kağıdı parçası ıslatma ve belirli bir aralığının en kornea uygulamadan göre tavşan merkezi bir korneal alkali yanığı hasarının bir standart model özelliği, konsantrasyonları ^11. O zamandan beri, bu teknik, fare ^12-14 kullanılmak üzere adapte edilmiştir. Son zamanlarda, Wang laboratuvar fare korneal alkali yanık yaralanma modeli ¹⁵ kullanılarak kornea NV patogenezinde histon deasetilaz (HDAC) inhibitörü SAHA terapötik etkilerini inceledi. Burada yer alan fare korneal alkali-yanık yaralanması modeli inşa edilmiş metodolojiEsas olarak iki diğer kağıtlar ^14,16 önceden çalışmaları.

Protokol

Not: Aşağıdaki protokol ve sonuçlar temsili bir örneği, bir bileşik olarak HDAC inhibitörü SAHA kullanın. Bununla birlikte, bu protokol SAHA kullanımıyla hiçbir şekilde sınırlı değildir ve korneal neovaskularizasyon üzerindeki çözünür bileşiklerin etkisini test etmek için genel bir yöntem olarak tavsiye edilir. Küçük değişiklikler seyreltme derecesi hem de frekans ve uygulama süresi için yapılmış olması gerekir. Ek olarak, su içinde kolayca çözünür olan bileşikleri DMSO yokluğunda tatbik edilmesi mümkün olacaktır.

Etik Açıklama: Tüm hayvan deneyleri sadece ulusal hukuk ve kurumsal düzenlemelere uygun olarak yapılmalıdır. Bu protokol, Tulane Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kullanım için onaylanmıştır.

1.. (Kullanım Düzeninde) Malzemelerin Hazırlanması

1. 2 mm daire içine selüloz filtre kağıdı (11 mikron) bir parça kesin.
2. NaOH ile 1 M çözelti hazırlayın500 ml damıtılmış _H2O içinde NaOH 20 g çözülmesi Oda sıcaklığında saklayın. DİKKAT: NaOH çözümleri aşındırıcı ve alkali-yanıklara neden olabilir.
3. Nihai 20 mg / ml ketamin konsantrasyonu ve 4 mg / ml ksilazin 1x PBS 37.5 ml 20 mg / ml ksilazin 10 ila 100 mg / ml ketamin ml ve 2,5 ml seyreltilmesi ile bir anestezi kokteyl hazırlayın.
4. Filtre PBS 100 ml proparakain hidroklorür 500 mg çözülmesiyle (lokal analjezi için) proparakain hidroklorür ile% 0.5 'lik çözelti hazırlayın.
5. 8 g NaCl, 0.2 g KCI, 1.44 g ₂ Na HPO _{4 ve} damıtılmış _H2O içinde 900 ml NaH ₂ PO _4, 0.23 g çözülerek 1x PBS hazırlayın 7.4 pH ayarlayın. Sterilite sağlamak için damıtılmış _H2O ve filtre ile 1000 ml 'lik bir son hacim için çözüm getirmek.
6. DMSO içinde 1 ml SAHA 26.4 mg çözülmesiyle dimetil sülfoksit (DMSO) içinde ~ 100 mM'de SAHA 1000 x stok çözelti hazırlayın. Bir 1x sulandırmak (~ 10 uM)her bir kullanım için, filtre PBS çözeltisi. Kadar bir ay boyunca -20 ° C de stok solüsyonu saklayın. DİKKAT: DMSO bilinen bir toksin ve mutajen olduğu.
7. Tespit için paraformaldehid (PFA) bir% 4 çözelti hazırlayın. Kimyasal bir başlık altında, PBS içinde 90 ml PFA 4 g çözülür. 65 ° C'ye kadar karışımın getirin ve 7.4 arasında bir pH'a titre edilir. PFA çözündükten sonra, 100 ml 'lik bir son hacim için bir çözüm getirir. Kadar bir ay boyunca 4 ° C'de saklayın. DİKKAT: PFA bir, alerjik karsinojenik ve toksik olduğu bilinmektedir.
8. PBS içinde 94.5 ml keçi serumu içinde 5 ml ve Triton X-100'ün 500 ul seyreltilmesi ile 1 x bloke edici tamponu hazırlayın.
9. PBS içinde 99.5 ml Triton X-100, 500 ul seyreltilmesi ile 1x yıkama tamponu hazırlayın.

