JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada GABA hipokampal nöronlar bir reseptör yüzey lokalizasyonu ve, endositoz ölçmek için α-bungarotoksin bağlanmış flüoresan Alexa boya kullanımını göstermektedir. Α-bungarotoksin, plazma zar proteini endositik ticaretinin analiz elde edilebilir bağlanan kısa bir hücre dışı bir etiket taşıyan konstruktların kullanımı yoluyla.

Özet

Bu giderek daha belirgin olduğunu İyonotropik GABA A reseptörleri (GABAAR), sergi derece dinamik kaçakçılığı ve hücre yüzey hareketliliği 1-7 gibi nörotransmitter reseptörleri. Hücre yüzeyi reseptör lokalizasyonu ve endositoz çalışma yapmak için, burada açıklanan teknik hücreler, bir α-bungarotoksin (Bgt) bağlama bölgesi (BBS) içeren yapıları ifade eden floresan α-bungarotoksinin kullanımını birleştirmektedir. BBS (WRYYESSLEPYPD) yüksek afinite ile 8,9 Bgt bağlanan kas nikotinik asetilkolin reseptörü, bir α alt birimi dayanmaktadır. BBS site dahil edilmesi, daha önce GABAA ve GABAB metabotropik takibi 2,10 reseptörleri de tarif edildiği gibi, yüzey lokalizasyonu ve alıcı ekleme veya eksojen floresan Bgt uygulama ile çıkarılması ölçümleri sağlar. BBS sitesine ek olarak, amino asitlerden 4 ve standart m tarafından olgun GABAAR alt biriminin 5 arasında bir pH-duyarlı bir GFP (pHGFP 11) takılıolecular biyoloji ve PCR klonlama stratejileri 12 (bkz. Şekil 1). BBS, bir 13-amino asit alanin / prolin bağlayıcı tarafından ayrılan, pH duyarlı GFP raportör, 3 'dir. Toplam bir muhabiri Bgt normalleşme toplam reseptör nüfusa reseptör nüfusu etiketli izin GABAAR altbirim düzeyde protein etiketlenmiş olarak sabit örnekleri dayalı bu yayında açıklanan çalışmalar kaçakçılığı için, pHGFP hizmet vermektedir. Bu etiketli GABAAR alt birimlerinin yüksek veya daha düşük bazal ifade kaynaklanan Bgt lekeleme sinyal değişkenliği hücre hücre en aza indirir. Ayrıca pHGFP etiketi canlı veya sabit görüntüleme deneyleri için yapı sentezleyen hücrelerin kolayca tanınmasını sağlar.

Giriş

Floresan reseptör lokalizasyonu ve dinamiklerini incelemek için α-bungarotoksin birleştirilmiş kullanımı, nikotinik asetilkolin reseptörü 13-15 toksinin endojen hedef çalışmalarda öncüleridir. Daha sonra, en az Bgt bağlayıcı peptid (BBS) dahil edilmesi hem de uyarıcı ve inhibitör ligand-kapılı iyon kanalları ve G protein birleştirilmiş alıcıların 2,10,16-21 kaçakçılığı incelemek için kullanılmıştır. Bu BBS-temelli bir yöntem, yüzey biyotinilasyon yöntemler, hücre-dışı epitopuna antikor canlı hücrelerin antikor etiketleme ve (sıkı bağlamak) ışıkla ağartma sonra floresan kurtarma gibi ticareti çalışmalar için kullanılan diğer yaklaşımlara avantajlar sağlamaktadır. Hücre yüzeyinde sırasında biotinilasyon serbest aminler kovalent hücresel aktiviteyi etkileme potansiyeline sahip, modifiye edilir. Antikor bazlı çalışmalar genellikle kaçakçılığı olayları değiştirebilir yüzey antijeni kümeleme veya kapatması, engel olmuştur. Nedeniyle sıkı bağlamak s beyazlatma aşamasındantudies önemli bir endişe, altta yatan hücresel yapının zarar veriyor. Diğer bir avantaj BBS konstruktları da biotin ile birleştirilmiş eşek bungarotoksin reseptör ticareti biyokimyasal yöntemleri için kullanılabilir etiketli olmasıdır. Bu teknik, hücre hatları ve primer hücre kolayca uygulanabilir. Belirtildiği gibi nikotinik asetilkolin (nAChR) reseptörlerini eksprese eden hücrelerde kullanım için, nAChR antagonist tubokurarin protokol boyunca kullanılmalıdır. Tubokurarin yokluğunda transfekte edilmemiş hücrelerde (endositoz protokolü için T = 0 zaman noktası eşdeğer) basit bir yüzey Bgt etiketleme Sahne endojen nAChR'nin kanıt sağlar.

