RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

Özet

Virüs çoğaltma ölçmek için in vitro deneylerinde önemli ölçüde lusiferaz veya biyolüminesans edebilen diğer enzimleri ifade eden rekombinant RNA virüslerinin geliştirilmesi yolu ile iyileştirilmiştir. Burada ayrıntılı kızamık ve kimyasal kütüphanelerden geniş spektrumlu antiviral izole etmek Chikungunya virüsler, rekombinant suşlar birleştiren bir yüksek verimli tarama hattını.

Özet

RNA virüsleri gibi grip, bronşit, dang, Hepatit C ya da kızamık gibi önemli insan hastalıkları sorumludur. Ayrıca, çünkü daha doğal ekosistemlerin nüfuz artan dünya çapında değişim ve insan nüfusu yükselen bir tehdit oluşturuyor. Böyle yükselen bir duruma iyi bir örnek Hint Okyanusu'nda 2005-2006 arasında chikungunya virüsü salgın olduğunu. Viral replikasyonu kontrol hücresel yolların anlayışımızda son gelişmeler konakçı hücre fonksiyonlarını hedefleme bileşikleri, daha doğrusu virüsün kendisinden daha, RNA virüsleri büyük bir panel inhibe olabileceğini düşündürmektedir. Bazı geniş spektrumlu antiviral bileşikler, ana hedef odaklı deneyleri ile tespit edilmiştir. Ancak, hücre kültürlerinde viral replikasyonun inhibisyonunu ölçen bir gösterge olarak sitopatik etkileri azaltma kullanarak yine çok önemli bir tarama stratejisi temsil eder. Bu gibi fonksiyonel ekranlar çok raportör ifade eden rekombinant virüslerin geliştirilmesi yolu ile iyileştirilmiştir ca enzimlerilüsiferaz gibi bio-ışıldamanın palpe edilebilir. Bu raporda, ayrıntılı bir geniş spektrumlu anti-viral profili olan bileşikleri tespit etmek, yeniden birleştirici kızamık ve hücre canlılığı deneyleri ile Chikungunya virüs birleştiren bir yüksek verimli tarama boru hattı.

Giriş

RNA virüsleri, insan enfeksiyonlarına çok çeşitli sorumludur, hem halk sağlığı ve ekonomik maliyet açısından dünya nüfusu üzerinde büyük bir etkisi var. Etkin aşıların pek çok insan RNA virüslerine karşı geliştirilmiş ve yaygın olarak profilaktik tedavi olarak kullanılır. Ancak, RNA virüs enfeksiyonlarına karşı tedavi edici ilaçların önemli bir eksikliği var. Gerçekten de, verimli bir aşı, dang virüsü, Hepatit C virüsü ya da insan solunum sinsisyal virüsü (hRSV) gibi büyük, insan patojenlerine karşı mevcut değildir. Ayrıca, RNA virüsleri, çünkü küresel değişim ve ekolojik sistemler üzerindeki insan etkisi sıklığı arttı ortaya çıkan hastalıkların bir çoğunluğu sorumludur. RNA virüsleri temsil Bu tehdide karşı, bizim terapötik arsenal son derece sınırlı ve ^1-3 nispeten verimsizdir. Mevcut tedaviler esas itibariyle, doğuştan bağışıklığı uyarmak için rekombinant tip I interferonlar (IFN-α / β) dayanmaktadırya da ribavirin yönetimi. Bu ribonükleosit analog etkime şekli tartışmalıdır ve muhtemelen çeşitli mekanizmalar kullanır, ancak, hücre içi GTP havuzları tüketen hücresel İMPDH (inosin monofosfat dehidrogenaz) inhibisyonu, ⁴ açıkça gereklidir. Ribavirin, pegile edilmiş IFN-α ile birlikte, Hepatit C virüsüne karşı ana tedavidir. De etkin bir şekilde küt IFN-α / β ⁵ hastalık oluşturma faktörleri sentezlenmesi yoluyla sinyal ve genellikle ribavirin ³ kaçış Ancak, IFN-α / β ve ribavirin tedavileri en RNA virüslerine karşı in vivo koşullarında nispeten zayıf bir etkiye sahiptir. Son zamanlarda tartışmalı yararları ^6, ağır hRSV hastalığa karşı kabul edildi, ancak bu, önemli bir tedavi ribavirin toksisite sorunlar yaratmaktadır gerçeğine ilave edildi. Daha yakın zamanda, bir virüs özel tedaviler geliştirme o ile influenza virüsüne karşı, özellikle de pazarlanmıştırf nöraminidaz inhibitörleri ^3. Ancak, büyük çeşitlilik ve RNA virüslerinin sürekli ortaya çıkması nispeten yakın bir gelecekte bunların her birine karşı özel tedavilerin gelişimini engellemektedir. Toplamda, bu yakın gelecekte güçlü antiviral molekülleri tanımlamak ve geliştirmek için etkili stratejiler için gereğini vurguluyor.

