Üç Boyutlu Kültürler: Meme hücrelerinin malign Dönüşüm vs Normal Asiner Mimari Eğitim için Bir Aracı

Özet

Bir tekrar oluşturulmuş temel membran üzerinde meme epitelyum hücreleri üç boyutlu kültür iyi huylu meme in vivo mimari özetlemek için, iyi huylu göğüs ve fenotipten malin fenotipi ayırt etmek için yararlı bir yöntemdir. Önemli olarak, bu sistem, diğer dokularda invaziv karsinomları incelemek için uygulanabilir.

Özet

Invaziv meme karsinom metastaz komşu doku ve eğilimi işgali ile karakterize malign epitelyal tümörlerin bir grubuz. Kanser hücreleri ve bunların mikro arasındaki sinyallerin etkileşimi meme kanseri büyüme ve biyolojik davranışı ¹ üzerinde güçlü bir etkiye sahip. Ancak, hücre dışı matrisin bu sinyallerin çoğu kaybolur ya da hücreler, bir tek tabaka iki boyutlu kültürü (2B) yetiştirilen onların İlgiye understudied edilir. Son yıllarda, bir tekrar oluşturulmuş temel membran üç boyutlu (3D) bir kültür iyi huylu ve habis meme hücrelerinin doku mimarisi özetlemek için tercih edilen bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. 3D yetiştirilen hücreler, hücre dışı matris arasındaki önemli ipuçları korumak ve fizyolojik olarak uygun ex vivo sistem ^2,3 sağlar. Notun, 2D ⁴ kıyasla 3D yetiştirilen hücreler, farklı davranabilir düşündüren kanıtlar artmaktadır. 3D kültüretkin bir şekilde ³ dahil iyi huylu göğüs fenotipten malin fenotipi ayırt etmek için bir araç olarak ve hücresel ve moleküler sinyal destekleyen için kullanılabilir. Iyi huylu epitelyal hücrelerin ayırt edici özelliklerinden biri, apikal sitoplazma lümenine doğru ve bazal sitoplazma bazal membran üzerinde durmaktadır, böylece de polarize edilmiş olmasıdır. Bu apico-bazal polarite hücresel örgütsüzlük ve gelişigüzel çevreleyen dokudan infiltrasyonlar tübüllerini anastomoz ve dallanma oluşumu ile karakterize edilir invaziv meme kanserleri, kaybolur. Benign bezi ve invaziv karsinoma arasındaki bu histopatolojik farklılıklar 3D ^6,7 çoğaltılabilir. Diğer moleküler ve hücre biyolojisi teknikleri, 3D Kültür ile birlikte hücre çoğalması, polarite ve apoptoz valide moleküler belirteçlerin ifade diferansiyel, tek yuvarlak asiner yapılardan niceliğinin gibi uygun okuma-çıkışları ya da kullanmae daha malign dönüşüm sırasında ve sorumlu sinyalizasyon tasvir için hücresel değişiklikleri anlamak için önemli bir araç sağlayabilir.