Bu ilgilenilen protein plazma zarının teslim edilir hücre dışı bir konumda mevcut olduğu için bu tekniği kullanarak için önemli bir faktör, BBS uygun yerleştirilmesini içerir. Örneğin, GABAAR alt birimlerin N-terminal etki alanları prose sırasında veziküler lümen ikametticaretine ve hücre yüzeyi reseptörlerine ve endositik olayların hücre yüzeyinden kendi kaldırma değerlendirmesi belli etiketleme sağlayan, plazma zarında reseptör yerleştirilmesi sonra hücre-dışı hale gelir. Daha önce GFP, myc veya BBS eklenmesinin GABAAR alt birimlerin bu etki için epitoplarını göstermiştir ki, işlevsel olarak sessizdir. Standart kontrol uygun şekilde lokalize olduğunu ve etiketli protein, bir etiketlenmemiş yapısına benzer seviyelerde ifade olduğundan emin olmak için gerçekleştirilmiştir ve bu reseptör fonksiyonunu etkilemez edilmelidir. Transfekte yapıları Bu karakterizasyonu da sorun overekspresyonu kaygıları yardımcı olacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Aşağıda açıklanan tüm protokoller IACUC ve Tıp Pittsburgh Üniversitesi Fakültesi KİK kurumsal inceleme kurulları ile uyumludur.

1.. Doku Kültürü Hood Hipokampal Nöronal Kültürler hazırlanması

Not: Protokol 1 genelinde Kullanım steril tekniği ve reaktifler.

  1. Nöronal kültürü için bir alt-tabaka olarak poli-D-lisin (0.1 mg / ml olarak H 2 O) kaplı cam lameller hazırlayın.
    1. Her 3,5 cm doku kültürü çanak içinde 4-5 yuvarlak cam lamelleri yerleştirin.
    2. Her biri 12 mm örtücü kısım üzerine Noktası 70 ul poli-D-lizin. Not: canlı görüntüleme için, bir cam 3,5 cm'lik bir doku kültürü kabı (14 mm gömülü cam lamel üzerine 200 ul poli-D-lisin nokta) kullanılabilir dipli.
    3. Doku kültürü kaputu O / N. hazırlanan yemekleri bırakın Poli-D-lizin buharlaşmasını en aza indirmek ve doku kültürü kaputu steril yüzeyleri tutmak, pencere kanat kapatılması ve inci kapatmak içine blower O / N Not: UV lambaları O / N inkübasyon sırasında kullanılmazlar.
    4. Ertesi sabah, yıkama yemekler H2O 2 ml ile 3 kez
    5. 2 O yıkama son H çıkardıktan sonra, her 3.5 cm çanak medya 2 ml ekleyin ve adım 1.4 nöronlar plaka hazır olana kadar inkübatör yemekleri bırakın.
  2. Hipokampal nöron embriyonik gün 18-19 (Goslin 22 değiştirilmiş) (E18-19) sıçanları hazırlanır.
  3. Maxiprepped yapısı, 1-4 ug DNA ile kültür gününde taze ayrışmış nöronlar transfekte.
    Not: Genellikle DNA 3 ug 50% bir canlılığı ve 2.000.000 nöronlar başlayarak% 60 bir transfeksiyon verimliliği (örn, 1-2.000.000 nöron transfekte edilir: ((2 x 10 x 6 nöronlar 0.5) 0.6) içerir Yaklaşık 1 milyon dolar nöronlar.. potansiyel sorunlarını giderirken 1 transfekte olan 600,000 olan yapı DNA'nın Farklı miktarlarda transfekte edilebiliryapı, lokalizasyonu ve fonksiyon uygun karakterizasyonu, ardından aşırı ifade,.
  4. 3.5 cm tabak başına yaklaşık 200,000 nöronların nihai yoğunlukta poli-D-lisin kaplı lamelleri transfekte nöronlar Plate. Not: Bir cam dipli çanak için, 14 mm cam alanı üzerinde 40,000-50,000 nöronlar plaka.
  5. Medya nöronal kültürlerin hazırlanmasından sonra 4-24 saat değiştirin, sonra nöronlar in vitro (DIV) veya istenilen aşamada 14-17 gün kadar inkübatör içinde geliştirmesine olanak sağlar.