Bu RNA virüslerinin büyük bir paneline karşı aktif, geniş spektrumlu inhibitörü, bu sorunu çözmek olacağını söylemek saçmadır. Böyle bir molekül hala Virolog rüyası olmasına rağmen, hücresel savunma mekanizmaları ve doğuştan gelen bağışıklık sistemi bizim daha iyi anlaşılması bazı olasılıklar ^7,8 var olduğunu göstermektedir. Çeşitli akademik ve endüstriyel laboratuarlar şimdi hücresel savunma mekanizmaları veya viral replikasyon künt metabolik yolların belirli yönlerini uyaran moleküller arıyorlar. Bu tür bileşikler, muhtemelen önemli yan etkiler gösterir, ancak akut viral enfeksiyonlara karşı işlemleri yapmak olacakuzun vadede bazı potansiyel toksisitesi rağmen onları kabul edilebilir hale, nispeten kısa bir süre için ed. Çeşitli stratejiler gibi geniş spektrumlu bir anti-viral molekülleri tanımlamak için geliştirilmiştir. Bazı araştırma programları belirli savunma veya metabolik yolları hedef molekülleri bulmayı hedefliyoruz. Bunlar arasında, örneğin, anti-viral gen ekspresyonu ⁹ ortaya çıkarmak ve bu RNaseL ^10, virüs bozulma ¹¹ desteklemek için autophagy makineleri gibi antiviral faktörleri aktif hale getirmek için bir patojen tanıma reseptörleri, nükleosid sentezi, virüs ile enfekte olmuş hücrelerin ölümünü çökeltmek için ^12,13 veya apoptotik kaskadlar yolaklar ^14. Diğer gruplar ^13,15-17 hedef bazlı olmayan fenotipik ekranlar geliştirdik. Bu durumda, anti-viral moleküller sadece belirli bir hücresel sistemde viral replikasyonu bloke etme kapasitesi ile tanımlanır. Genel varsayım 2-3 olmayan RNA virüslerini inhibe eden bir bileşiği, bir geniş-sp için uygun bir profile sahip olduğunu ifade ettiantiviral molekülü ectrum. Bu tür bir yaklaşım ile seçilen ampirik hit bileşiklerin etki modu yalnızca ikinci kez tespit edilir ve sonunda, antiviraller için yeni hücre hedeflerin tanımlanmasına yol açabilir. İlginçtir, 1999 ve 2008 yılları arasında ABD Gıda ve İlaç İdaresi tarafından onaylanan yeni ilaçların bir retrospektif analizi genel olarak, bu tür fenotipik gösterimleri birinci sınıfında küçük moleküllü ilaçlar ¹⁸ keşfetmek için hedef odaklı yaklaşımlar daha iyi performans eğiliminde olduğunu göstermiştir .

