Embriyonik Fare Kalpler Gelişmekte Hücre Etiketleme ve Enjeksiyon

Özet

Biz, (E) 9.5 ve daha sonraki aşamalarında embriyonik gün fare embriyoları olan embriyonik veya pluripotent hücrelerinden elde edilen iç ve aşılanmış hücrelerden hücre kaderine ve fenotipi hem izlenmesi amacıyla, boyalar enjekte DNA vektörleri, virüs, ve hücreler, bir dizi yöntem tarif gelişme.

Özet

In vitro protokol embriyonik veya pluripotent kök hücre-türevlerinin kaderini test edilmesi zorunlu olarak in vivo potansiyel yansıtmaz tartışmalı sonuçlara yol açmıştır. Tercihen, bu hücreler, belirli bir fenotip elde etmek için uygun bir oluşum safhasındaki bir ortamda yerleştirilmelidir. Ayrıca, boya veya retroviral vektörler ile hücrelerin etiketlenmesi sonra fare çalışmaları izleme hücre soyu hala az gelişmiş organları ile erken evre fare embriyoları çoğunlukla sınırlı kalmıştır. Bu sınırlamaları aşmak için, E9.5 ve gelişiminin sonraki aşamalarında fare embriyosunda kalp hedeflenen bölgelerde çeşitli maddeler enjekte etmek, standart ve ultrason aracılı mikroenjeksiyon protokolleri tasarlanmıştır. Embriyonik eksplant ya da embriyolar ya da daha fazla kültürlendi utero geliştirmeye bırakılır. Bu maddeler, fluoresan boyalar, virüs, shRNAs veya hücre-türevi projenitör hücrelerini içerir. Bizim yaklaşımlar fu korunması için izinorganın nction göçünü ve işaretlenmiş ve / veya enjekte edilen hücrelerin kaderini gözlenerek. Bu teknolojiler diğer organlara uzatılabilir ve gelişim biyolojisinde önemli biyolojik soruları için çok yararlı olacaktır.

Giriş

Daha on yıl önce, insan embriyonik kök hücreleri (HuESCs) insan blastosistlerin ¹ elde edilmiştir. O zamandan beri, bu hücreler, insan gelişim biyolojisi karşılanmamış sorular adresleri önemli bir araştırma alanının konusu haline gelmiştir. HuESCs ayrıca rejeneratif tıpta umut sağladı. Son yıllarda, insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) ² genetik hastalık modelleri sağlayan, hastaya özgü somatik hücrelerinden elde edilmiştir. Kalp soy ³ de dahil olmak üzere çeşitli hücre soyları, doğru ya da embriyonik uyarılmış pluripotent kök hücrelerin farklılaşması için in vitro protokol birçok rapor edilmiştir. Farklılaşmış hücreleri genellikle RNA ve protein ifadesi, immun boyama, ve / veya in vitro fonksiyonel testler analizi ile fenotiplenir. Bununla birlikte, pluripotent kök hücresi türevleri tam cel elde olup olmadığını test etmek için uygun bir oluşum safhasındaki bir ortamda yerleştirilmesi gerekirl kendi embriyonik meslektaşı kaderi ve bölgesel uyaranlara yanıt olarak gerçek in vivo fonksiyonu özetlemek ister. Doku mühendisliği umut verici olmasına rağmen, henüz gelişmekte olan embriyonik doku ^4,5 in vivo olarak uygun tüm bilinen ve bilinmeyen ipuçları sağlamaz.

Fare embriyoları içeren embriyolar, boyalar veya retroviral vektörlerle hücre etiketleme, kalp gelişimi ⁶ sırasında hücre soylarının embriyonik kökeni gibi önemli bilgileri getirdi. Örneğin, izole edilmiş kalpler in vitro kültürü ile, ardından ex vivo fare embriyoları, en perikardiyal boşluğu içine enjeksiyon boya, epikardiyal hücreleri ve bunların soyundan ⁷ etiketlemek için kullanıldı. Ancak, boya ve retroviral hücre etiketleme çoğunlukla ⁸ daha kolay erişilebilir hala az gelişmiş organ veya tavuk embriyolar, erken fare embriyoları tatbik edilmiştir. Bir istisna e hedef kolaydır, beyin tarafındanmbryos ^9,10. Böyle bir yaklaşım, henüz dayak embriyonik fare kalp tatbik edilmemiştir.

