Farelerde Beyin Doğrudan İlaç Teslim heterotopik mukozal aşılanması Prosedürü

Özet

İnsan endoskopik kafa tabanı yeniden fare modeli nazal mukozal greft kullanılarak beyin ve burun arasındaki yarı geçirgen bir arayüz oluşturur geliştirilmiştir. Bu yöntem, araştırmacılar, sistemik olarak uygulandığında, aksi takdirde, kan-beyin bariyeri tarafından hariçtir yüksek moleküler ağırlıklı terapötik maddelerin merkezi sinir sistemi teslim çalışma sağlar.

Özet

Beyne terapötiklerin teslim kan dolaşımına ve beyin dokusu içine polar ve yüksek moleküler ağırlıklı bileşiklerin geçişini sınırlayan kan-beyin bariyeri (BBB) ​​varlığı ile engellenmektedir. İnsanlarda bazı doğrudan dağıtım başarı transkranial kateter implantasyonu yoluyla elde edilmiştir; ancak bu yöntem son derece invaziv ve çok sayıda komplikasyonlar ile ilişkilidir. Daha az invaziv bir alternatif örneğin insanlarda endoskopik transnazal tümör çıkarma ameliyatı sonrasında kafa tabanı hasarlarını tamir etmek için kullanılan burun mukozası gibi ameliyatla takılan bir, yan geçirgen bir zar ile beyin doz olacaktır. Olsa ilaç transfer bu zar etkili BBB bypass ve beyin ve omurilik sıvısına doğrudan dağılırdı. Bu yaklaşım esinlenen, farelerde bir cerrahi yaklaşım Ekstrakranial cerrahi BBB defekti üzerinde engrafted bir donör septal mukoza zarı kullandığı geliştirilmiştir. Bu model, etkili bir şekilde gösterilmiştirbeyne yüksek molekül ağırlıklı bileşiklerin geçişine izin verir. Çok sayıda ilaç adayları BBB geçen aciz olduğundan, bu model nörolojik ve psikiyatrik hastalıklar için yeni tedavilerin klinik öncesi testler gerçekleştirmek için değerlidir.

Giriş

Nörolojik ve psikiyatrik hastalıkların tedavisi ciddi bir şekilde, merkezi sinir sistemi ^1-3 ulaşan tüm olası farmasötik maddelerin% 95 in üzerinde önler, kan-beyin bariyeri (BBB) ​​varlığı ile engellenmektedir. Örneğin, Glial nörotrofik faktör (GDNF) türetilmiş bu BBB ^4-6 nüfuz edemez, çünkü sistemik olarak verilen, ancak etkisiz olan, beyin içine doğrudan enjekte edildiğinde, Parkinson hastalığının tedavisi için etkili olduğu gösterilmiştir.

Çok sayıda yaklaştı, bu sorunu aşmak için denemek için geliştirilmiştir. Neurotheraputics sistemik teslim İyileştirme beyin kılcal endotel üzerinde bulunan taşıyıcı proteinlerin seçici antikorları içeren ilaç konjugatlarını kullanılarak kanıtlanmıştır; Bununla birlikte, bu yöntem, farmasötik ^7,8 geniş bir yelpazesi için geçerli olduğu gösterilmiştir edilmemiştir. Ayrıca, BBB ozmotik açılış kliniği kullanılır olmuşturilgi ⁹ beyin bölgesi için daha doğrudan teslim aksine müttefiki, ancak bu yöntem, sistemik ilaç doz muzdarip. Önemli çaba doğrudan beyni ^10-12 hedefleme umuduyla transnasal teslim optimize girmiştir. Bazı başarılar elde edilmiş olmasına rağmen, kesin sonuçlar sadece Ensülin ^13,14 gibi endojen reseptörleri sahip ilaçlar için elde edilmiştir. Ayrıca Transnazal teslim mekanizması koku nöron alımı yoluyla ya da kan dolaşımı ¹¹ üzerinden beyne dolaylı giriş düşündüren kanıtlar tartışmalı olmuştur. Implante kateterler kullanılarak doğrudan, transkranial teslim ancak bu işlem oldukça invaziv ve çok sayıda komplikasyonlar ^15,16 ile ilişkili olduğunu elde edilmiştir. Bugüne kadar, beyin içine, yüksek molekül ağırlıklı bileşiklerin sunmak için genel bir minimal invaziv bir yöntem yoktur.