, Yüksek yayılmalı hücre bazlı deneylerde Viral replikasyonu çoğunlukla virüs sitopatik etkiler belirlenir. Hücreler, enfekte edilmiş ve 96 içinde kültürlenir - ya da test edilen bileşiklerin mevcudiyetinde 384 oyuklu plakalar. Birkaç gün sonra, hücre katmanları sabittir ve bu kristal mor gibi boyalarla boyanmıştır. Son olarak, absorbans, bir plaka okuyucu ve viral replikasyonu inhibe edici bileşikleri, ileri hücre katmanları korumak için kapasiteleri ile tanımlanır belirlenirm virüs kaynaklı sitopatik etkiler. Seçenek olarak ise, viral kaynaklı sitopatik etkileri, MTS azaltılması gibi standart canlılığı tahliller kullanılarak değerlendirilir. Bu tür deneyler son derece uysal ve maliyet-etkili, ancak üç büyük sınırlamalar muzdarip. İlk olarak, böylece ^19, alternatif yaklaşımlar çağrısında, viral replikasyonu sadece birkaç gün sitopatik, ancak bu her zaman mümkün değildir, bir virüs-hücre kombinasyonunu gerektirir. İkincisi, onlar viral replikasyon dolaylı ölçümüne dayalı olduğundan kötü nicel vardır. Son olarak, toksik bileşikler, pozitif sonuç olarak atılır ve bu nedenle hücre canlılığını ölçen bir sayaç ekranı olan giderilmelidir. Bu engel bazılarının üstesinden gelmek için, yeniden birleştirici virüs veya replikonlar ek transkripsiyon biriminden ya da viral protein gen (birkaç örnek ^20-23 olan) ile aynı çerçevede, bu tür EGFP veya lusiferaz gibi haberci proteinleri ifade etmek için ters genetik mühendislik edilmiştir. Bu virüsleri çoğalmak, muhabir proteins viral proteinler kendileri ile birlikte üretilmektedir. Bu viral replikasyonu ölçmek ve Aday moleküllerin inhibitör aktivitesini değerlendirmek için, çok nicel analizi sağlar. Bu, raportör sistem, yüksek hassasiyet ve hemen hemen hiç arka plan ile bir geniş dinamik aralık sergiler Başlangıcı lusiferaz (ya da bio-ışıldamanın sahip başka enzimler) ifade eden rekombinant virüs için geçerlidir. Bundan başka, herhangi bir uyarı ışığı kaynağı, bileşik floresan ²⁴ ile girişimi önleyen vardır.

Burada ayrıntılı bir yüksek verimli bir protokol RNA virüslerinin geniş spektrumlu inhibitörleri için kimyasal kütüphanelerinin taranması için. Bileşikler, ateş böceği luciferase ²⁵ (rMV2/Luc, Şekil 1, bir primer eleme) eksprese eden bir rekombinant kızamık virüsü (MV) ile enfekte edilmiş insan hücreleri üzerindeki ilk test edilmiştir. PD Mononegaviraller sınıfı, ve genellikle, negatif dallı RNA virüsü bir prototip üyesi olarak kabul edilires. Bu nedenle, MV genom viral proteinler için kodlayan mRNA moleküllerinin sentezlenmesi için viral polimeraz ile bir şablon olarak kullanılır. RMV2/Luc olarak adlandırılan, rekombinant MV suşu olarak, lüsiferaz ifadesi P ve M gen (Şekil 2A) arasında herhangi bir ek transkripsiyon biriminden ifade edilir. Buna paralel olarak, bileşikler, ATP miktarının ölçülmesi ile, değerlendiren bir ticari lusiferaz bazlı bir reaktif kullanılarak, insan hücreleri üzerindeki toksisite için test edilir, kültür içinde metabolik olarak aktif hücrelerin sayısı (Şekil 1, birinci ekranı). Bütün kimyasal kütüphaneler kolayca toksik olmayan ve etkili bir şekilde bloke eden bileşikler PD çoğaltma seçmek için bu iki deneyleri ile taranabilir. Daha sonra, bulgular, Chikungunya virüsü (CHIKV) çoğaltma (Şekil 1, ikinci ekranı) bozduğu kapasiteleri için doz-yanıt PD replikasyonun inhibisyonu, toksisite eksikliği yanı sıra için yeniden test edilir. CHIKV Togaviridae ailesinin bir üyesidir ve genom apOsitive tek iplikli RNA molekülü. Bu nedenle, kızamık ve OG ve CHIKV hem RNA virüslerinin büyük bir paneli engellemek için büyük bir şansı önleyici bileşiklerin tamamen ilgisiz olduğunu. Yapısal proteinler, transkripsiyon ve bir alt genomik mRNA molekülü tarafından kodlanan çeviri oysa CHIKV yapısal olmayan proteinleri, doğrudan viral genomundan çevrilir. CHIKV yönelik in vitro deney çoğaltma NSP3 ve NSP4 dizileri ²⁶ (Şekil 2B) arasındaki raportör geninin bir sokma yoluyla yapısal olmayan poliproteinin bir parçası olarak yarılmış Renilla lusiferaz enzimi ifade CHIKV / Ren adı verilen bir rekombinant soyu dayanmaktadır. Renilla lusiferaz etkinliğinin ölçüsü CHIKV yaşam döngüsünün erken aşamasında viral replikasyonun izlenmesine olanak sağlar.

