Anti-Nükleer Antikor HEp-2 hücreleri kullanarak Eleme

Özet

Dolaylı immünofloresan (IIF) deneyleri, geleneksel olarak, insan serumunda antinükleer antikorlar (ANA) tespiti için kullanılmıştır. Bu antikorların varlığı, sistemik otoimmün romatizmal hastalıklar (SARD) teşhisinde yardımcı olabilir. Bu protokol etkili doğru bu otoantikor saptamak için IIF tekniği gerçekleştirmek için nasıl gösterir.

Özet

ANA testi Romatoloji pozisyon ifadesinin Amerikan Koleji ANA ¹ taranması için altın standart yöntem olarak IIF kullanılmasını öngörmektedir. IIF uzman ellerde mükemmel bir tarama testi olmasına rağmen, işleme ve IIF okuma teknik zorluklar slaytlar - gibi emek yoğun slayt işleme, manuel okuma, deneyimli için ihtiyaç, eğitimli teknoloji ve karanlık oda kullanımı gibi - IIF yöntemi yapmak Modern, otomatik laboratuvarlarının iş akışında sığdırmak zor.

Yüksek kaliteli ANA tarama yönelik ilk ve en önemli adımdır dikkatli slayt işliyor. Bu işlem emek yoğundur ve tam sürecin anlaşılması, yanı sıra, bilgi ve deneyim dikkat gerektirir.

Slide okuma karanlık odalarda floresan mikroskobu ile gerçekleştirilir, ve hücre döngüsünün bağlamında, çeşitli desenler aşina eğitimli teknoloji ile yapılırve interfazın ve bölünen hücrelerin morfolojisi. IIF doğru bu tekniği gerçekleştirmek için adımları anlamak, Sard için ilk satırı tarama aracı olduğunu sağladı önemlidir.

Son zamanlarda, dijital görüntüleme sistemleri IIF slaytların otomatik okunması için geliştirilmiştir. Böyle NOVA Görünüm Otomatik Floresan Mikroskop Bu sistemler, rutin IIF iş akışını hızlandırmak için tasarlanmıştır. NOVA Görünüm böylece yorumundan görüntü toplama ayıran, kuyuların yüksek çözünürlüklü dijital görüntü kazanır ve depolar; görüntüler yüksek çözünürlüklü bilgisayar monitörleri yorumlanır bir görülüyor. Bu ileride görüntüleri depolayan ve görüntülerde floresan ışık yoğunluğu verileri sağlayarak operatörün yorumu desteklemektedir. Ayrıca ön olumlu ya da olumsuz olarak sonuçları sınıflandırır ve pozitif örnekler için örüntü tanıma sağlar. Özetle, bu karanlık oda için ihtiyacını ortadan kaldırır, ve otomatikleştirir IIF readi akıcılıkng / yorumlama iş akışı. En önemlisi, okuyucular ve okuma arasındaki tutarlılığını artırır. Ayrıca, barkodlu slaytlar kullanımı ile, transkripsiyon hataları örnek izlenebilirlik ve pozitif hasta kimlik sağlayarak ortadan kalkar. Bu artan hasta veri bütünlüğü ve güvenliği ile sonuçlanır.

Bu videonun genel amacı slayt işleme, ortak IIF desen belirlenmesi ve bu tekniği basitleştirmek ve uyumlaştırmak için yeni gelişmeler getirilmesi de dahil olmak üzere, IIF prosedürü göstermektir.

Giriş

Terimi, antinükleer antikor (ANA) DNA, proteinler ve Ribonucleoproteins ^{1, 2} de dahil olmak üzere hücre çekirdeklerinin bileşenleri ile reaksiyona giren antikorların bir türü tarif etmektedir. HEp-2 hücre, antijenler yüzlerce bir yerli protein dizisi, ana ¹ tespiti için ideal bir alt-tabaka üretmektedir. Insan serumunda ANA tespiti bağ dokusu hastalıkları için önemli bir tarama aracı ve IIF ANA ¹ test için referans yöntemdir. Son zamanlarda, HEp-2 hücreleri üzerinde IIF antijene özgü bağışıklık ve çok katlı yöntemleri ile bazı laboratuarlarda değiştirilmiştir. Nedeniyle yanlış negatif sonuçların kaygıları ve klinisyenler için şeffaflık eksikliği, Amerikan Romatoloji Koleji HEp-2 hücreleri kullanılarak IIF ANA ¹ tarama için "altın standart" olması gerektiği sonucuna bir Görev Gücü oluşturdu.