Giriş

Yeniden oluşturulmuş bazal zar üzerinde göğüs epitel hücrelerinin kültür üç boyutlu (3D) karmaşık fenotip ve normal meme ve meme kanseri ^2,3 bağlantılı sinyal incelemek için önemli bir model sistem. Memenin fonksiyonel birim içine asinüs hangi dal küçük bir kanal oluşur terminal lobular kanal ünitesi (TDLU) 'dir. Acininin bir bazal membran ⁵ tarafından çevrelenmiş olan iki hücre tabakası, epitelyal ve myoepitelyal hücreler, oluşan yüksek derecede organize yapılar bulunmaktadır. Normal asinüs en ayırt edici özellikleri hücresel kutuplaşma, altta yatan bazal membran bağlanma ve özel hücre-hücre temas vardır. Bu karmaşık örgüt invaziv tümörlerde bozulur. Hücre mono tabakaları olarak yetiştirilen yaygın olarak kullanılan 2 boyutlu kültürler, asinüs oluşumu için izin yoktur. Bu nedenle, tek tabakalı bir kültür epitel hücreleri arasındaki karmaşık ilişkiyi yakalamak için bir sistem temin yoksundurnormal göğüs ve göğüs kanserinde kendi düzensizleşmesine. Meme hücrelerinin fonksiyonel tek tip epitel kültürleri çeşitli laboratuarlar ^2,3 geliştirilmiştir. 3D kültür Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom hücrelerinden türetilen bir çözünebilir ekstresi ve ticari olarak mevcuttur, Matrigel üzerinde göğüs hücrelerinin büyümesini kapsar. Kolajen gibi diğer 3D katmanlarından Ben de kullanılmaktadır. Meme hücreleri hücreleri, Matrigel ² gömülü kültürlenir 3D gömülü deneyi ile 3D kültürlenebilir. Alternatif olarak, hücreler de bu Matrigelin az bir hacim gerektirir, ve faz kontrast görüntüleme ile koloni oluşumunun zaman atlamalı izlenmesini kolaylaştırır ve in situ görüntüleme ² için ideal olduğu gibi maliyetli 3D bindirme deneyi olarak adlandırılan, üst deneyine 3D kültür edilebilir ^-3. En iyi tahlil üzerinde 3D ​​asinar fenotip ve gen ekspresyon profili ⁷ arasındaki ilişkiyi tanımlamak için kullanılmıştır.

3D kültür effectiv edilebilirely invaziv karsinom normal ve iyi huylu hücreleri ayırt etmek için kullanılır. Normal ve iyi huylu meme hücrelerinin invaziv karsinom hücreleri lümen hiçbir temizlenmesi ile üretken ve gelişigüzel büyümeye ise büyüme Matrigel merkezinde iyi tanımlanmış lümen polarize yapılar tutuklandı oluştururlar. E6/E7 insan meme epitelyum hücreleri ve fibrokistik değişiklikleri ile bir 36 yaşındaki hastadan izole edilmiş bir kendiliğinden ölümsüzleştirilmiş hücre hattı, başarılı bir 3D ^3,8 olarak iyi huylu göğüs fenotipi geri almak için kullanılmış olan ve yapmış olduğu MCF10A hücre hattı, ölümsüzleştirilmiş Birkaç moleküllerin ^8,9 onkojenik ve tümör baskılayıcı fonksiyonunu incelemek için bir model sistem. Bu iyi huylu hücre lentivirüs / retrovirüs tanıtımı ile, ilgilenilen gen (ler) işlemek için tasarlanmış olabilir. Ilgi konusu gen (ler), bir tümör bastırıcı ise ilgi konusu genin benign hücrelerde onkogen aşın ise, shRNA aracılık ettiği portatif ise kötü huylu bir dönüşüme yol açacaktırhabis bir fenotipe göstermelidir. Her iki durumda da 3 boyutlu olarak oluşturulmuş akinar yapılar habis dönüşüm yakalayabilir.

3D kaplama huylu tek hücreler küresel yapılar çoğalırlar ve yuvarlak oluşturmaya başlar. Gün 5-8 hücreleri, bu küresel toplam Matrigel ile temas halinde olan hücre çevreleyen bir polarize tabakası ve Matrigel ile temas eksikliği az polarize hücre, bir iç bir kitle halinde ayırt edecektir. Önümüzdeki 10-15 gün içinde iç hücreler apoptosis açık bir lümen oluşturarak ölmeye başlayacak. Malign hücreler gelişigüzel polaritelerini kaybetme büyüyecek. Son derece habis hücreler genellikle yapıları dallanma oluştururlar. Fenotip bu farklılıklar, zaman atlamalı faz kontrast görüntüleme ve yerinde ilgili moleküler belirteçlerin ile immünboyama tarafından yakalanabilir. En sık kullanılan işaretleyiciler çoğalma işaretleyici fosfo histon 3 ile apoptot ile kombinasyon halinde, alfa 6-integrin, bir taban kutup işaretleridiric işaretleyici kaspaz-3 ayrılır. İkincisi asinüs merkezinde, normal ve iyi huylu meme hücrelerinin bir özellik olarak lümen oluşumu olup olmadığını belirlemek için önemlidir. Diğer polarizasyon ve hücre-hücre temas belirteçleri GM130, laminin, şey, E-kadherin içerir. Seçenek olarak, göğüs kanseri hücre çizgileri, ilgi konusu geni işlemek için tasarlanmış olabilir. Tutuklandı daha büyümeye Bu durumda, eski haline dönme olarak iyi huylu fenotip olarak kullanılabilecek bir kanser fenotipi ayırt etmek okunur.