Bu yüksek hızlı verimlilik protokol 10000 Molec ticari bir kütüphanede geniş spektrumlu antiviraller için uygun bir profili olan bileşiklerin belirlenmesi için kullanılmıştırModüller kimyasal çeşitliliği için zenginleştirilmiş. Bileşikler, esas olarak 250 ila 600 daltona kadar değişen molekül ağırlıkları olan, beş Lipinski kuralı ardından, 5 'in altında ve D değerleri log edilmiştir., Bu moleküllerin pek çoğu, diğer ticari kütüphanelerde mevcut olmayan yeni bir kimyasal maddeler edildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bileşikler ile 96 oyuklu kızı Plakaların 1. Hazırlanması

1. Oda sıcaklığına kadar -20 ° C DMSO kimyasal bileşiklerin 10 mM stok çözeltileri ihtiva eden 96 oyuklu plakalar ana hareket ettirin. Seyreltik bileşikler, 2 mM'de orta 96 oyuklu plakalar seyreltme elde etmek üzere DMSO içinde 5 kat. Seyreltme DMSO içinde 20 ul içine 5 ul pipetleme ve karıştırılarak elde edilir.
2. Pipet beyaz, bar kodlu doku kültürü, 96 oyuklu plakaların kuru kuyu içine seyreltme plakalarından 1 ul. Kız plakalar (D1) bu ilk set 20 uM nihai konsantrasyonda bileşiklerin toksisitesini değerlendirmek için kullanılacaktır. -20 ° C'de kullanıma kadar saklayın kızı plakalar.
3. DMSO ve karıştırma 36 ul halinde seyreltme plakalarından 4 ul pipetleme ile yeniden bileşikleri 1:10 seyreltin. Beyaz, düz dipli, bar kodlu doku kültürü 96-kuyu tabak kuru kuyu içine Pipet 1 ul. Kız plakalar (D2) bu ikinci grubu PD replicatio inhibisyonunu değerlendirmek için kullanılacaktır2 uM nihai konsantrasyonda bileşiklerle n. -20 ° C'de kullanıma kadar saklayın kızı plakalar.

2.. Hücre Kültürlerinin Hazırlanması Bileşik toksisitesini belirlemek için

1. 37 ° C'de HEK-293T hücrelerin büyümesine ve% 5 _CO2 Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde stabilize L-glutamin ve% 10 fetal buzağı serumu (FCS), streptomisin (100 ug / ml) ve penisilin (100 ile IU / ml). Hücreler, her 4-5 gün tripsinizasyon ile geçişli ve yeni bir şişe içine 1:10 seyreltilir. Hücreler, deney için log fazında olmalıdır.
2. Deney gününde, hücreler tripsinizasyon ile geri ve hücre sayımı gerçekleştirin. Pelet santrifüj ile hücreler ve kültür ortamı içinde 3 x 10 ⁵ hücre / ml 'de tekrar süspansiyon bunları. Hücre süspansiyonu 12.5 ml, her tarama plakası için gerekli olduğunu göz önünde bulundurun.
3. Transfer oluğuna hücreleri ve kirpi kimyasal alçı ihtiva eden D1 plakalar içinde hücre süspansiyonu 100 ul dağıtmakunds. Oluk içinde hücre süspansiyonu düzenli tortulaşmayı önlemek için karıştırılır.
4. 1 ul DMSO ile kontrol kuyuları A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 ve G12 başak. Karşılık gelen kuyu canlı hücreler için bir referans (toksisite) olarak kullanılacaktır. Kontrol kuyuları B1 başak, D1, F1, H1, 1 ul DMSO ve hücreleri öldürmek için bir 0.5% IGEPAL çözeltisi 2.5 ul B12, D12, F12 ve H12. Karşılık gelen kuyu ölü hücreleri için bir referans (yüksek toksisite) olarak kullanılacaktır.
5. 37 ° C'de 24 saat boyunca inkübe edin ve hücreleri,% 5 _CO2.

