Insan serumundan küçük kodlayıcı olmayan RNA'lar izolasyonu

Özet

Bu protokol, insan serumundan küçük RNA'ların ekstre edilmesi için bir yöntem tarif eder. Biz DNA dizileri kullanmak için kanser serumdan microRNA izole ve aynı zamanda singleplex kantitatif PCR için bu yöntemi kullandık. Protokol yüksek kalitede RNA elde edildi modifikasyonlarla fenol ve guanidinyum tiosiyanat reaktifler kullanır.

Özet

RNA ve ifade analizi, çok laboratuvarda ortak bir özelliktir. Önemi memeli hücrelerinde bulunan mikroRNA'lar, gibi küçük RNA'lar çıkmasıdır. Bu küçük RNA'lar gibi büyüme, gelişme ve ölüm ve çok ilgi gibi hayati yollar kontrol güçlü gen düzenleyiciler vücut sıvılarında kendi ifadesi yönelik olmuştur vardır. Bu, kanser ve serum biyolojik olarak potansiyel uygulama gibi insan hastalıklarında da bozukluğunun kaynaklanmaktadır. Ancak, serum miRNA ifade analizi, sorunlu olabilir. Çoğu durumda, serum miktarı sınırlayıcı ve serum küçük RNA'lar tek 0,4-0,5% ¹ teşkil eden toplam RNA düşük miktarda içerir. Böylece serumdan kaliteli RNA yeterli miktarda izolasyon araştırmacılar için büyük bir meydan okuma bugün. Bu teknik yazıda, DNA dizileri veya qPCR analizi ya için yeterli RNA elde etmek insan serumu sadece 400 ul kullanan bir yöntem ortaya koymaktadır. BirBu yöntemin dvantages sadeliği ve kaliteli RNA verim yeteneği vardır. Bu küçük RNA'lar saflaştırılması için hiçbir özel sütunları gerektirir ve ortak laboratuvarlarda bulunan genel reaktifler ve donanım kullanır. Önerilen yöntem, aynı zamanda, yüksek kaliteli RNA netice verirken, fenol kirlenmeyi elimine etmek için, bir faz kilit Jel kullanır. Ayrıca, daha da izolasyon aşaması esnasında tüm kirleri çıkarmak için ek bir adım tanıtmak. Bu protokol, serumdan kadar 100 ng / ul toplam RNA izole verim çok etkili değil, aynı zamanda diğer biyolojik dokular için uyarlanabilir.

Giriş

Son yıllarda, insan hastalıklarının erken teşhisi için yeni biyomarkerler keşfetmek için büyüyen bir itme olmuştur. Çok dikkat potansiyel belirteçleri gibi microRNA ² (miRNAs veya Mirs) gibi küçük RNA'lar kullanılarak odaklanmıştır. Bu küçük RNA'lar gibi serum ve çalışmaları gibi vücut sıvılarında bulunan bu bozunmaya esnek ve değişen çevre koşulları ^3'ün bir aralığı üzerinde kararlı olduğunu göstermiştir. Bu özellikler, serum veya dolaşımdaki miRNA'ların İdeal biyobelirtecin ^{4, 5} göz önüne alındığında. Şu anda biyolojik sıvılardan küçük RNA izolasyonu için iki temel yaklaşım vardır. İkinci yaklaşım fenol ve guadinyum tiosianat reaktifler ⁷ ile uzun soluklu protokolü kullanan ise ilk yaklaşım, küçük RNA'lar ⁶ bağlamak ve eluteye sütun tabanlı teknoloji kullanır. Biz insan serumu küçük RNA'lar izole etmek için basit, etkili, kolonsuz protokol geliştirdik. İzole edilen RNA derhal olduğuDNA oligonükleotid diziler ve RNA sıralanması gibi aşağı uygulamalarda rilmesi kullanılabilir.

Serumdan RNA izole etmek için fenol-tabanlı yöntemler kullanarak zaman biz çeşitli konularda karşı karşıya, çünkü bu protokol geliştirildi. Geleneksel Chomczynski yaklaşım, sıklıkla bir çok ticari satıcılardan temin edilebilir tepkin bir dizi ile en laboratuarlarda kullanılmaktadır. Bununla birlikte yaygın kullanımları göz önüne alındığında, sıkı kurallar sürekli olarak belirli bir kan ya da serum içinde, vücut sıvıları yüksek kaliteli RNA'yı üretmek için geliştirilmiş edilmemiştir.

Serum RNA izole edilmesi ile bağlantılı ortak sorunlar düşük verimler ve RNA izolasyonu, özellikle fenol sırasında kullanılan reaktifleri ile kontaminasyonu içerir. Bizim yaklaşım, kantitatif PCR (qPCR) ve RNA sıralanması gibi alt analizi için yüksek kaliteli RNA sağlamak için bu fenol kirleticileri ortadan kaldırır. Biz daha miRNA dizileri bu RNA test ettik.

Protokol

Not: Sağlıklı hastalarda ya da kanser hastaları İnsan serum örnekleri, Kraliyet Prens Alfred Hastanesi Sydney (Protokol numarası X10-0016 ve HREC/10/RPAH/24) ve Teknoloji Üniversitesi onaylanan insan etik protokolleri altında rıza ile elde edildi Sydney. Serum örnekleri çeşitli Sydney hastane ameliyatı önceki hastalar toplanmış ve -80 ° C 'de depolama yerleştirildi

Serum 1. Küçük RNA İzolasyon

Toplam RNA, Tri-Reagent LS protokolü RT modifiye edilmiş bir versiyonu kullanılarak insan serumundan hazırlandı.

1. Buz üstünde dondurulmuş serum örnek çözülme ve daha sonra etiketli bir mikrosantrifüj tüpüne taze çözülmüş serumun 400 ul aktarın.
2. RNase H serbest ₂ O, 100 ul serum seyreltilir ve 1 mg / ml 'lik bir konsantrasyonda, proteinaz K ekleyin.
3. Proteinaz K tarafından protein sindirimini izin vermek için 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe
4. To, tam çözülmesini sağlamak Tri-Reagent LS RT 1.5 misli hacim ve 4-bromoanisol 100 ul ilave edin.
5. Kısaca, ters Homojenat 5 saniye boyunca tekrar eden pipetleme gerçekleştirmek ve bir işaretlenmiş 2 mi Ağır Faz Kilitli tüp içine aktarın.
6. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 12,000 x g'de Homojenat Spin
7. Dikkatli bir şekilde yeni DNA LoBind tüp içine edilen sulu çözeltinin en az 1 ml süzün. Organik ve fazlar arası Faz Kilitli borunun beyaz jel altında sıkışmış olmalıdır.
8. , Sulu çözeltiye glikojen 5.0 ul (5 mg / ml) ve% 100 izopropanol, 500 ul ters çevirme ile karıştırın ve -20 ° C'de O / N inkübe
9. Aşağıdaki O / N inkübasyon 4 ° C santrifüj içinde 12,000 x g'da 20 dakika boyunca santrifüj örneği.
10. Net Süpernatantı atın ve 4 ° C santrifüj 16.000 × g 2 dakika için bir "flaş" sıkma gerçekleştirin.
11. Dikkatle açık sol kaldırmakBir pipet kullanarak pelet çevreleyen ution.
12. 10 dakika boyunca 10,000 x g 'de% 70 etanol ve 1 ml santrifüj ile pelet yıkayın. Yıkama solüsyonu Durusu ve yıkama adımı tekrarlayın.

Çözüm içine 2. RNA Tekrar Süspansiyonu

1. Pelet tamamen çözülür sağlanması, RNase serbest H ₂ O 10 ul pelet tekrar. RNA tamamen çözünebilir olduğundan emin olmak için, numune, 5 dakika boyunca 55 ° C'ye kadar ısıtılabilir. Bu süre boyunca, tekrar pipetleme ile örnek karıştırın. Daha yüksek bir toplam RNA verimi için, aynı hastadan alınan iki RNA preparatları havuz.
2. UV-Vis spektrofotometre kullanılarak yeniden süspansiyon haline getirildi ve bir RNA miktarını belirlemek 2100 Bioanalyzer kullanılarak RNA kalitesini değerlendirmek. Alt uygulamalarında kullanılmak üzere -80 ° C'de bir araya getirilmiş RNA örnekleri saklayın.

Sonuçlar

Şekil 1, serumdan izole edilmiş RNA tipik bir UV / Vis spektrumunu göstermektedir. Bu profil itibaren biz, sırasıyla her iki 270 nm ve 230 nm 'de fenol ve organik kirletici maddeler ile 280 nm'de protein kontaminasyonu kaydetti. Kalıntı, guanidinyum tiosiyanat da 260 nm'de tespit edilmiştir. Kirletici maddeleri azaltmak için, optimizasyon adımları bir dizi standart Tri-Reagent LS RT-prosedürü için yapılmıştır. Biz, total RNA verimi artırmak ve hem de bulaşma (siyah çizgi...

Tartışmalar

MicroRNA nüfusu serumda bulunan toplam RNA'nın yaklaşık olarak% 0.4-0.5 oluşturmaktadır. Bundan başka, insan serumunda bulunan, yüksek protein içeriği de vardır. RNA ve protein geliştirmek ve fenol hem azaltmak için biz birkaç adımda eklenmesi ile geleneksel bir yaklaşım Chomczynski ⁹ olarak var kirlenmektedir.

Laboratuvarımızda gerçekleştirildiğinde Toplam RNA, standart Tri-Reagent LS RT-(Molecular Research Centre) kullanarak serumdan izole edilmiştir, ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tri-Reagent RT LS	Molecular Research Center, USA	TR 118
RNase free H2O	GIBCO Invitrogen	10977-023
Proteinase K	Finnzymes, Finland	EO0491
Heavy Phase Lock tube	5PRIME	2302830	2 ml capacity
DNA Lobind tube	Eppendorf	0030 108.078	1.5 ml capacity
Glycogen	Invitrogen, USA	10814-010	5 mg/ml
RNA grade isopropanol	Sigma Aldrich, USA	I9516	100%
Refrigerated centrifuge	John Morris
Nanodrop UV-Vis spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, USA
RNA grade ethanol	Sigma Aldrich, USA	E7023	70%
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent, USA