Bir murin cerrahi işlem olup, burada sunulanbu beyin yarı-geçirgen bir arayüz oluşturur. Bu, bir fare, bir cerrahi kranyotomi kusur boyunca Mukozal zarı eksplant ¹⁷ aşılanması ile gerçekleştirilir. Bu prosedür kullanılarak, 500 kDa kadar çözünür bileşikler, bir zaman ve molekül ağırlığı ¹⁸ bağlı bir şekilde her ikisi de merkezi sinir sistemi (direkt olarak beyin dokusu içine yanı sıra, beyin-omurilik sıvısına) içine teslim edilebilir gösterilmiştir. BBB atlayarak Bu yöntem transnazal endoskopik cerrahi ^19,20 aşağıdaki kafatasında delik onarmak için vaskülarize mukozal greftler kullanan insanlarda kafa tabanı defekt onarım için bir modeldir.

Protokol

Ameliyat öncesi yapılması gereken tüm prosedürleri IACUC ve herhangi bir ek etik ya da yasal yetkililerin tarafından onaylanmış ve insancıl hayvan tedavi uygulamalarını kullanmak emin olun. Bu, steril cerrahi koşullar kullanarak IACUC onaylı yöntem kullanarak fare anestezi, ameliyat sırasında veteriner merhem ile fareler gözleri yağlama ve cerrahi sonrası bakım sağlayan içerir. Prosedürün yönleri onaylanmış olup olmadığını herhangi bir soru varsa cerrahi ile devam etmeyin. Burada gerçekleştirilen tüm işlemler Boston Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

1.. Hayvanlarının Hazırlanması ve Cerrahi Malzemeleri

1. Ameliyat sırasında kullanılacak olan tüm cerrahi alet otoklavlayın.
2. Yapılacak olan tüm teknikleri hayvan düzenleyici kurumlar tarafından onaylanan emin olun.

Mukozal Greft 2. Hasat

1. Gibi benzer yaştaki bir genetik özdeş fare seçtideneysel fare ve (burada: servikal dislokasyon izofluran boğulma) IACUC onaylı yönteminde euthanize.
2. Cerrahi makas kullanarak, kafatası açığa fare baş burun çevresinde cilt kaldırmak.
3. Yanal burun bölgesini ve dik iki satır bağlayan gözlerle doğrultusunda üçüncü bir kanadını iki üç satır ile bir havalı matkap, işareti.
4. Çevreleyen dokudan burun septum ayırmak için ventral detaya. Daha geniş bir yol ancak o da daha zor zar izole yapacak mukozal membran zarar görmesini engelleyecektir. Yakın orta hatta dar bir kesim tavsiye edilir.
5. Buna yapışık bir dokudan serbest septum kesilmiş ve bir steril tuz çözeltisi içinde depolamak için makas kullanın. Bu anda greft herhangi bir bağlı doku kaldırmak kadar temizlenebilir. İdeal durum, hasarsız mukozal zarlar kıkırdak septum her iki yüzünde de sahip olmaktır. Bir grarka membran yüzey alanı, kraniyotomi siteleri karşılamak için yeterli olması şartıyla, iki fare için membran temin edebilir. Bu, mümkün olduğunca hızlı bir aşı olarak kullanılan ve araştırmacı en kısa sürede aşı izole edilir olarak 3 aşamasına ilerlemektedir önerilir.

Mukozal Greft 3. Cerrahi İmplantasyonu

1. Standart, aseptik kemirgen cerrahi prosedürleri kullanılarak, uyutmak ve Stereolojik çerçeve içinde bir fare monte. Bir kemirgen anestezi makinesi kullanılarak saf oksijen yaklaşık% 2 izofluran kullanın.
2. Kulak çubukları ve bir sivri tutucu ile bir stereotaksik cihazında fare hareketsiz. Gözleri oftalmik merhem sürün ve üç tur için Betadin ve% 75 etanol ile kafa derisi fırçalayın. Makas veya saç düzeltici kullanarak, kafasına kürk çıkarın. Bir jilet ile kafatası maruz ve kafa seviyesi. Dozlanacaktır beyin mahallinin üzerindeki bir kranyotomi gerçekleştirin. Örneğin, striatum hedeflerken bir 1.25 mm kesilmişpnömatik bir matkap kullanarak:;: (0.88 mm ML 1.00 mm AP merkezli) kafatası çaplı dairesel delik. Steril serum fizyolojik ile delinmiş bölgeyi ıslatın ve kafatası kaldırmak için bir jilet kullanın.
3. Dikkatli bir iğne ucu kullanılarak dura kaldırın. Ayrıca, bu nemli dural yüzeyine doku yapıştırıcı en az bir miktarda uygulanarak gerçekleştirilebilir. Bu tabaka, sertleştikten sonra, bir traş makinesi bıçak ucu ile yanal hareket membran kaldırmak için kullanılabilir.
4. , Yaradan uzakta bakan epitelyal yan tutmak için çok dikkat çekici beyin yüzeyi üzerinde mukoza zarı yerleştirin. Bu en iyi cımbız ile kranyotomi yerine bitişik kafatasının yüzeyine üzerindeki tüm septum aktarılmasıyla yapılır. Cerrahi makas bir çift ucu kullanarak, kıkırdak kapalı ve kafatası ve beyin yüzeyi üzerine bir membran çekin. Membran kurur ya da herhangi bir emici malzeme ile temas etmesine izin vermeyin. Greft cömertçe kraniotomi s tüm kemik kenarları üst üste gelmelidirite.
5. Nitril steril bir parça ile greft örtün. Bu, iyileşme sırasında greft için derinin yapışmasını önlemek için hareket eder. Nitril, tüm mukozal membranı karşılamak için yeterince büyük olması gerekir. Gerekirse aşırı membran kesin. Bu greft temas sonra nitrilin bir hareket kaçının.
6. Bir çalışan 5-0 steril dikiş ile cilt kapatın ve fare bir sonraki adıma geçmeden önce 3-7 gün boyunca kurtarmak edelim. Cilt kapatılması sırasında nitril bariyer veya mukozal greft perturb özen gösterin.

Doz Çözüm 4. İdaresi

1. Stereotaktik çerçeve içinde anestezi fare güvence sonra, makasla dikiş kesilmiş ve kafatası çevresinde aşırı cilt kaldırmak.
2. Nitril engel çıkarmak ve kafatasının yüzeyini temizlemek. Greft görünür oluncaya kadar bölgeyi temizlemek için steril tuzlu ve pamuklu çubuk kullanmayın. D den daha büyük bir artış gösterdi, bu bir jilet ile greft kesmek için gerekli olabiliryüzey alanı esired.
3. Deney bir kaç gün daha uzun olacaksa, o kafa implant güçlendirmek için en az iki kafatası vidayı implant akıllıca olacaktır.
4. Kenarları kafatası ile temas halinde olan, böylece greft üzerinde de yer verilmiştir. Kuyu ve kafatası arasındaki kavşakta cyanoacrylate yapıştırıcı uygulayın. Steril serum fizyolojik ile iyi doldurmak ve emin sızıntı olmadığından emin olmak için kontrol edin. Wells kesim şırınga iğneleri yapılır.
5. Yerine kuyu sabitlemek için kafatası kemik çimentosu uygulayın.
6. Bir pipet ile kuyudan tuzlu çıkarın. Bu yapıştırıcı istenilen çözüm ekleyin içeri sızdırılmış değil doğrulamak için de birkaç kez yıkayın; Bu durumda floresan dekstran 50 ul kullanılmıştır. Bu, benzer bir polariteye sahip suda çözünür bileşikleri, dekstran gibi aynı şekilde davranır beklenmektedir. Hidrofobik bileşiklerin ya da süspansiyonlar Gönderme Bu yöntemle incelenmiştir edilmemiştir.
7. Sabitlenen nitrilin dairesel parça ile kuyunun üst kapaksiyanoakrilat yapıştırıcı kullanılarak üst. Yapışkan de içeriği ile temas etmediğinden emin olun.

Transmukozal Teslim 5. Analizi

1. İstenen zaman süre geçtikten sonra fare anestezi ve Evan mavi bir boya çözeltisi ile de içeriği değişimi. Bu boya, aşı sağlam olduğunu doğrulamak için kullanılır.
2. 30 dakika sonra, ağır fare uyutmak boya çözüm kaldırmak ve decapitation yoluyla euthanize.
3. Elle implantı çıkarın ve cerrahi makas kullanarak beyin kaldırmak. Yerinde greft tutmak için dikkatli olun.
4. Bir kez çıkarıldı, flaş dondurma izobütan çözeltisi içinde beyin kuru bir buz banyosu içinde soğutuldu.
5. Optimal Kesme Sıcaklık 50 um de (OCT) çözeltisi ve dilim içinde beyin gömün.
6. Bir mikroskop lamı üzerinde doğrudan istenen dilimleri yerleştirin.
7. Görüntü kısa sürede Ekim çözüm kuruduktan gibi bir açma mikroskop kullanılarak dilim.

Sonuçlar

Yeterince büyük bir nazal septum eksplant elde sonraki adımları için çok önemlidir. Bu, Şekil 1a'da gösterilen verici fare kafatasında bir yerde sondaj ile gerçekleştirilebilir. Şekil 1b de gösterildiği gibi, bu yol boyunca kesme yeterli büyüklükte bir eksplant üretecektir. Sondaj derinliği yeterince derin değilse, greft kesilmiş olacak ve beyin yüzeyini kaplamak için yeterince büyük bir zar elde etmek zor olacaktır. Daha fazla doku nazal septum üzerinde ...

Tartışmalar

Burada tarif edilen prosedüre en zor adım beyin yüzeyi üzerine yeterli büyüklükte bir mukoza zarının başarılı transferidir. Hasat burun septum yeterince büyük ve iyi temizlenmiş ise bu adım önemli ölçüde daha kolay yapılır. Septum ventral kısmı kesilirse, yeni bir greft elde edilmelidir. Delme açısı mukozal membran matkap tarafından zarar görmediğinden emin olmak için fare kafasına dik olmalıdır. Daha geniş bir tavsiye daha sondaj yol alınırsa bu septum bağlı olduğu ekstra doku ka...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	Taconic	C57BL/6
Isoflurane	Piramal Healthcare
Student fine scissors	Fine Science Tools	91461-11
Pneumatic drill	MTI Dental	333-CB
Drill bit
Forceps	Fine Science Tools	91106-12
0.9% Sodium chloride injection USP	Abbott Laboratories	4925
Polystyrene Petri dish	Fisher	08-757-12	for temporarily storing graft
Bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Oxygen/Isoflurane System	SurgiVet	V720100
Temperature Control System	Physitemp	TCAT-2LV
Small animal stereotaxic instrument	KOPF	Model 940
Eye ointment
Electric shaver
Cotton-tipped applicators	Fisher	23-400-106
7.5% Providone iodine			Betadine surgical scrub
70% Ethanol
Surgical blade stainless	Feather	2976#10
Scalpel handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
3% Hydogen peroxide			for cleaning the skull
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB
Needles	Becton, Dickinson and Company	305176	needle tip cut off and used as well
Syringes	Becton, Dickinson and Company	309597
Nitrile gloves	Denville Scientific Inc	G4162	for well closure and protection of graft
5-0 Nylon suture thread
Student Halsey needle holder	Fine Science Tools	91201-13
Cyanoacrylate adhesive			commecially available super glue
Dental cement kit, 1 lb, pink opaque	Stoelting	51458
Isobutane (2-methylbutane)	Aldrich	M32631	for dry ice bath
Dry ice