RMV2/Luc tarafından enfekte Hücre Kültürleri 3. Hazırlanması

1. Büyüme ve 2.1 ve 2.2 'de açıklandığı gibi hücreleri kurtarmak. Yine, kültür ortamı içinde 3 x 10 ⁵ hücre / ml 'de tekrar süspansiyon hücreleri. Hücre süspansiyonu 12.5 ml, her tarama plakası için gerekli olduğunu göz önünde bulundurun.
2. İsteğe bağlı: 20 ug / ml 'de ek üridin ile kültür ortamı.
   Not: viral replicatio için kimyasal kütüphanelerinin taranması zamann inhibitörleri, bu pirimidin biyosentez yolunun erken aşamaları hedefleme bileşikleri sık sık ^13,16,27,28 izole gibi görünüyor. Kültür ortamına üridinin ilavesi gibi antiviral molekülleri filtrelemek için kullanılır. Gerçekten de, bu etkin bir pirimidin biyosentez yolunun üst enzimler engellenir viral replikasyonu yükler.
3. Enfekte edilmemiş hücreler ile kontrol kuyuları için hücre süspansiyonu 01:10 to ve kalan hacmi ile enfeksiyon geçin.
4. RMV2/Luc stok çözeltinin uygun hacmi çözülme. MV stok solüsyonları ml başına 10 ⁶ -10 ⁸ enfeksiyöz partiküller genellikle. Kültür enfeksiyon (MOI) 0.1 çokluğu karşılık gelen hedef hücre başına rMV2/Luc 0.1 bulaşıcı parçacıklar, ile enfekte olması gerekir. Not: rMV2/Luc PD aşısı (Schwarz suşu) elde edilir ve bir BSL2 ortamda değiştirilebilir.
5. Hücre süspansiyonu virüs ekleyin ve hafifçe karıştırın. Bir çukur enfekte hücreleri aktarın ve 100 dağıtmaksütun 2 çivili kimyasal bileşikleri ihtiva eden D2 plakaları 11 olarak enfekte edilmiş hücre süspansiyonu ul. Oluk içinde hücre süspansiyonu düzenli yavaşça karıştırılır.
6. Sütun 1 ve 12'de, 100 non-enfeksiyonlu hücrelerin ul iyi olarak iki tane dağıtmak. Enfekte hücreler, diğerleri kuyularda dağıtılır.
7. 37 ° C'de 24 saat boyunca inkübe edin ve hücreleri,% 5 _CO2.

4. Lüsiferaz Aktivite Önlemleri ve Veri Analizi

1. Inkübatörden D1 plakaları çıkarın ve doğrudan kültür çukurlarına lusiferaz tabanlı canlılığı maddesi 50 ul eklenmesi ile hücre canlılığı belirler. Karıştırınız ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edilir. Bir lüminometre ile plakaları okuyun. Entegrasyon zamanı kuyunun başına 100 milisaniye olarak belirlenmiştir.
2. Inkübatörden D2 plakaları çıkarın ve doğrudan kültür çukurlarına lusiferaz alt-tabaka, 50 ul ekleyerek lusiferaz aktivitesinin belirlenmesi. Oda sıcaklığında 6 dakika boyunca inkübe edin ve anlatıldığı şekilde bir lüminometre ile plakaları okuYukarıdaki yatak.
3. Ekranın ²⁹ kalitesini garanti etmek için toksisite deneyi her bir D1 bir plaka için Z'-faktörü hesaplanır. Μ + ve σ + yalnız DMSO ile HEK-293T hücreleri için parlaklık ve standart sapmalar (toksisite) vasıtasıyla tekabül - (μ-, Z '= 1-3 * (σ + + σ-) / μ +) ve μ-ve ışık yayılımı ve hücrelerini öldürmek için Igepal işlemden kültür çukurlarına için standart sapma anlamına gelir σ-bulunmaktadır. Z ', 0.5' in yukarısında olması beklenen, veya karşılık gelen plaka atılır.
4. Μ + / 2 toksisite eşiğini ayarlayın. Bu cut-off (Şekil 3A) altında ışıldama değerleri ile bileşikler atın.
5. Antiviral tahlil D2 her bir plaka için Z'-faktörü hesaplanır. Burada, μ + ve σ + yalnız DMSO ile enfekte kültürlenmiş hücreler için parlaklık ve standart sapmaların araçlarına karşılık gelir ve μ-ve enfekte olmayan hücreler için parlaklık ve standart sapmaları araçları σ-bulunmaktadır. Yine, Z & # ile plakaları39; 0,5 altındaki değerler de göz ardı edilir.
6. - / (Μ + - μ-) x 100 = (bileşik X lusiferaz aktivitesi μ +) inhibisyon yüzdesi: aşağıdaki gibi viral replikasyonun inhibisyonunu hesaplayın. % 75 inhibisyon eşik ayarlayın, hem de bu cut-off (Şekil 3B) altında ışıldama değerlerini azaltmak ve 4.4 açıklanan kriterlere göre toksik olmayan bileşikler seçin.