2. Yaralanma ve Bileşik Tedavisi Alkali-Yanık

1. 1 M NaOH çözeltisi içinde, çapı filtre kağıdı yuvarlak parça, yaklaşık 2 mm bekletin.
2. WH, 100 mg / kg ketamin ve 5 mg / kg ksilazin enjeksiyonu ile fare anestezisiich ~ 25 g fare başına aşama 1.3 anestezik kokteyl 100 ul. Anestezi anestezi yanıt olmalıdır yeterli ise, yavaşça hayvanın parmak veya kuyruğu kısma belirlenebilir ~ anestezi derinliği in ayarlamak için 1-2 dakika sürer. Not: Bakım fare anestezi kaynaklı hipotermi yenik değildir sağlamak için alınmalıdır.
3. Bir damlalık kullanarak, topikal lokal analjezi için kornea yüzeyinin 0.5% proparakain hidroklorür bir damla uygulanır.
4. Steril forseps kullanarak, NaOH ıslatılmış filtre kağıdı bir parça almak. Eğer aşırı NaOH tutunarak veya filtre kağıdı damlayan fark ederseniz, kısaca aşırı emmek için filtre kağıdı kuru bir parça üzerinde ıslatılmış filtre kağıdı dokunun. Merkezi kornea üzerinde NAOH ıslatılmış filtre kağıdı parçası koyun. Bölgede ~ 2 x ^{2, 2} mm arasında akut alkali-yanık oluşturmak için 30 saniye boyunca bekletin. Bir cerrahi mikroskop düzgün bir filtre kağıdı koyularak yararlıdır. Not: fare s Sadece bir gözünühould diğer bir kontrol olarak hizmet veren yaralanabilir.
5. Filtre kağıdı çıkarın. Bir 10 ml şırınga kullanarak, yumuşak kalıntı 1 M NaOH aşındırmak için iki kez 1 x 10 ml PBS ile göz yıkayın.
6. Hemen 1x SAHA hazır çözelti (ya da PBS içeren bir araç kontrol no SAHA içeren seyreltilmiş DMSO) topikal kornea bir damla uygulanır. 14 gün boyunca uygulama 3x/day tekrarlayın. Not: zedelenmesinin gelişiminde ve bileşiğin verilmesine bir müdahalede olabileceğinden bu dönemde bir lokal antibiyotik merhem tavsiye edilmez. Bir sıvı antibiyotik çözüm gibi% 3 Gentamisin çözüm yerine kullanın.
7. Klinik Değerlendirme (aşağıda Protokolü 3) doğrudan devam veya fare kurban ve (aşağıda Protokolü 4) ya da geleneksel parafin / dondurulmuş histoloji kornea düz montaj için gözleri tanıttılar.

3. Klinik Değerlendirme

1. Cerrahi bir mikroskop altında bir kör şekilde farelerin günlük inceleme yapın ve c skororneal NV korneal opasite, NV ve damar boyutuna göre. En az iki gözlemci kullanmak ve iki ortalama bir skor kaydedebilirsiniz.
   1. 0-4 bir ölçekte kornea saydamlığını skor. 0 = tamamen açık; 1 = hafif puslu, iris ve öğrenci kolayca görülebilir; 2 = hafif opak, iris ve öğrenci hala saptanabilir; Zor saptanabilir 3 = opak, öğrenciler; ve öğrencinin hiçbir manzaralı tamamen opak 4 =.
   2. 0-3 arasındaki bir ölçek üzerinde NV Skor. 0 = hayır neoveselleri; Korneal limbusta 1 = neoveselleri; Kornea limbus kapsayan ve kornea merkezine yaklaşırken 2 = neoveselleri; Kornea merkezi kapsayan 3 = neoveselleri.
   3. 0-3 arasındaki bir ölçek üzerinde damar büyüklüğü Skor. 0 = hayır neoveselleri; Ameliyat mikroskobu altında tespit 1 = neoveselleri; Kolayca cerrahi mikroskop altında görülebilen 2 = neoveselleri; Kolayca mikroskop olmadan görülen 3 = neoveselleri.
2. Bir dijital kamera kullanıyorsanız, 7 gün ve 14 gün gözün temsilcisi görüntü almak.

4.Kornea Boyama ve Düz Mounts

1. 4 ° C'de en az 1 saat süreyle% 4 PFA içinde enüklee göz saptamak
2. PBS 1x ve dikkatle aşırı doku çıkarmak için forseps kullanabilir göz aktarın.
3. Bir cerrahi mikroskop yardımı ile, (Bu göz sıvının serbest gereken dikkat edin) gözün pericorneal bölgesini delmek için bir iğne (18 ölçü) veya mikro bıçak kullanın.
   1. Bölüm 4.3.1 'de yapılan delikli itibaren arka kısmından göz (kornea) ön kısmını kesmek için cerrahi bir makas kullanımı.
4. 4 ° C'de gece boyunca sabitlenmesi için geri% 4 PFA içine kornea aktarın
5. (: PFA tehlikeli ve kurumsal düzenlemelere uygun olarak bertaraf edilmelidir DİKKAT) ve kalan PFA çıkarmak için 1x PBS ile korneaya üç defa çalkalayın% 4 PFA atın.
6. Doku permeabilize ve birincil antikorun özel olmayan bağlanmasını önlemek üzere, oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca 1 x bloke edici tamponu içinde inkübe.
   1. Bir 100-500 kat seyreltmede, 1 x bloke edici tampon maddesi içinde birincil antikor uygulayın. 1:100 kan damarlarının tespit etmek için (örneğin, sıçan anti-fare PECAM-1, tavşan anti-fare-LYVE-1 makrofajlar tespit etmek için 1:500 'de lenf damarlarına tespit ve / veya fare için anti-mouse-F4/80 1:100). Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edilir.
   2. Tam Bağlanmamış birinci antikorları ayıklamak için oda sıcaklığında 1 saat boyunca 1 x Yıkama tamponu ile her altı kez yıkayın.
   3. 1x bir 500-1000 kat seyreltmede bloke edici tampon içinde bir ikincil antikor uygulayın. (Örneğin, 488 nm floresan 1:800 at, keçi anti-fare-IgG'si etiketli ya da 594 nm floresan 1:800 da keçi anti-tavşan-IgG'si etiketli). Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edilir.
   4. Tam Bağlanmamış ikinci antikorları ayıklamak için oda sıcaklığında 1 saat için, her 1x PBS ile üç kez yıkanır.
7. Taze 1x PBS içine aktarın ve kornea, bir cerrahi mikroskop yardımıyla, dikkatlice yüzde doğru çevresinden dört kesiler yapmaker. Bu (edilen şekil yerine bir kelebek gibi görünmelidir) yaklaşık olarak eşit büyüklükte dört parçaya bölünür kornea bölmek ve bir slayt düz yatmak için izin vermelidir.
8. Floresan görüntüleme için bir montaj orta uygun şekilde monte edilir. En iyi sonuçlar için, numuneler hemen görüntülü olmalıdır ve dijital fotoğraf alınmıştır, ancak, 4 ° C'de ışıktan korunmuş olarak birkaç hafta boyunca depolanabilir

Sonuçlar

Alkali-yanık yaralanması sonrasında, kornea NV tahmin edilebilir, zamana bağlı bir şekilde oluşur. 1, bir muamele edilmemiş hayvan (Şekil 1A) ve HDAC inhibitörü SAHA (Şekil 1B ile tedavi edilmiş bir hayvan arasında yeni damarlanma ve kornea opasitesi hem de sade farkı gösterir Şekil ) 7 günlük bir zaman noktasında gerçekleştirilir.

Şekiller 2A ve 2B, primer PECAM-1 ve ...

Tartışmalar

Burada sunulan protokol bu üç (birbiriyle) süreçleri incelemek için ideal bir sistem haline hemangiogenesis, lenfanjiyogenezin ve inflamasyon tekrarlanabilir seviyeleri ile sonuçlanır. Bu yöntem merkezi kornea NV, hapların ¹⁸ ifade büyüme faktörü korneanın ¹⁷ yani sütür daha yönetti NV, neden geliştirilmiş ve implante edilmiş çeşitli yöntemler üretirken, aynı zamanda ilgi çekici olabilir. Bizim protokol de büyük memeliler için henüz mevcut değil moleküler ve transgen...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe	BD	309659
18 G Needle	BD	305918
10 ml Syringe	BD	306575
25 G Needle	BD	305916
Anti-F4/80 (rat anti-mouse)	AbD Serotech	MCA497RT
Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse)	Abcam	ab14917
Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse)	BD	553370
Anti-IgG Alexa 488 (goat anti-rat)	Invitrogen	A11006
Anti-IgG Alexa 594 (goat anti-rabbit)	Invitrogen	A11012
Camera	Tucsen	TCC 5.0 ICE
Coverslips	Fisher	12-548-B
DMSO	Sigma	D4540-1L	Caution: Mutagenic, Toxic
Forceps (Blunt), Iris	WPI	15915
Forceps (Sharp), Dumont #4	WPI	500340
KCl	Fisher	P217-500
Ketamine Solution	MedVet	RXKETAMINE	Controlled substance, proper license required for use.
Light Source for Microscope	AmScope	LED-14M-YA
Microscope (Stereo 7X-45X)	AmScope	SM-1B
Mounting Medium, VECTASHIELD	Vector	H-1000
NaCl	Fisher	S271-10
NaH2PO4	Fisher	S397-500
NaOH	Fisher	S318-1	Caution: Corrosive
Paraformaldehyde		P6148-500G	Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
Proparacaine Hydrochloride	Sigma	P4554-1G
Scissors (5 mm blade), Vanas	WPI	14003
Goat Serum	MPBio	92939249
Microscope Slides	Fisher	12-550-15
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
Whatman Grade 1 Filter Paper	Whatman	1001-6508
Xylazine Solution	MedVet	RXANASED-20