2. Endositoz Deneyi

DİKKAT: α-bungarotoksinin ve tubokurarin atık ve kullanım ile ilgili Not:

  1. Tüm peptid Nörotoksinlerin taşınması Biyogüvenlik Düzeyi-2 (BL-2) araştırma protokollerine kurallar içinde tavsiye edilir. Tüm uygun kişisel koruyucu donanım giyilmelidir. Liyofilize tozlar toksin üretici firmanın talimatlarına uygun olarak yeniden olmalıdır. Toksin atık should düzenleyen kurumun Çevre Sağlığı ve Güvenliği kurallarına uygun olarak imha edilmelidir.
  2. Depolama sırasında oluşabilen olası peptid agrega kaldırmak için, α-bungarotoksin tam bölünen miktarları, kullanımdan önce kısa bir süre için santrifüj edilmelidir, ve süpernatant deney için kullanılmalıdır.
  3. α-bungarotoksin (Bgt) stokları, -20 ° C'de steril H2O içinde 1 mg / ml 'lik bir konsantrasyona kadar yeniden süspansiyona alınmış ve 10 ul alikolar içinde saklanır Floresan bağlanmış Bgt stokları 3 ug / ml 'de kullanılmıştır. Tubokurarin, 150 uM değerinde bir nihai konsantrasyonda kullanılmıştır.
  1. Üstüne ince alüminyum veya paslanmaz çelik levha ile soğuk bir odada 16 ° C'ye ayarlayınız tezgah üst ısıtıcı blok. Mevcut Alternatif olarak, bir tezgah üstü soğutma / ısıtma cihazı 16 ° C gerektiren her adım için kullanılabilir
  2. MM olarak ihtiva eden hücre dışı serin Hepes-tamponlu tuz çözeltisi (HBS: 135 NaCl, 4.7 KCl, 10 HEPES, 11 glukoz, 1,2 MgCl2, ve 2.5CaCl2, bir su banyosu içerisinde 16 ° C'ye pH 7.4) eklenmiştir.
  3. 16 ° C 'de alüminyum levha transfer nöron yemekleri ve 5 dakika boyunca soğuk.
  4. Ortamı çıkarın (adım 2.8, endositoz deney zaman noktaları için kuluçka makinesi içinde koşullu ortam ve rezerv tutmak) ve 2 dakika boyunca 16 ° C HBS + tubokurarin (150 uM), 1 ml ile değiştirin.
  5. Etiketli bir atık kabına HBS + tubokurarin çıkarın ve Alexa 594 [3 ug / ml], 15 dakika boyunca 16 ° C'de inkübe 1 ml 16 ° C HBS + tubokurarin (150 uM) + α-bungarotoksinin ile değiştirin.
  6. Kaldır HBS + tubokurarin + α-bungarotoksin Alexa 594 (yıkar% 50 çamaşır suyu 50 ml içeren bir vakum şişesine aspirasyon yoluyla tahsil edilebilir), atık konteyneri, etiketlenmiş ve yemekler 16 ° C HBS 2 ml 3x yıkayın.
  7. Bir bardak kullanarak reseptör endositozu aşağıdaki canlı görüntüleme zaman serisi deneyleri 3,5 cm kültür dipli çanak için, adımları 2.1-2.6 gerçekleştirin, daha sonra ısıtılmış sahneye çanak transferi(Peltier cihaz) mikroskop ve konfokal veya TIRF mikroskop kurulumu ile görüntüleme başlar.
  8. 2.9 adım diğer lamelleri ile devam eden, 20 dakika boyunca RT% 4 paraformaldehid /% 4 sukroz bir çanak içine T = 0 zaman noktası lamelleri aktarın.
  9. Diğer zaman noktaları için, ile HBS yerine 37 ° C ortam (adım 2.4 aittir) ve 37 ° C Not endositoz için inkübatör dönmek dengelenmiş klimalı: ek süre T = 15 puan, 30, ve 60 önerdi.
  10. Zaman noktalarında gerekli, inkübatörden yemekler almak RT DPBS 2 ml hızla iki kez yıkayın (herhangi bir kalsiyum, magnezyum, DPBS), daha sonra 20 dakika süreyle% 4 paraformaldehid /% 4 sukroz içinde çözmek.
  11. 20 dk Fiksasyon sonra, kabı atık ve 2 ml RT DPBS ile iki kez bulaşıkları yıkamak için% 4 paraformaldehid /% 4 sukroz kaldırın.
  12. Immünofloresan blok çözeltisi içinde 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe lamelleri (blok çözeltisi = DPBS içinde% 5 at serumu,% 0.5 BSA) geçirgenliğini için% 0.2 Triton X-100 ihtiva edennöronlar ize ve hücre içi reseptör havuz ve / veya ilgi duyulan diğer proteinlerin etiketlenmesine anti-GFP immün sağlar.
  13. Blok +% 0.2 Triton X-100 çıkarın ve 20-30 dakika boyunca Triton X-100 olmadan imüno blok çözeltisi içinde lamelleri inkübe edin.
  14. 4 ° C'de, oda sıcaklığında ya da O / N birkaç saat boyunca blok lamelleri birincil antikor inkübasyonlar yapın Not: 4 ° CO / N de Primer ile lamelleri kuluçka rutin geliştirilmiş immunofloresans sonuçlar üretir.
  15. Yıkama DPBS (her bir yıkama adımı boyunca 5 dakika) ile 3 kez lamelleri.
  16. Oda sıcaklığında 1 saat blok çözeltisi içinde sekonder antikor ile inkübe lamelleri.
  17. Yıkama DPBS (her bir yıkama adımı boyunca 5 dakika) ile 3 kez lamelleri.
  18. Tek tek her lamel taşıma Dağı lamelleri: laboratuvar doku ile lamel arkasından aşırı sıvı kaldırmak sonra bir cam slayt orta montaj 4 ul üzerine lamel ters.
  19. Oda sıcaklığında kurumaya slaytlar st daha sonra 30 dakika boyunca kapalı izin ver4 ° C'de cevher mikroskobu gerçekleştirmek için hazır olana kadar.
  20. Görüntü edinimi ve konfokal mikroskopi (deneysel durumuna kör) ile deney analizi. 60X petrol NA aşağıdaki lazerler ile 1.49 daldırma hedefi: Argon gazı 488 nm, 561 diyot, 640 diyot.
    1. Aynı görüntü elde etme ayarlarını kullanarak, nöronal hücre gövdesi ve odak çeşitli dendritik süreçleri ile tek Z bölümünde görüntü kazanır.
    2. Tüm endositoz verilerin analizi için aynı eşik kullanarak, nöron başına 3-4 proksimal dendritlerin 20 mikron birlikte α-bungarotoksin Alexa floresan sinyali ve GFP bağışıklık boyamasım ölçmek.
    3. Birkaç bağımsız nöronal kültürler ile deney tekrar, her bir zaman noktası için 10-12 nöronlardan verileri analiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