Due ANA taraması öznel doğası gereği, HEp-2 hücrelerinin kalitesi olansonuçlarının doğru ve güvenli raporlama sürmek entegre. Mitotik hücre sayısının yüksek olması, optimal hücre morfolojisi, yeterli confluency ve ilgili antijenlerin ekspresyonu özellikle önemlidir. IIF örüntü tanıma hasta tanısında yardımcı olmak için önemli bir araç olarak hizmet vermektedir. Çeşitli desen önemini anlama klinisyenlerin ve laboratuvar personeli tanıyı doğrulamak için uygun takip test gerçekleştirmenizi sağlar. Örneğin, homojen ANA model, anti-dsDNA antikorlarının veya kromatin varlığında ortaya çıkabilir, ve sistemik lupus eritematoz (SLE) ³ ile ilişkili olabilir. Diğer taraftan, son zamanlarda yaygın, rutin numune kadar% 12 görülür sözde yoğun ince benekli desen (DFS), daha çok anti-DFS70 antikorları ile ilişkili olduğu tarif edilmiştir. Bu antikorlar, (başka bir hastalığa özgü ANA) olmadan ayrı olarak bulunan zaman sistemik otoimmün romatizmal hastalıklar ile ilişkili değildir <> 4-9 sup. Anti-DFS70 antikorları için böylece doğrulayıcı testler, gereksiz refleks testini azaltmak önemli maliyet tasarrufu sunuyor ve hasta anksiyete azaltabilir.

IIF otoantikor saptamak için ilk satırı tarama yöntemi olduğu göz önüne alındığında, bu kullanıcı reaktifler ve doku substratların seçim sonuçlarını nasıl etkilediğini anlaması önemlidir. IIF teknik doğal olarak kişisel olduğu için, kullanılan reaktif maddeler en kaliteli sonuçlar sağlamak önemlidir.

Bu video protokolü bu hedefi IIF yöntemi, ANA ile ilişkili ortak desenleri gerçekleştirmek için gereken doğru adımları ile kullanıcıya tanıtmak, ve laboratuvar iş akışını düzene ve sonuçlarını standardize edebilirsiniz yeni gelişmeleri tanıtmaktır.

Protokol

1.. Hazırlama ve Yüzey seçkisini

1. Ambalajından reaktifler çıkarın ve her bir madde, oda sıcaklığına gelmesine izin. Reaktifler hazırlayın ve yön insert göre hasta serumları sulandırmak. Not: NOVA Lite slaytlar barkodlu ve kolayca Laboratuvar Bilgi Sistemi LIS ile birlikte otomatik sistemlere entegre edilebilir. Bu işlem manuel slayt işleme göstermektedir; yüksek verimlilik laboratuvarları, ancak, otomatik slayt işleme ekipmanı için tercih edebilir.

Kontrolleri ve Numune 2. Eklenmesi

1. Pozitif kontrol ve uygun slayt oyuklara, negatif kontrol, 1 damla 1 damla dağıtın. Kalan gözlere seyreltilmiş hasta serumu Pipet 20-25 ul. Her seferinde bir slayt işleyin.
2. Alt nemli bir kağıt havlu ile bir boyama kapta slayt (ler) yerleştirin. Kapak kap ve 30 dakika için slayt (ler) inkübe edilir. Not: nemli koşullar olacakkurumasını tabakayı önlemek. Kuyuların Kurutma suni boyanması neden olabilir. Bu kuluçka süresi boyunca, hastanın serumunda anti-nükleer antikorlar da her biri üzerine sabit hücrelerin antijene bağlanacaktır.
3. Kuluçka döneminden sonra, yıkama tamponu hafif bir akışı kullanarak serum durulayın. Alt-tabakanın zarar görmesini önlemek ve çukurlar arasındaki örneklerin çapraz açısı, slayt önlemek amacıyla hafifçe kuyu üzerine doğrudan akımının yönlendirilmesi önlemek için. Aşırı yıkama tampon kapalı dokunun ve yaklaşık 5 dakika boyunca yıkama tamponu içeren bir Coplin kavanoza slayt yerleştirin.

Floresan Konjugatının 3. Ilavesi

1. Tek tek, yıkama tamponu gelen slaytları çıkarın ve yavaşça aşırı yıkama tampon kaldırmak için dokunun. Her bir üzerine (FITC anti-insan IgG etiketli) floresan konjügatın 1 damla uygulanır. Nemli bir kap içinde 30 dakika boyunca kuluçkaya bırakın ve boyama yerine edinizkonteyner kapağı. Not: ANA testi için, bir IgG Fc özel konjugatının kullanılması tavsiye edilir. Eşlenik duyarlı ışık ve kapak nemlendirilmiş bir ortam sağlamaya ek olarak ışığa maruz slaytları koruyacaktır. Bu kuluçka süresi boyunca, konjügat hücre antijenlerine bağlanmış olan hastanın anti-nükleer antikorlara bağlanan olacaktır. Bu birleşim kuyularda floresan mevcudiyetinde sonuçları bağlayıcı.
2. Durulama ve yukarıda tarif edildiği gibi slayt yıkayın.
3. Bir kağıt havlu üzerinde bir lamel ile lamel alt kenarına bir sürekli çizgi ile montaj ortamı uygulanır.
4. Yıkama tamponu her slaytı kaldırmak ve aşırı yıkama tamponu çıkarmak için hafifçe slayt dokunun. Lamel kenarına slayt alt kenarına dokunun.
5. Yavaşça lamel montaj ortam hava kabarcığı oluşmadan sürgünün üst kenarına akar bir şekilde lamel üzerine kayan alt. Not: Eş, montaj orta en uygun miktarda kullanılarak da dahil olmak üzere, verslipping mükemmel pratik ister bir tekniktir.

Pozitif ve Negatif Sonuçları 4. Tanıtımı

Manuel Yorumlama

1. Görünüm karanlık bir odada bulunan bir floresan mikroskop ile slaytlar. Hücre dağılımı ve floresan tekdüzelik değerlendirmek için bir 20X ya da 25X objektif ile tüm kuyunun tarama yapın
2. Pozitifliği ve desen ilişkin nihai yorumunu yapmak için bir 40X amacı geçin.
3. Pozitif ve negatif kontroller de bakın. 1 + 4 + 'dan bir tepkime skalaya Sınıf pozitifliği. Not: Negatif kontrol tamamen karanlık görünmeyebilir, ancak genellikle düşük düzeyde spesifik olmayan floresan gösterecektir. Pozitif kontrol çekirdekte elma parlak yeşil floresan (Şekil 1) gösterir.

Otomatik Yorumlama

Not: Bununla damanuel yorumlanması, yük ve NOVA Görünüm Otomatik floresan mikroskop veya diğer otomatik dijital görüntüleme aracı ile tarama slaytlar için; hiçbir karanlık oda gereklidir. Uygun slayt türünü seçerek bir proje oluşturduktan sonra, enstrüman her iyi hücrelerin yüksek çözünürlüklü dijital görüntü kazanır ve saklar. Ayrıca NOVA Görünüm floresan ışık yoğunluğunu ölçer ve pozitif veya negatif olarak sonuçlarını sınıflandırır ve pozitif örnekler için örüntü tanıma sağlar. Görüntüler NOVA Görünüm sonucunun nihai yorumlanması, revizyon ve onay için izin veren, yüksek çözünürlüklü bir bilgisayar monitörü üzerinde operatör tarafından izlendi. Raporlar doğruladı sonuçlar elde edilebilir. Bu sonuçların yorumlanması yardımcı olmak için tasarlanmıştır gibi dijital mikroskopi deneyimli bir laboratuar teknisyeni ile birlikte kullanılmalıdır.

Sonuçlar

HEp-2 için hücre boyama sonuçları değerlendirirken, beş büyük nükleer desenler en sık bildirilen şunlardır: homojen, benekli, sentromer, nükleoler ve nükleer noktalar. Bu modeller otoantikor çekirdeğin bileşenlerinin özel bağlanma sonucudur. ANA test nükleer yapılara özel olmakla birlikte, sitoplazmik yapılara karşı otoantikorlar ile ilişkili sitoplazmik desen de gözlenebilir. Bazı durumlarda, çeşitli antikorlar bir numune içinde mevcut olabilir, ve görüntü karışık bir desen olarak görünebilir.

, Daha az sık görülen ve IIF yöntemi ile tespit edilebilir, genellikle, hücre devre özel desenler vardır; En son olarak, özel bir klinik öneme sahip bir sözde ince yoğun bir model benekli ANA pozitif serumun 'de tarif edilmiştir.

Homojen Desen

Homojen bir model belirlemek, kuyu tarama ve mitotik veya bölünmesini belirlemekhücreleri. Mitotik hücre yoğunlaşmış kromatin (Şekil 2, Turuncu ok) çoğu zaman homojen bir desen, dinlenme hücreler sergi tekdüze, tüm çekirdeğin yaygın floresans (Şekil nuclei.In dinlenme hücreye göre daha belirgin bir katı, düzgün floresan sergileyen 2, beyaz ok). Bu özellik, model, genellikle, anti-dsDNA antikorlarının ¹⁰ sonucudur.

Benekli Desen

Kaba benekli deseninde, mitotik hücreler yoğunlaştırılmış kromozom bölgelerinin herhangi bir boyama (Şekil 3, portakal ok) gösterir. Dinlenme hücreler tüm çekirdeği boyunca granül floresan gösterirler. Nükleer speckling kaba veya ince olarak tanımlanabilir. Kaba speckling model, genellikle anti-Sm ve anti-RNP ¹¹ sonucudur.

Ince benekli desen olarak, istirahat hücreler tipik üniforma d, çekirdekleri boyunca ince veya yaygın speckling göstermekistribution (Şekil 4, beyaz ok). İnce benekli model, genellikle anti-SSAand anti-SSB ¹² sonucudur.

Yoğun Güzel Benekli Desen

Şimdi yoğun ince benekli desen (DFS) rutin test yaygın olduğunu kabul ve numunelerin kadar 12 kadar% anti-DFS70 otoantikorlar için olumlu olmasıdır. Ancak, izolasyon bulunan bu otoantikorlar, sistemik otoimmün romatizmal hastalıklar ^{4 -6} ile ilişkili değildir. Bu antikorlar sağlıklı bireyler ve Sard ⁶ ilgisiz hastalıkları taşıyan hastalarda yaygındır. Anti-DFS70 antikorlar için doğrulayıcı testler, gereksiz refleks testini azaltmak önemli maliyet tasarrufu sunuyor ve hasta anksiyete azaltabilir.

DFS desen belirlemek ve ANA pozitifliği hastalar hem de hekimler için kaygı neden olabilir zor olduğundan, son derece tanımladı sonra bir doğrulayıcı test yapılması tavsiye edilir ANA klinik önemini açıklığa kavuşturmak için, anti-DFS70 antikorlarının düşündüren bir model fying ^5,6 positivty.

Hücre çekirdekleri (Şekil 5, beyaz ok) çekirdeğin boyunca sergi eşit dağılmış ince benekler istirahat ederken bu desende, mitotik hücreler (Şekil 5, turuncu ok), metafaz kromatin pozitif benekli boyanma gösterir.

Centromere Desen

, Sentromer desen tespit kuyuları tarama ve mitotik veya bölünen hücreleri belirlemek için. Mitotik hücreler (Şekil 6, turuncu ok), bu ayrık benekler yakından genellikle "metafaz çubuğu" olarak tarif ne ilişkili olur. Sentromer desen olarak, istirahat hücreleri (Şekil 6, beyaz ok) çekirdeklerinde boyunca dağıtılan yaklaşık 40-60 ayrı benekler göstermektedir. Sentromer model anti-CENP A sonucudur, B, C ^13, antikor.

adım "> Nükleolar Desen

Diğer nucleolear desen kromozomlarla ilgili bölgenin boyanma ekran iken nucleolar desenler mitotik hücrelerde yaygın sitoplazmik lekeleme (Şekil 7, turuncu ok) ve negatif kromozom bölgesi ile ilişkilidir. Nucleolar model zayıf benekli veya çekirdek plazması homojen boyama ile birlikte, nukleoli homojen veya benekli lekeleme (Şekil 7, beyaz ok) ile ilişkilidir. Bu modeller, anti-RNA polimeraz III ile ilişkili olan, anti-fibrillarin, anti-Th/To ve anti-PM/Scl ^14,15 antikor.

Nükleer Dot Pattern

Nükleer nokta deseni negatif metafaz mitotik hücreleri (Şekil 8, portakal ok) ve dinlenme hücre çekirdeğinde birkaç ayrı benekler (Şekil 8, beyaz ok) ile ilişkilidir. Bu özellik genellikle model sp-100, PML veya p80 Colin otoantikorlann sonucudur. Bu antikorlar gibidir primer biliyer siroz ve otoimmün hepatit ¹⁶ den ayıran.

. Şekil 1. Negatif kontrol (sol): Hücreler non-spesifik floresan düzeyi düşük, ancak spesifik nükleer boyanma görüntülemek Pozitif kontrol (sağ):. Hücreler yeşil elma nükleer floresan görüntüler.

Şekil 2.. Homojen desen. Mitoz hücreleri (orangearrow) katı floresan göstermektedir. Dinlenme hücreleri bile, diffüz boyanma (whitearrow) gösterebilir.

"Width =" 500 "/>
Şekil 3.. Iri benekli desen. Mitoz hücreleri (Turuncu ok) negatif boyanma gösterir. Dinlenme hücreler ayrı bir benekli leke (beyaz ok) göstermektedir.

Şekil 4. Güzel benekli desen. Mitoz hücreleri (Turuncu ok) negatif boyanma gösterir. Dinlenme hücreler ayrı bir ince benekli boyanma (beyaz ok) göstermektedir.

Şekil 5. Yoğun ince benekli desen. Mitoz hücreleri (Turuncu ok) ince taneli katı boyanma gösterir. İstirahat hücreleri (whitearrow) çok ince, yaygın benekli leke gösteriyor.

Şekil 6.. Centromere desen. Mitoz hücreleri (orangearrow) gösterisi üniforma, ayrık benekler. Hücreler (whitearrow) istirahat hücre çekirdeği 40-60 ayrık benekler gösterir.

Şekil 7. Nükleolar desen. Mitotik hücreler (orangearrow) granüler boyanma büyük kümeler olarak görünür. Çekirdekçiklerindeki dinlenme hücre nucleishows floresan (whitearrow).

Şekil 8.. Nükleer nokta desen. Mitoz hücreleri (orangearrow) negatif görünür. İstirahat hücreleri birkaç Discr göstermektedirnükleus (whitearrow) olarak ete benekleri. Ayrıca, nucelar nokta desen mitokondriyal antijenlerin (kırmızı ok) otoantikorlar ile ilişkili sitoplazmik boyanma ile bir arada bulunabilir.

Tartışmalar

Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the “gold standard” for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.

To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns.

In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells.

Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate)	INOVA Diagnostics	708102
NOVA View Instrument	INOVA Diagnostics	NV2000
QUANTA Link Workstation	INOVA Diagnostics	LINK010
QUANTA Link Workstation License	INOVA Diagnostics	LINK001
Barcode Scanner	INOVA Diagnostics	LINK019