3D kültürü de dikkatle habis dönüşüm ^10-11 katılan sinyalleme yolunu tanımlamak için kullanılabilir. Kullanılarak yukarıda salt çıkışları, farmakolojik inhibitörleri, bloke edici antikorlar veya rekombinant proteinleri söz habis dönüşüme neden olan moleküler sinyali de kesin olarak belirlemek olabilir kullanılabilir. Çeşitli laboratuvarların sürekli çabaları sayesinde RNA izole etmek ve aynı zamanda immunoblotlama ve immünohistokimyası için lizatlarını hazırlamak için 3 boyutlu hücreleri çıkarmak mümkündürnoprecipitation. Bu stratejiler, protokolde bir adım adım ve ayrıntılı bir şekilde tarif edilmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1.. Malzemelerin hazırlanması ve Kültür Medya

1. 4 ° CO / N. de (GFH) Matrigel azaltılmış Çözülme büyüme faktörü
2. 37 ° C'de bir hücre hattı için gereken ortam tam Isınma MCF10A-ATCC ortamı kullanın; HME-Ham'ın F-12 ortamı,% 5 fetal inek serumu, 1 ug / ml hidrokortizon, 5 ug / ml insülin, 10 ng / ml EGF ve 100 ng / ml, kolera toksini ile takviye edilmiş; % 5 FBS, 2 ug / ml hidrokortizon ve 5 ug / ml insülin ile takviye SUM149-Ham'ın F-12 ortamı; ve MDA-MB-231-10% FBS DMEM-
3. Buz üzerinde bir 8-iyi odasının slayt önceden soğutmak.
4. Doku kültürü kaputu ve malzemeleri hazırlayın.