Boyalar ya da virüs doğrudan etiketleme tamamlayıcı olarak ve daha ileri evre fare embriyo ve yetişkin farelerde izleme soy gerçekleştirmek için, hücre etiketleme yaklaşımı Cre / Lox teknolojisi kullanılarak transgenik farelerin analizi ile kombine edilmiştir. Cre / Lox yaklaşımı ¹¹ ancak rekombinazın ekspresyonunu tahrik etmek için kullanılabilir genomik düzenleyici bölgelerin uzaysal özgüllük ve Cre / Lox rekombinasyon ¹² verim nedeniyle bazı sınırlamalar vardır. Sadece Cre ekspresyonunu tahrik etmek için kullanılan düzenleyici bölgesi aktivasyonunun ardından bir ön etiket gibi Bundan başka, bu yaklaşım, tam hücre kaderin hücre göçü odaklı edinim özel soruları gidermez. Ayrıca bariz etik sorunları için insan embriyosu için geçerli olamaz.

Bu sınırlamalar göz önüne alındığında, biz yeni p bir dizi tasarlanmışhedeflenmiş bölgelerinde bu gibi floresan boyalar, virüs, ve bu shRNAs DNA-bazlı hücre etiketleme vektörleri gibi gen ekspresyonu modülatörlerinin veya E9.5 ve gelişiminin sonraki evrelerinde de fare embriyo hücreleri gibi hücre etiketleme çeşitli ajanlar enjekte rotocols kalp.

DNA / hücre enjeksiyonları Stereomikroskopta ve 48 saat veya 48-72 saat boyunca izole kalp ya da embriyonik eksplant kültürü kadar ex vivo embriyo kültürü ile birlikte basit bir mikroenjeksiyon cihazı kullanın. Biz de rahimde fare embriyonik gönlünde bir ultrason aracılı mikroenjeksiyon protokol rapor. Bu teknik embriyoların ¹³ gelişimini izleme sağlar ve injectates ve / veya etiketli hücrelerin uzun süreli takip için izin verir.

Biz, bu yaklaşımlar organın işlevini korumak ve kök hücre potansiyeli in vitro test daha temsili bir ortam temin ettiği bulunmuştur. Ayrıca göç takip fırsat sağlarkendi kaderini izlemek hücreleri etiketli ve / veya enjekte. Sonuç olarak, bu bölge, doku desenleme ve önemli biyolojik süreçlerin daha iyi bir anlayış elde edilmelidir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1.. Hazırlık

Hayvan Prosedürleri

Bir hayvan etik kurul onay almak ve virüs ile çalışmak için kurumsal yönergeleri izleyin, HuESC ve / veya iPSC (varsa) yanı sıra, fare kullanımı, fare embriyo elde edilmesi, ve fare ameliyat. Zamanlı eşleştirmesi için, tıpanın gün embriyonik gün (E) 0.5 / 0.5 gün post-coitum olarak kabul edilir.

1. Mikroenjeksiyon iğneler:
   Ex utero mikroenjeksiyon için, 1 ya da 10 mikron iç uç çapını ve sırasıyla, DNA veya hücreleri enjekte etmek için keskin ve konik ucu şeklini almak için bir pipet çektirmenin / beveller kullanılarak cam pipetler (1.2 mm dış çaplı borosilikat kılcal tüpler) çekin. Ultrason aracılı enjeksiyonlar için, kullanımı, 50/35 um OD / ID ucu ile mm/0.53 1.14 mm'lik bir iç / dış çapa (OD / İD) sahip steril iğneler, özel.
2. Silikon dolu petri:
   Kılavuzunda açıklandığı gibi silikon hazırlayın. Doldurmak~ 1 sm bir elastomer tabakası ile temiz bir cam 60 mm çapında Petri kabı. Hava kabarcıkları kaçının.
3. Araçlar:
   İşlem sırasında önce ve tüm cerrahi aletler steril tutun.
4. DNA hazırlanması:
   Tek bir tüp içinde 3 ug DNA ve 12 ul Opti-MEM ekleyin. Başka bir tüp içinde 3 ul Lipofektamin 2000 ve 12 ul Opti-MEM ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin ve her iki çözümü karıştırın. Hemen kullanın.
5. Hücre hazırlanması:
   10 ⁶ hücre süspansiyonunu hazırlamak / ml DMEM (Dulbecco'nun Eagle Medium, yüksek glikoz ve% 50 fare) tedaviden geçirildi. Nihai hücre süspansiyonu, 50 ul 8-10 embriyolar için yeterlidir.
6. Boya hazırlama:
   25 mg / ml DMSO de yeşil floresan CDCFDA-SE kullanın. -20 ° C'de 20 ul alikotları ve mağaza hazırlayın Steril serum fizyolojik veya PBS kullanımdan önce 1:100 / 1:200 sulandırmak.
7. Virüs hazırlanması:
   ~ 10 ^{9 10} -10 tra bir titreye sahip olan ticari bir ^3. kuşak PGK-GFP-ifade lentivirüs kullanınbirim / ml DMEM nsducing. Lentivirüsünün hazırlanması için, Tiscornia vd. ^14. kişisel koruyucu ekipman giyin ve güvenli bir şekilde kullanımı ve virüs imha bakın.

Ex vivo Enjeksiyon için E9.5 ve E10.5 Embriyolar 2. Koleksiyonu

1. Embriyonik gün 9.5 veya 10.5 hamile bir fareyi Euthanize.
2. % 70 etanol ile fare göğüs ve karın sterilize edin.
3. Karın açmak ve PBS içinde oda sıcaklığında uterin boynuz almak ve M16 ortamı ile bir silikon dolu bir Petri kabı iki PBS yıkar sonra aktarmak için bir ventral orta hat kesi olun.
4. Rahim vaskülarize yan alt böylece silikon tabakaya böcek pimleri ile uterin boynuzu Pin.
5. Yüzeyinin 1 mm ince forseps ile rahim yüzey ve desidua bir kapak kesin.
6. Yavaşça desidua duvarlar dışarı yayarak yumurta kesesinde embriyo almak.
7. 37 ° embriyolar Mağaza, Hücre enjekte edilmeden önce C M16 ortam. Enjeksiyon için her bir embriyo önceden ısıtılmış 37 ° C de M16 ortamı ile doldurulmuş silikon kabına aktarılır

Stereomicroscope altında 3. DNA veya Hücre Enjeksiyon

1. Bir Hamilton şırınga ile arka cam pipet doldurun ve ucunda kabarcıklarını çıkarmak için pipet sallayın.
2. Mikroenjeksiyon tutucuya pipet ayarlayın; 50, tutma basıncı (DNA) ya da 30 (hücreler) hPa ve 300 (hücre) için 150 enjeksiyon basıncı (DNA) hPa ayarlayın. 0.2 sn (DNA) veya 0.5 saniye (hücre) için enjeksiyon zamanı ayarlayın. Bu ayarlar, hafif mikroenjektör ve pipet türüne göre değişiklik gösterebilir.
3. Uygun embriyo dokunmadan sarısı ile silikon alt embriyo Pin. Kalbin bölge izlemek ve sadece bu bölgede yukarıda kese açık.
4. Hücre enjeksiyonu sırasında herhangi bir hareketi önlemek için embriyo yaklaşık 4 işaretçilerine ekleyin.
5. (Manuel ayarlı) mikromanipülatör kullanarak, slowlSadece (Şekil 1), enjekte edilecek olan kalbin bölgenin üstüne perikard en az 45 ° 'lik bir açı y konumu pipet ucu.
6. Ilgi bölgesi içine pipet hareket ve enjeksiyon tetikler. Mümkün olduğunca çabuk pipet dışarı atın. Emin kalp düzgün DNA / hücre enjeksiyonu sonra dayak olun.

4.. Embriyo, İzole Kalp ve Eksplantasyon Kültür

1. Penisilin / streptomisin, 37 ° C'de önceden ısıtılmış ve% 40 _O2 ile oksijen ile takviye edilmiş% 25 M2 ortamı ve% 75 sıçan serum içinde kültür E9.5 embriyolar.
2. , 25 ml'lik bir cam tüp içinde 2 ml kültür ortamı nazikçe embriyo ekleyin ve boru üzerine kapak vidalanarak önce% 40 _O2 ile oksijenat. Döner ya da (30 devir / dakika) çalkalanarak 37 ° C'de 36 saate kadar inkübe edin.
3. Istediğiniz zaman noktasına (örneğin 24 saat) At, ilk DE, kalpleri dokunmadan, ince forseps ile dikkatlice kalpleri teşrihEmbriyoların capitating; kalp uzak çıkış yolunu kullanarak dışarı çekerek ÖTV kolaydır.
4. Kültür, 12 oyuklu bir plaka içerisinde geçen bir Matrigel ile kaplanmış bir ek üzerine% 50 FCS ile DMEM içinde 36-48 saat boyunca bir kalp izole edilmiştir. Kalp kültürünün ¹⁵ geliştirilmiş bir protokol için Dyer ve Patterson (2013) bakınız.
5. Ilgili bölgenin herhangi bir eksplant yapın. Bir örnek olarak, kollajen tip 1 jel ¹⁶ üzerinde 48 saat için atriyo-ventriküler kanal (AVC) ve kültür teşrih.

Kalp I n utero 5. Ultrason eşliğinde Enjeksiyon

1. Ultrason makinesi ve mikropüskürtücünün Kurulum:
   1. Bir ray üzerinde 40 MHz transdüser ve mikroenjeksiyon kurulum ile yüksek çözünürlüklü ultrason sistemi kullanın.
   2. Enjeksiyon başına 69 nl de mikroenjektör üzerinde enjeksiyon ses seviyesini ayarlayın. Mikropüskürtücüden programlama için üreticinin mikroenjeksiyon kılavuzuna bakın.
2. Microi hazırlanmasınjection kurulum ve enjeksiyon:
   1. Mikroenjektör bir cam mikropipet yerleştirin. Maksimum hacme kadar aspire verimli enjeksiyon, ilk kapladıkları mineral yağ ile pipet iç tarafını sağlamak. Daha sonra, iğne içindeki yağın 1-2 mm'lik bir uzaklık bırakarak yeniden yağ çıkarın.
   2. Maksimum ses ulaşılana kadar enjektat aspire. Bu ucu künt ve enjeksiyon daha zor hale getirecek gibi iğne ucu ile herhangi yüzeylerine dokunmayın için dikkatli olun.
   3. Enjeksiyon sırasında embriyoları içeren uterin boynuzu stabilize etmek için, merkezi kesilmiş küçük bir yarık ile donatılır, ince silikon membran ile kaplı ortasında bir delik olan bir tadil edilmiş Petri kabı (2.5 cm çaplı), kullanımı ve insizyon üzerinde konumlandırmak . Yemeğin kenarlarının altında kil 3-4 yığınları konumlandırarak fare taşıma masaya Petri stabilize.
3. Enjeksiyon prosedürü:
   1. Önce anestezi için (istenen embriyonik aşamada) hamile bir fare karın Tıraşsia saç kaldırmak için. Kalıntı tüylerden ve% 70 etanol ile sterilize etmek için, bir kimyasal saç temizleme maddesi ile karın tedavi.
   2. Bir maske ile oksijen / izofluran ile hamile bir fare anestezisi. Prosedürün geri kalan kısmı boyunca 1-1.5%, ardından ilk anestezi için,% 100 oksijen içinde% 3-5 izofluran kullanın. Fare yeterince hafifçe pençeleri ve / veya kuyruk kısma anestezi emin olun.
   3. (37 ° C ısı ayarlı) fare taşıma masaya fare sırtüstü yerleştirin ve korneanın su kaybını önlemek için yağlayıcı ile gözlerinizi kapayın.
   4. Elektrotlar üzerinde elektrot jeli uygulayın ve kalp hızı, solunum hızı ve EKG izlemek için elektrotlara pençeleri bantlayın. Vücut sıcaklığını izlemek için bir rektal termometre yerleştirin.
   5. İlk fare görselleştirme ve ultrason ile embriyolar sayarak hamile olduğunu doğrulayın. Karın ultrason jeli uygulayın ve mesane üzerinde tarama kafasına yerleştirin. Tutarlılık için, ilk olarak mesane görselleştirmekve mesane konumdan başlayarak, sol ve sağ embriyolar rahim boynuzları sayılır. Embriyonik kalpleri normal yenerek emin olun.
   6. Fare hamile ise, kil ile gelecek kesi yukarıda Petri kabı yerleştirin. Çanak direkt temas halinde olduğunu böylece biraz karın üzerine çanak basın.
   7. Çanak çıkarın ve tekrar karın sterilize. Karın ve periton açmak için, yaklaşık 0.75-1 cm vajina üzerinde, bir 1.5-2 cm ventral orta hat kesi olun. Iç organlara zarar görmesini önlemek.
   8. Forseps ile sol veya sağ uterin boynuz Exteriorize, yavaşça yemeğin silikon zarından çekin ve tekrar kil üzerine çanağı stabilize. Önlemek kapsamlı bu uterus damarları ve kadın ve / veya embriyoların erken ölüm kanamaya neden olabilir bu yana, çekme ya da manipülasyon.
   9. Embriyolar enjekte edildiği, yeterli kayıt tutulmasını sağlamak için tekrar embriyolar saymak.
   10. U üzerinde ultrason jeli uygulayıngörüntü Terine boynuzları kalp ve dehidratasyonu önlemek için.
   11. Görüntü ilk embriyo enjekte edilecek. Embriyonik kalbin normal dayak kontrol edin ve embriyonun kaudal-kafatası ve sağ-sol yönelim kayıtlarını tutmak. Gerekirse, uygun yönlenmesinin sağlanması için hafifçe uterin boynuzu yerleştirin. Bu zor ise, bir sonraki embriyo geçmek.
   12. Biraz (Şekil 3) perikard dışında, embriyo üzerinde 45 ° açı iğne konumlandırmak için mikroenjeksiyon iğne ile dikkatlice rahim delinme. Bu atriyoventriküler oluk (Şekil 3) doğru çekiyor, böylece epikardiyal hücrelerin etiketlenmesi için, görüntü dört odacık görüntüsü kalp ve iğne pozisyon. Açısı ayarlanabilir gerekiyorsa, iğneyi çekin ve yeniden konumlandırmak. Bu iğneyi bozabilecek yana, rahim içinde iğne ile açısını ayarlamak etmeyin. Böyle bacaklarda veya plasenta gibi diğer dokuları, delinmesiyle kaçının.
   13. Iğne taşımakperikard duvara ve yumuşak, ama hızlı hareket ile delinme. Genel olarak, orada bazı direnç olacak, fakat çok hızlı iğne hareket iğne ucu kalbi kendisi delinmeye neden olabilir. Ucu atriyoventriküler oluk perikard uzayda bitmelidir. Perikardiyal kanama durumunda, kan hücreleri, beyaz bir kar-benzeri bir model olarak görünür olacaktır. Bu durumda, embriyo enjekte durdurmak ve başka bir embriyo geçmek.
   14. Enjekte edilecek enjekte edilir. Kalpler gelişimi üzerine olumsuz etkiyi önlemek için perikard uzaya maksimum 700 nl enjekte edilir. Perikardiyal kese hafif, geçici şişlik uygun enjeksiyon izleyin.
   15. Enjeksiyonu takiben, dışarı iğneyi çekin ve enjektat hala iğne doku parçaları tarafından tıkanmış değildi sağlamak için çıkarılır olabilir onaylamak.
   16. Görüntü işleme tablo konumlandırmak ve sonraki embriyo enjekte. Önlemek için (bir uterin boynuz) 3-4 maksimal enjekte edilen embriyoların sayısını tutunzıt uterin boynuzu kontrol embriyoları için izin vermek için ve prosedür, embriyo gelişimini rahatsız değil sağlamak için, anestezi genişletilmiş.
   17. Embriyo istenilen sayıda enjekte ettikten sonra, fazla ultrason jeli kaldırın ve yavaşça onun uygun pozisyonda karın içine geri uterin boynuz yerleştirin.
   18. Bir periton ve karın kasları için ameliyat dikiş ipliğinin bir tabaka ve cilt için dikişin ikinci bir katman kullanarak maternal karın kapatın.
   19. Ağrı kesici ilk dozu ile fare enjekte edilir. Önceki 12 saat aralıklarla anestezi ve üç ek enjeksiyonları biten 0.05-0.1 mg / kg Buprenorphine 15 dakika bir enjeksiyonunu kullanın.
   20. Anestezi durdurun ve prosedür yeterli kurtarma için fareyi izlemek. Ev izlem süresi için arzu edilen tek bir kafes içinde gebe fare.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Yukarıda tarif edilen enjeksiyon protokolleri kullanılarak, hücreler, 'etiketlenmiş ve / veya embriyonik fare kalp içine enjekte edilebilir. Kavramının kanıtı olarak, birkaç örnek enjeksiyon protokolü ve ex vivo AVC eksplant, izole edilmiş kalp veya bir bütün olarak embriyo kültürü (Şekil 1) bir araya getirilmiş olduğu gösterilmiştir.

Şekil 1, hücre enjekte edilmeden önce embriyonun hazırlanışını göstermektedir. Y...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Yukarıda tarif edilen intra kardiyak ex vivo enjeksiyon protokolleri orta aşama (E9.5-E11.5) fare embriyo en az 48 saat boyunca miyokard fonksiyonu korumak için tasarlanmıştır. Bu enjeksiyon yaklaşımlar DNA ya da hücre konumsal hedeflenen enjeksiyon için izin verir. Şekiller 1-3 de gösterilen birkaç örnek ex vivo ve bu endokardiyal veya epikardiyal hücre EMT olarak kısıtlı kalp bölgelerinde yer alan gelişimsel süreçlerinin vivo moleküler mekanizmalar...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Setups/Hardware
40 MHz Transducer	VisualSonics	MS550S
Microinjector	VisualSonics
Microinjector	Eppendorf	5242
Micromanipulator	Eppendorf	5171
Nitrogen			required to pressurize the injector
Rail system	VisualSonics
rotator			to rotate glass tube with embryos inside the incubator
Standard incubator			5% CO2, 37 °C
stereomicroscope	Zeiss	Discovery. V8
Vevo 2100	VisualSonics
Microinjection
Borosilicate capillary tubes	World Precision Instrument	KTW-120-6	1.2-μm external diameter
Pipette puller	Sutter	Model P87
Microinjection needles	Origio-Humagen	C060609	OD/ID 1.14 mm/53 mm, with 50/35 μm OD/ID tip
Hamilton syringes
Petri dishes			10-cm diameter
Mineral oil	Sigma	M8410
Silicon membrane	Visualsonics		4.3 x 4.3 cm
Play-Doh
Isoflurane	Vet One
hair removal agent	Nair
Eye lubricant	Optixcare	31779
Electrode gel (Signa)	Parker
Suture	Sofsilk 5-0	S1173
Ultrasound gel	Aquasonic
Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride)	Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC 12496-0757-1	0.05-0.1 mg/kg in saline
Other
Silicone Elastomer	Dow Corning	Sylgard 184
Glass petridishes	Fine Science Tools		60-mm diameter
Insect pins	Fine Science Tools	26002-20
Media and culture reagents
Optimem medium	Life Technologies	51985026
M2 medium	Sigma	M7167
Dulbecco’s Eagle Medium	Lonza	BE12-640F	high glucose and 50% rat serum
M16 medium	Sigma	M7292
Rat serum	Janvier	ODI 7158
Pennicilin/streptomycin	Life Technologies	15140-12
oxygen 40%	Air liquid		required to oxygenate the embryo culture medium
Fetal calf serum	Fisher	RVJ35882
Matrigel	BD	356230
Collagen type I	BD	354236	to coat culture dishes for explant culture
Culture dishes	Dutcher /Orange	131020
Injectates
CDCFDA-SE	Invitrogen/Molecular Probes	C1165	25 mg/ml DMSO. Store at -20 °C. Dilute 1:100-200 in saline before use.
PGK-GFP-expressing lentivirus			~8E9 transducing units/ml DMEM
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019