BBS etiketli yapı karakterizasyonu gibi ifade edilen protein (özellikle birden fazla alt-birimden oluşan alıcıları ile) uygun bir şekilde bir araya saptanması önemlidir kontrolleri içeren, hücre yüzeyine trafikleri ve uygun şekilde lokalize eder. İnhibitör sinaps önleyici iskele protein gephyrin ile colocalize ve sinaptik vesiküller (VIAAT / VGAT) içine ve GABA glisin yükler veziküler önleyici amino asit taşıyıcı ile tanımlanır presinaptik inhibitör terminalleri, apposed olan bir reseptör y?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada açıklanan BBS göre sabit ve canlı teknikleri reseptörü veya hücre hatları, nöronlar ve diğer primer hücrelerde diğer plazma zar proteini kaçakçılığı izlemek için kullanılabilir. Bu yöntem, başarılı bir zar yerleştirilmesi ve ligand-kapılı iyon kanalları ve GPCR çıkarılmasını çalışma nedeniyle reseptör agonistleri ve modülatörlerinin varlığında sirkülasyondan değişiklikleri değerlendirmek için kullanılmıştır. Anahtar açıdan uygun bir hücre dışı bir konuma et...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Destek Tıp Pittsburgh Üniversitesi Okulu'nda Farmakoloji ve Kimya Biyoloji Bölümü'nden başlangıç ​​fonlar tarafından sağlanmıştır. Nicholas Graff: video gönderme katkıda Jacob laboratuvar üyeleri tanınması.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
P3 Primary Cell 4D kit LonzaV4XP-3024
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugateMolecular ProbesB35450
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugateMolecular ProbesB13422
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugateMolecular ProbesB13423
(+)-Tubocurarine chlorideTocris2820
Mounting medium DAKOcS703
DPBS no calcium, magnesiumInvitrogen14190-136
Poly-D-lysine SigmaP6407
Gephyrin antibodySynaptic Systems147 0111:300
VIAAT/VGAT antibodySynaptic Systems131 0021:1,000
anti GFPLife TechnologiesA64551:2,000
Glass bottom tissue culture dishMatTek CorporationP35G-1.5-14-C - Mattek Dishes
Coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mmWarner Instruments640-0702

Referanslar

  1. Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
  2. Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).
  3. Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses. Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).
  4. Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
  5. Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).
  6. Bannai, H., et al. Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics. Neuron. 62, 670-682 (2009).
  7. Muir, J., et al. NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).
  8. Katchalski-Katzir, E., et al. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).
  9. Scherf, T., et al. A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).
  10. Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
  11. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  12. Jacob, T. C., et al. Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).
  13. Anderson, M. J., Cohen, M. W. Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle. J. Physiol. 237, 385-400 (1974).
  14. Axelrod, D. Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).
  15. Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).
  16. Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
  17. Jacob, T. C., et al. GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).
  18. Hannan, S., et al. GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit. J. Biol. Chem. , (2011).
  19. Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current. EMBO. 31, 2937-2951 (2012).
  20. Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness. Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).
  21. Terunuma, M., et al. Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).
  22. Goslin, K. G. B. Culturing Nerve Cells. , 2nd ed, MIT Press. (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 85bungarotoksinba lanma yeriendositozimmunostainingkemirgen hipokampal n ronlarresept rticaretiplazma zar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır