Canlı İlköğretim Hücrelerde G3BP Stres Granül Dinamiği Görselleştirme

Özet

Stres granüller (SGS) takılmıştır ribonükleoprotein parçacıklar (RNP) ve çeşitli gerilimlere, hücresel yanıt olarak önemli sitoplazmik RNA ihtiva eden granüller bulunmaktadır. SG-Dinamiği stresten sonra transfekte primer hücrelerde SGS etiketli bileşeninin lokalizasyonu görselleştirerek canlı hücrelerde takip edilebilir.

Özet

SGS spesifik protein bileşenlerinin ya da poli A + mRNA immuno hücrelerinde görselleştirilebilir. SGS son derece dinamik ve bunların montaj ve kader çalışma stres hücresel yanıtı anlamak önemlidir. G3BP (RasGAP SH3 alanı Binding Protein) gibi SGS önemli faktörler eksikliği fareler ve Merkezi Sinir Sistemi değişiklikler gelişim kusurlarına yol açar. Bir organizmanın, bir kutu kültürü birincil hücrelerden hücrelerde SG-dinamiklerini incelemek ve SGS transfekte etiketli bileşenin lokalizasyonu izleyin. Biz Fare Embriyonik Fibroblastlar G3BP1 içeren SGS (MEF'ler) gözlemlemek için time-lapse deneyi tarif. Bu teknik aynı zamanda, yakın zamanda, bu SGS Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların başlangıcı oluşan göstermiştir gibi önemli olan, canlı nöronlar G3BP içeren SGS incelemek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, başka bir hücre gövdesi ve granül protein bileşeni üzere uyarlanmış ve yapılabilirtransgenik hayvanlar, bu granüller belirli bir faktör yokluğunda, örneğin granüller dinamiklerinin canlı bir çalışma sağlar.

Giriş

Stres granüller (SGS) gibi yüksek bir sıcaklıkta, oksidatif stres, hipoksi, ozmotik şok, UV ışınlama, glikoz yoksunluğu, ya da viral enfeksiyon ^1. çevresel strese, bir hücre koruyucu bir cevap olarak meydana olmayan zar sitoplazmik odak noktasıdır. Bu, oksidatif stres tetikler sodyum arsenit gibi bileşikler ile muamele ile kimyasal olarak indüklenebilir. SGS durdu çeviri tutuklandı haberci ribonükleoprotein (mRNPs) birikir öteleme makine gelen mRNA'larını kenetleyerek, ² kompleksleri ve bunların montaj eIF2α fosforlaştırılmasına (ökaryotik başlatma faktörü 2 α) tarafından tetiklenebilir. SGS P-organları gibi polisomlar ve diğer tanecikler ile bileşenler alışverişinde dinamik yapılardır. Onlar mRNAlar sıralanır ve stabil olmayan polysomal mRNPs ³ çevrilmesinden, yeniden başlatılması, bozulması, veya paketleme ya için işlenen bir "triyaj merkezi" oluşturmaktadır. SGS montajı hızlı but daha büyük granüller halinde birleşerek ilk sayıda küçük agrega ile aşamalı bir süreçtir. Mikrotübülleri stabilize bozmak veya kimyasal inhibitörlerinin kullanımı, mikrotübül ağı tertibatı olup, birleşme ve demontaj işlemleri dahil SG dinamikleri için gerekli olduğunu göstermektedir.

SG-dinamik tertibatı aynı zamanda TIA-1 (T-hücresi iç antijen-1) ve RNA gibi özel bağlayıcı proteinlerin (RNA-BP) agregasyonu ile yükseltilir TIAR dimerize edebiliyoruz (TIA-1 ile ilişkili protein), ve ^SG-4 içine Polizom demontaj ve mRNAların yönlendirme teşvik. G3BP (RasGAP SH3 alan bağlayıcı protein) hücreleri arsenit yüksek sıcaklık ve stresli ve imalatçının talimatlarına G3BP aşırı ifadesi SGS montaj ⁵ uyarabilir zaman SG-lokalize bu tür bir RNA-BP olan.

G3BP ilk RasGAP p (a-Ras GTPaz aktive edici protein ile etkileşim yoluyla karakterize edildi evrimsel olarak muhafaza edilmiş bir RNA-BP120 ^6); ancak bu etkileşim son zamanlarda ⁷ dönülmüş oldu. G3BP ailesi iki memelilerde üyeleri, G3BP1 (G3BP olarak anılacaktır) ve G3BP2 ⁸ içerir. Hücreler strese ⁹ tabi olduğunda her iki proteinin de, SGS de colocalize. Kanonik RNA-tanıma Motif (RRM) korunmuş RNP1 ve RNP2 motifli: G3BPs bir N-terminal domain NTF2 prolin açısından zengin (PxxP) motifleri, ardından da lokalizasyonu ve oligomerizasyon, etkilemek için önerilen ihtiva eder, daha sonra C-terminal motifi RNA bağlama ile ilişkili , bir arginin-glisin zengin (RGG) kutusu izledi. İlginç bir şekilde, EGFP kaynaşmış farklı etki oluşturarak bu proteinin farklı parçaların analiz NTF2-benzeri domain ve RNA-bağlama alanı en verimli şekilde dimerizasyonunun özelliklerinin önemini işaret, SGS alınmış ve RNA bağlama olduğunu göstermiştir SG-montaj. Çeşitli in vitro modelleri ^10-13 içinde G3BP proteinlerin farklı işlevler ortaya koymuştur.Farelerde G3BP bozulması gelişim büyüme ve hayatta kalma ^14, hem de uzaysal çalışma belleği ^15'te ataksi ve bozuklukları ile karakterize olan Merkezi Sinir Sistemi (CNS) içinde G3BP için önemli bir rol bu proteinin önemini göstermiştir. G3BP eksikliği SG oluşumu ve nörodejeneratif hastalıklar ¹⁵ arasında doğrudan bir bağlantı kurarak, değişmiş nöronal plastisite ve kalsiyum dengesindeki yol açar. Bu nöronlar gibi primer hücrelerde SG-dinamiklerini incelemek edebilmek için bu nedenle önemlidir.

Bu protokol arsenit tedavi altında primer hücrelerde G3BP1 içeren SG-montajını gözlemlemek için basit bir yol sağlar. Bu gerilmeler, örneğin farklı türde, farklı koşullar altında SGS montaj incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, SGS diğer granüller veya diğer bileşenler için adapte edilebilir. Nitekim, bu protokol G3BP1 üzerinde duruluyor, ancak TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) ² gibi diğer stres granülleri belirteçler vardırFMRP (Fragile X Mental Retardasyon Sendromu protein) ^16, TDP-43 (transactive yanıtı DNA bağlayıcı protein 43) ¹⁷ veya ¹⁸ Staufen. Özellikle, TIA-1 / R benzeri proteinler aşırı ekspreyonlandıkları zaman farklı oluşan SGS fonksiyonu, düzenlenmesi ve ilgili transkript farklı olsa bile, montaj SGS uyarabilir RNA bağlayıcı proteinler çekirdek, G3BP benzerleridir. SG-bu önemli bileşenlerinden herhangi birini veya çekirdeği oluşturucu bir flüoroforla etiketli versiyonu transfeksivonu görüntü özellikle SGS montaj ve dinamiklerine yapılabilir.

Protokol

Bu protokol tüm hayvan prosedürleri 24 Kasım 1986 (86-609/EEC) Avrupa Topluluğu Konsey Direktifi kurallarına sıkı sıkıya bağlı bulunmaktadır. Yiyecek ve su ad libitum izin grubundaki fareler Evi. 12 saat ışık: karanlık döngüsü (7:00 ışık) bir 12 saat, kontrollü bir ortamda (22 ± 1 ° C,% 55 ± 5 nem) onları korumak.

1 Murin Primer Hücre Kültürü:. Fare Embriyonik Fibroblastlar (MEF'ler)

1. Ince forseps gibi kavisli bir forseps ve diseksiyon makas otoklavlayın. Steril bir kapta saklayın. Steril D-PBS (Dulbecco'nun Fosfat-Tamponlu Tuzu) kullanınız. Tam MEF'ler orta hazırlayın:% 10 fetal dana serumu (FBS), 1 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat,% 1 temel olmayan amino asitler ve 0.5 mM 2-merkaptoetanol ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) / F12 ve 37 ° C'de sıcak
2. 13.5 gün sonrası coïtum (DPC hamile bir fareyi (Euthanize)), Boyunları kırılarak. % 90 EtOH ile dezenfekte fareden rahim boynuzları çıkarın. Steril ve temiz Kaputun altında, 37 ° C embriyolar ile boynuzları yerleştirmek D-PBS prewarmed. Boynuzları, yer açın 100 mm steril plastik Petri kabındaki embriyolar, göbek kordonu malzemeden onları temizlemek ve kan aşırı kaldırmak için ılık D-PBS ile yıkayın. Bir binoküler altında, embriyonun bacaklarda, iç organları kaldırmak ve beyin içeren başın üst kısmı.
3. Yeni bir Petri tabağında, kıyma steril bir cerrahi ile çok küçük parçalar halinde embriyolar bıçak ağzı ya da makas (en az 1 dakika boyunca). Farklı genotiplerinin embriyo durumunda, tek tek her bir Petri tabaklarında embriyo koymak ve genotipleme için kuyruk ya da üst baş tutmaya dikkat edin.
4. 1x tripsin-EDTA (% 0.25 tripsin, 1 mM EDTA) ile embriyo örtün. 30 dakika bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde 1 saat için kuluçkalayın. Tam 10 ml EkleTripsin reaksiyonu durdurmak için MEF'ler ortamı. Pipet yukarı ve aşağı tüm agrega kaldırmak için. 10 dakika boyunca (tam ortam ile doldurulmuş) bir 50 ml tüp içine hücre süspansiyonu bekletin, ve oda sıcaklığında 300 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj süpernatant. Tam bir ortam (1 embriyo için 6 ml) 'de pelet tekrar. Canlı çekirdekli hücreler tripan kullanılarak sayılabilir mavi (Yaklaşık 5 x 10 ⁶ hücre bir embriyodan beklenebilir.) 60 mm Petri çanağı başına Levha 3 mi.
5. Ertesi gün orta değiştirin ve hücrelerin büyümesine izin yemekler birleştirilebilmeli kadar. Çok hücre tipleri görülebilir ancak fibroblastlar alt kültür hayatta kalacaktır.
6. Hücreleri bölmek ve bunları nakil için% 50-70 confluency kadar, cam altındaki (time lapse deney için önemli) ile 35 mm yemekleri büyümeye olanak sağlar. Mikoplazma ve fare patojenler için bir test.

2.. KültürüNöronlar Durumunda daptations

1. Kültür bir gün önce, poli-L-lisin, steril ve temiz bir başlık altında (0.1 mg / ml 200 ul) ile kat 35 mm cam alt Petri kapları bir gece bekletin.
2. Ertesi sabah, iki kez 45 dakika saat 1 için bir kez 5 dakika boyunca, steril saf su ile durulayın. 2 ml DMEM artı% 10 FBS ortamı ile değiştirin ve 37 ° C inkübatör tutun.
3. 18.5 DPC embriyolar teşrih. Steril ve temiz bir başlık altında, 100 mm Petri tabağına steril soğuk HBSS (Hank Dengeli Tuz Çözeltisi) 'de embriyolar ile boynuzları yerleştirin. Yeni doğan yavrular da baraj ömrünü korumak ve özellikle elde etmek zor olabilir transgenik hayvanların durumda, daha fazla yavrular üretmek için sağlamak amacıyla yerine embriyo kullanılabilir. Bireysel Petri yemekleri, her embriyo veya yenidoğan almak ve makas ile başını kesti. , Gözlerinin içine kavisli bir forseps takarak kafa tutun deri kesilmiş ve dikkatle arkasından yumuşak kafatasını açmakbaş gözünde kadar başın her iki tarafında. Optik sinirler ve beyin sapı kesmek, beyin kaldırmak ve HBSS içeren yeni bir Petri kabındaki koymak. Stereoskop altında, iki ince forseps kullanarak tüm meninksler kaldırmak. Hipokampları, korteks veya çalışma yapısına bağlı olarak beynin başka bir bölümünü ayırın.
4. Soğuk HBSS 4.5 ml kesilmiş beyin yapısı daldırın 15 ml tüpler içinde önceden hazırlanmış ve tripsin ile sindirme kadar buz üzerinde tutun. % 2.5 tripsin 0.5 ml eklenir ve 20 dakika için 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Sindirilmiş beyin parçalarını atmak değil son derece dikkatli olmak, HBSS ile tripsin 3x durulayın.
5. Olana kadar, 1 ml ucu ile donatılmış bir 1 ml mikropipet ile 1 ml (korteks) DMEM artı% 10 FBS ve yukarı ve aşağı pipetleme için birkaç kez 500 ul (hipokampi) içinde süspanse edin, daha sonra, 1 ml artı 200 ul ipuçları ile donatılmış hiçbir görünür agrega.
6. Her biri 35 mm cam botto hücre süspansiyonu 100-200 ul dağıtmaDMEM artı% 10 FBS ihtiva eden ve nöronlar, en az 3 saat boyunca 37 ° C'de uygun izin m çanak. Nöron önceden ısıtılmış tam ortam ile değiştirin (Neuro temelli vasat, 250 uM L-glutamin ile takviye edilmiş ve NS21 Chen et al. ¹⁹ 'de tarif edildiği gibi hazırlanmıştır) ve nöronal büyümeyi sağlamak için 37 ° C'de bırakın. (Div) (transfeksiyon verimliliği div ancak sinaptik bağlantıların bir çift daha iyi 7-10 div kurulmuş olduktan sonra daha yüksektir), in vitro olarak 5-14 gün sonra nöronları transfekte.

EGFP-G3BP1 Construct 3. Transfeksiyonu

35 mm tabak başına saflaştırılmış plazmid 3 ug kullanılarak, bir flüoresan işaretleyici (GFP gibi, YFP) kaynaşmış ilgi protein cDNA (SGS herhangi bir bileşen) ihtiva eden bir vektör ile transfekte hücreleri.

1. Üreticinin protokolü (Malzemeler / Reaktiflerin Tablo bak) sonra, ticari bir yöntemi kullanarak MEFS transfekte.
2. Bir kalsiyum ile transfekte nöronlar. Xia ve arkadaşları ²⁰ Kısaca uyarlanmıştır fosfat yöntemi:
   1. Çözümler hazırlayın: DMEM yıkama: 25 mM KCI içeren DMEM; transfeksiyon çözüm: 1x DMKY (HEPES 5 mM, _MgCl2 10 mM, fenol kırmızı) içeren DMEM-yıkama; ve şok çözelti: HeBS 1x, DMKY 1x, DMSO ve% 2 (v / v); ve 37 ° C'de muhafaza edin
   2. Nöronlar, filtre ortamı çıkarın ve 37 ° C'de tutmak DMEM-yıkama ile yıkanmakta, daha sonra transfeksiyon ortamı ile değiştirin ve kalsiyum fosfat plazmid DNA çökeltilerinin hazırlanması sırasında 37 ° C'de tutun.
   3. Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, (bu sırayla) Braun, su (50 ul son hacim), 2.5 M _CaCI2 5 ul, ve plasmid DNA 3 mikrogram ekleyin. Zaten bir yuvarlak dipli polipropilen tüp tanıtıldı HeBS 2x 50 ul üzerine bu karışımı bırakın. Düşmesi ile birlikte dönmesi ile tüp karıştırın. 30 dakika boyunca oda ısısında çökelti şeklinde olsun.
   4. Precipitat Eklee nöronlar üzerine, damla damla ve 30-50 dakika boyunca 37 ° C'de bırakın.
   5. 1 dakika boyunca şok çözümü ile değiştirin, sonra DMEM-yıkama ile durulayın ve nihayet koşullanan orta reintroduce. 37 ° C'de hücreleri tutun

SGS Meclisi ve Dinamikleri İçeren G3BP 4. Görselleştirme

1. Fenol kırmızısı içermeyen ortam ile fenol kırmızı içeren hücrelerin orta değiştirin.
2. Satın almalar için floresan ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanın. Mikroskop sistemleri açın: cıva lamba, bilgisayar, ve lazerler. En az 20 dk satın almalar başlamadan önce 37 ° C'ye odasını ısıtın.
3. G3BP ve üzerinde ifadesi SG-bir tür kendiliğinden oluşumunu uyarmaktadır. Hücreler, bu nedenle stres oluşumu olmadan transfeksiyondan sonra 24 saat SGS hakkının montajı için gözlenebilir. Alternatif olarak, daha fazla gerilme SG-montajını uyarılması için indüklenebilir. 0.5 mM sodyum arsenit ve yıldız ekleşu bileşik (granüller de 1 saat içinde oluşturulacak) eklenmesinden sonra kazanılmasını t.
4. Daldırma hedefi yağ ekleyin (40X veya 63X hedefleri kullanın) ve uyarlanmış 35 mm mikroskop tutucu hedefin üzerine Petri çanak kurmak, sahne tutucuya stabilize. Çanak satın almalar değişmiş olacak, aksi takdirde düz olduğunu kontrol edin. İlgili florofor göre flüoresans ışığı açın ve transfekte hücreler görselleştirmek. Ilgi konusu bir hücre sitotoksisitesini ağartma ve en aza indirmek için alanında bir kez floresan kapatın.
5. "Kazanmak sekmesi", etiket flüorofor (EGFP-etiketli G3BP kullandığı protokolde 488 nm) uyarma dalga boyuna bağlı olarak lazerler seçin ve PMT için uyarlanmış emisyon uzunluğunu (photomultiplier tüp) seçin. Gürültü ve doyma hem de toksisite en aza indirmek için lazer gücü (genellikle% 10'dan fazla) ayarlayın ve kazancı ayarlanır ve gürültü oranının sinyali modifiye etmek için ofset.Lazer fuar süresini (line ortalama 2, kare ortalama 1) en aza indirmek için (1000 Hz) hızlı tarama. Eğer arzu edilirse, Z yığını için parametreler 3D görüntü (1 um'lik bir Z aşaması hücreleri ile genellikle ince) yeniden mümkün olacak şekilde ayarlanır. Her edinimi arasındaki süreyi belirleyin: küçük aralıkları daha tutarlı bir film elde etmek izin ama bu photobleaching ve toksisite (20 sn bir aralık açıklanan deneylerde kullanılan) neden olabilir. Toplam satın alma süresi stres türüne bağlı olarak değişebilir. Birçok G3BP içeren SGS arsenit tedavi altında çok hızlı oluşur ve tedavisi 1 saat sonra iyi görünür vardır: Bu durumda, 15 satın almalar toplam süresi, sağ stres sonra satın almalar film ve başlatmak için hızlı hücreleri seçin - 20 dakika çeşitli SG-montajını gözlemlemek için büyük ölçüde yeterli değildir.
6. Resimleri kaydetmek ve ImageJ yazılımı kullanarak yığınları ve filmi yeniden.

Sonuçlar

Stres granül oluşumu stres apoptozun önlenmesi ile ilişkili, temizlendikten kadar durmuş çeviri hücresel adaptasyon izin, strese hücre yanıt olarak önemlidir. Bu tahlil izin anahtar SGS protein bileşenlerinin lokalizasyonu (Şekil 1) takip ederek, primer hücrelerde SGS çalışma. G3BP, SGS tertibatının önemli bir faktör, kültürlü MEF'ler veya nöronların (Şekil 2A, ve c) sitoplazmasında oldukça dağılmak mevcut olduğu, ve açık bir şekild...

Tartışmalar

Protokol endişe transfesktiyonu ve dikkatle sitotoksisite aşağı düşürmek için kontrol edilmesi gereken daha özel zaman atlamalı satın almalar, en kritik adımlar.

Primer hücre kültürü sürece steril koşullarda muhafaza edilir ve dikkatli diseksiyon ve hücre ayrışma adımları sırasında zarar görmesini önlemek için alınır gibi, zor bir parçası değildir. MEF'ler erken pasajlara donmuş muhafaza edilebilir. Kalsiyum fosfat ile transfeksiyon iyi Neuron ^21,

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Gibco	21331	Prewarm at 37 °C
Sodium pyruvate	Gibco	11360
Nonessential amino acids	Gibco	11140
L-Glutamine	Gibco	25030
Trypsin	Gibco	15096
Glass bottom B-35	Greiner	627860/627861	Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells)
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
DMEM	Gibco	31966	Prewarm at 37 °C
HeBS	Sigma-Aldrich	51558
Neurobasal	Gibco	21103	Prewarm at 37 °C
2-mercaptoethanol	Gibco	31350
Forceps	Biotek	DU-110-A	Very thin, tips 0.1 mm (useful to remove meninges)
Curved forceps	Biotek	P-110-BUF	Very thin, tips 0.1 mm
Small scissors	Biotek	CM-85-BS	Can be useful to remove hippocampi
Polyplus transfection JetPEI reagent	Ozyme	101-10	MEFs transfection, follow the forward protocol
Inverted laser scanning confocal microscope	Leica	SP5