8-iyi Odası Slide 2. Üç Boyutlu Kültür

1. Coat her GFR Matrigel 40 ul 8 oyuklu slayt de. Slayt merkezinde Matrigel ekleyin ve sonra bir P200 pipet kullanarak yayıldı. Kabarcıklar kaçınarak ve yol açabilir overspreading, mümkün olduğunca eşit yaymak için çalışınmenisküs oluşumu.
2. % 5 _CO2 altında 37 ° C 'de kuluçkaya bırakın. Matrigel katılaşan iken, hücreleri trypsinize toplamak ve 4 dakika boyunca doku kültürü santrifüj içinde 150 x dönerler.
3. Hücre sayımı ve ilgili hücre hattının komple ortamı içinde 12,500 hücre / ml olacak şekilde seyreltin. % 2 GFR Matrigel ekleme ve Matrigel önceden kaplanmış slaytı her çukuruna 400 ul ekle.
4. _CO2 inkübatör slaytlar inkübe edin. 15 gün kadar her 4 ^th gün taze eksiksiz bir medya değişiklikleri ver.
5. GFR Matrigel üzerinde büyüyen hücrelerin önleyici çalışmalar sırasında her üç günde bir taze inhibitörleri ile takviye edilmiş ortam değişiklikleri takip kaplama zamanda tam ortam için küçük molekül inhibitörleri eklemek için: farmakolojik inhibitörleri ile tedavi.
6. Saflaştırılmış proteini ile tedavi:
   1. Hücreleri plaka aşağıdaki 2,1-2,3 adımları. Kültürler, serum starvati, ardından 4 gün boyunca büyümeye izin16 saat on.
   2. 5. günde, FBS serum açlık hücrelere ortam ilave% 0.1 'in saflaştırılmış proteinin uygun bir konsantrasyonu ile muamele hücreleri. 2 gün sonra, saflaştırılmış protein ile taze ortam değişikliği verin.
   3. 10. günde tam HME medya ile klimalı ortamı değiştirin. Kültürler, başka bir 5 gün için büyümeye izin verin.
7. Matrigel yetiştirilen asiner yapılardan İmmünofloresan boyama:
   1. % 2 paraformaldehit,% 0.5 Triton X-100 ve 1 x PBS, pH 7.4 içinde 100 mM glisin hazırlayın. % 0.1 sığır serum albümini,% 0.2 triton X-100,% 0.05 Tween-20 ihtiva eden 1x PBS ihtiva immünofloresan tamponu (tampon IF) hazırlayın.
   2. Dikkatli klimalı medya aspire P200 pipet kullanın.
   3. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT),% 2 taze hazırlanmış paraformaldehit ile asinar yapıları tamir.
   4. 4 ° C'de 10 dakika boyunca% 0.5 Triton X-100 ile hücrelerin permeabilize
   5. Kültür yıkayıns üç adet 100 mM glisin, her bir yıkama için 10-15 dk kez.
   6. Oda sıcaklığında 1 saat için birinci blok adı IF tamponu içinde% 10 keçi serumu, ile hücrelerin bloke eder.
   7. 20 ug / ml keçi anti-fare F (ab '), 30 dakika boyunca birinci blok tamponu içinde ₂ fragmanı olan kültürleri inkübe edin. Bu adım, Matrigel 'de immünoreaktif fare IgG türler engellemek için önemlidir.
   8. İkinci bloke çözeltisi içinde birincil antikor ile inkübe 4 ° C 'de (Birincil blok 20 ug / ml keçi anti-fare F (ab') 2 fragmanı) O / N
   9. 10-15 dakika hafifçe çalkalanarak her biri için IF tamponu ile üç kez yıkayın.
   10. 45 dakika boyunca IF tampon maddesi içinde floresan konjuge sekonder antikor ile inkübe edin.
   11. 10 dakika boyunca yıkama 3x hafifçe çalkalanarak IF tampon maddesi ile her biri.
   12. Çekirdekleri görselleştirmek için DAPI içeren anti-solmaya reaktif ile slaytlar monte edin.
   13. Slaytlar, oda sıcaklığında O / N kurumasını bekleyin.
   14. Görüntü elde etme: koloni mi konfokal görüntüler eldeMatrigel üzerinde yetiştirilen hücreler dsection. Daha fazla bilgi için Z istifleme ile asinar yapının tüm uzunluğu boyunca optik bölümleri bir dizi kazanır.

3. İmmunoblotting 2-iyi Odası Slaytlar Üç Boyutlu Kültür

1. Buz üzerinde 2-iyi odasının slayt önceden soğutmak. Adımları 2,1-2,4 Matrigel 160 ul 2-çukurlu oda slayt örneğin kat için reaktifler arttırmak ve hücre / 1.6 ml Matrigel 2 oyuklu sürgünün her oyuğuna ilave edin.
2. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, ticari olarak temin edilebilen 3 boyutlu kültürü hücre hasat etme kiti kullanılarak Matrigel gelen asinar yapıları hasat.
3. 1x ve 4 ° C'ye önceden soğutmak için yıkama, hücre ve hücre hasat tamponlar seyreltin Matrigel Yıkama ve yıkıldığında buz üzerinde yürütülmelidir.
4. Hücre yıkama tamponu kullanılarak 3x asiner yapılar yıkayın.
5. Hücre hasat met kullanılarak 15 ml santrifüj tüplerine asinüsü toplayınffer 4 ° C'de bir sallama düzeneği üzerinde 30 dakika kuluçkalandı ve ardından 1 ml pipet ile iyice süspansiyon karıştırın. Bu küçük parçalar halinde Matrigel kırmak ve hücre hasat tamponu içerisinde hücrelerin en yayınlayacak.
6. Bir kültür santrifüj içinde 200 xg'de hücreleri Pelet. Bir P200 pipet ucu ile hücreleri topak haline hidrojelin yüzen katmanı kaldırın.
7. Kit ile birlikte verilen, SDS numune tamponu içerisinde yeniden süspanse lizatları. RIPA liziz tamponu da kullanılabilir.

Malign vs Benign Meme Fenotipinin 4. Kantitasyonu

1. 2,1-2,4 aşağıdaki adımları, her bir tedavi grubu için üç kopya halinde hücreleri büyütün.
2. 5X veya bir slayt değiştiren ve bir bilgisayara bağlı bir faz kontrast mikroskop kullanılarak 10X çözünürlükte her kuyudan asiner yapılardan faz kontrast görüntüleri çekmek. Başka bir çerçeveden slayt hareket eden ve bu nedenle sürgünün odacıklı tüm kuyu kaplayarak görüntüleri al.
3. Asiner yapılardan toplam sayısını,Tek bir yuvarlak yassı asinüs ve multiacinar yapıların veya organizasyon yoksun gelişigüzel büyüyen yapıların sayısı ve ondan çıkan dallanma süreçleri ile sayısı.
4. Tek yuvarlak yassı asiner yapılardan vs malign yapıların yüzdesi ve sütun grafiği olarak arsa hesaplayın. Student t-testi ile önemini hesaplayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

3D kültür etkili iyi huylu meme insan meme epitel hücre malin fenotipi ayırt etmek için kullanılabilir. Matrigel kaplı tek huylu hücreleri kolayca faz kontrast görüntüleme kullanarak bir düzlemde tek yuvarlak yassı asinüs olarak görüntülü olabilir organize küresel yapılar olarak büyür. Matrigel kaplı bir habis hücrelerin, gelişigüzel büyümesi çok yüksek bir kırılma indeksi göstermektedir ve bir düzlemde görüntüsü zordur. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, yüksek...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada bir tekrar oluşturulmuş temel membran üzerinde göğüs epitel hücrelerinin üç boyutlu kültür ve habis genel iyi huylu göğüs fenotip arasında ayrım yapmak için, bu sistemin yararını tanımlamışlardır. Bu sistem aynı zamanda, diğer glandular dokulardan kültür farklı hücre tipleri için kullanılabilir ve başarılı bir kaç ^12-14 isim, kültür prostat epitel, bronşiyal epitel ve epitel hücrelerine tiroid kullanılmıştır bildirilmiştir. 3D kültür önemi, fizyolojik olar...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth Factor Reduced Matrigel	BD Biosciences	354230	Avoid repeat freeze thaw
Lab-Tek glass hamber slides 8-well	Thermo Fisher Scientific	177402	Precool on ice
Lab-Tek glass chamber slides 2-well	Thermo Fisher Scientific	177380	Precool on ice
Goat anti mouse F(ab´)2 fragment	Jackson Immunoresearch	115-006-006
Normal goat serum	Jackson Immunoresearch	005-000-121
Fluorescent conjugated Alexa antibodies	Molecular Probes		Please look at molecular probes website
Prolong gold antifade reagent with DAPI	Molecular Probes	P36935
3D Culture Cell Harvesting kit	Trevigen	3448-020-k
Anti-Apha-6-integrin	Fisher Scientific	MAB1378	1:100 dilution for IF
Anti-GM130	BD Biosciences	610822	1:100 dilution for IF
Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated	Fisher Scientific	16-222	1:100 dilution for IF
Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)	Cell Signaling	9661s	1:50 dilution for IF
Anti-E-cadherin	BD Biosciences	610181	1:200 dilution for IF