Toksisite ve Geniş spektrumlu Antiviral Aktivite 5. İkincil Ekran

1. Her biri için 1:2 dizi sulandırmalar 500 uM 4 uM (8 seyreltme) başlanarak DMSO içerisinde bileşik isabet olun. Kültür ortamında 50 ul ile beyaz, bar kodlu doku kültürü plakaları doldurun. Kültür kuyularda Her bileşik seyreltmesinin 1 ul ekle. Her hit bileşik için çift seri seyreltileri ile 3 kültür plakaları iki kez tekrarlayın.
2. (Yukarıda tarif edildiği gibi kültür ortamı içerisinde 6 x 10 ⁵ hücre / ml 'de bir HEK-293T hücre süspansiyonu hazırlamak 37.5 ml 2.1 ve 2.2). Falcon tüplerde 2x 12.5 ml dağıtın ve MOI'da rMV2/Luc ile ya hücreleri enfekte = 0.1 ya da MOl'de Renilla lusiferaz (CHIKV / Ren) ifade eden biraraya getiren CHIKV = 0.2. Ters çevirerek karıştırın.
   Not: CHIKV / Ren CHIKV bir vahşi tip suşu elde edilir ve bu nedenle bir BSL3 ortamda temas edilmelidir. Renilla alt-tabaka kültür çukurlarına eklenmiştir sonra levhalar (aşağıya bakınız) BSL1 için BSL3 taşınmış olabilir.
3. Hit bileşiklerinin seri seyreltmeleri içeren kültür plakaları içinde, enfekte olmamış rMV2/Luc-infected veya CHIKV / Ren-enfekte edilmiş hücreler, 50 ul koyun. 37 ° C'de 24 saat inkübe
4. RMV2/Luc-infected kuyularda ateş böceği lusiferaz aktivitesinin belirlenmesi için, ateş böceği lusiferaz alt-tabaka 50 ul ekle. CHIKV / Ren-enfekte kuyuda Renilla lusiferaz aktivitesinin belirlenmesi için Renilla lusiferaz alt-tabaka 50 ul ekle. Son olarak, hücre yaşayabilirliği belirlemek için, enfekte olmamış hücrelere lusiferaz tabanlı canlılığı tahlil maddesi 50 ul ekle.
5. Arsa veri (FiGüre 4) ve% 50 MV ve CHIKV çoğalmasını inhibe vurmak bileşik konsantrasyonları belirler. Bu deneyde bir toksisite gösteren bileşiği göz ardı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu tarama hattı PD çoğalmasını önleyen bileşiklerin seçimi ilk dayanır ve önemli bir hücresel toksisite (Şekil 1, birinci ekranı) göstermezler. Bu, hücre toksisitesi ve viral replikasyonun inhibisyonunu belirlemek üzere lusiferaz bazlı deneylerde yararlanır. Tüm adımlar, pipetleme ve veri toplama bir robot platform ile, bir yüksek verimli bir ortamda gerçekleştirilebilir.

Bileşiklerin hücresel toksisite, metabolik olarak aktif hücrelerin karşılık...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada açıklanan tarama hattı RNA virüslerinin geniş spektrumlu inhibitörleri olarak uygun bir profili olan bileşiklerin seçilmesi amaçlamaktadır. 10000 bileşiklerinin bir kütüphane bu protokol ve belirtilen kriterleri filtreleme uygulanmıştır ile tarandı zaman,% 75, 40 bileşikleri (% 0.4) daha üstün PD replikasyonunun inhibisyonu, yani pozitif attı. Bunun yanı sıra, bunların yaklaşık yarısı lusiferaz tabanlı canlılığı deneyde bir toksisite göstermiştir ve bu nedenle göz ard?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Freedom EVO platform	TECAN		Robotic platform
96-well polystyrene cell culture microplates, white	Greiner Bio One	655083
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	G7570	Luciferase-based viability assay
Bright-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2610	Reagent containing firefly luciferase substrate
Renilla-Glo luciferase Assay System	Promega	E2710	Reagent containing Renilla luciferase substrate
Britelite plus Reporter Gene Assay System	Perkin-Elmer	6016761	Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity.