Hastalar ve İnsan endotel hücrelerinden türetildiği Prostat dolaşımdaki tümör hücrelerinin arasında E-selektin aracılı Etkileşimleri gözlemleyin vitro Yöntemi

Özet

Bizim rapor fizyolojik akış koşulları altında prostat kanserinde CTC / EC etkileşimleri görselleştirmek ve analiz etmek için eşsiz bir yöntem açıklanır.

Özet

Metastaz tümör hücrelerinin ikincil bir niş damar dışına ve form erişim sağlamasını ve böylece, birincil tümör intravasate kan vasküler ve lenf sistemi için tutacak edildiği bir süreçtir. Kan damar sistemi için tümör hücrelerinin ekstravazasyon farklı hücre hatlarından elde edilen endotelyal hücreleri (EC) ve tümör hücreleri kullanılarak incelenebilir. İlk çalışmalar, statik koşullar kullanılarak yapılmıştır ancak iyi EC fizyolojik akış koşulları altında farklı davranır olduğu belgelenmiştir. Bu nedenle, farklı akım odası düzenekleri henüz EC'ler ile kanser hücresi etkileşimleri incelemek için kullanılmaktadır. Akım akışı odası takımları, farklı kesme stres koşullarında farklı hücre hatları veya sıvının kullanarak tekrarlanabilir sonuçlar sunuyoruz. Ancak, gözlemlemek ve bu tümör hücrelerini (KTC) dolaşan gibi nadir hücreleri ile etkileşimleri çalışmak için, bazı değişiklikler geleneksel akış odası montaj yapılacak gerekmektedir. KTCkan hücrelerinin milyonlarca arasında nadir bir hücre popülasyonu vardır. Sonuç olarak, kapalı zaman eğrileri saf bir popülasyonu elde etmek zordur. Normal olarak, dolaşımda bulunan farklı hücre tipleri ile kapalı zaman eğrileri kirlenmesi mevcut zenginleştirme ya da tükenme teknikleri kullanılarak kaçınılmazdır. Bu raporda, biz floresan etiket dolaşan prostat kanseri hücreleri için benzersiz bir yöntem tarif ve kendine monte akış odası sistemine EC'lere olan etkileşimlerini araştırır. Bu teknik bundan başka, prostat kapalı zaman eğrileri ve ilgi duyulan herhangi bir protein arasındaki etkileşimi gözlemlemek için uygulanabilir.

Giriş

Metastaz az anlaşılmaktadır karmaşık çok-adımlı bir işlemdir. E-selectin/selectin ligand ekseni vasküler endotel ve kanser hücrelerinin ^1,2 arasında birinci yapışkan etkileşimi teşvik ederek tümör metastazında önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Farklı E-selektin ligand (lar), tümör hücreleri tarafından eksprese ³ ise endotel (E)-selektin, aktive edilmiş endotel hücreleri tarafından eksprese edilen bir transmembran proteindir. Çok sayıda in vitro yaklaşımların başarılı bir tümör hücrelerinin ve endotel hücreleri arasındaki E-selectin/selectin ligand etkileşimlerini (EC) ¹ Modele kullanılmıştır. Bu etkileşimleri çalışmak için, farklı akış odası sistemleri, kan damar sistemini simüle etmek için istihdam edilmektedir. Akış odası montajları arasında, EC'ler ile bağlantılı olarak paralel plaka akış bölmesi (PPFC) rutin olarak vivo kesme stresi koşulları simüle eden bir in vitro modeli olarak kullanılır. Bu bağlamdayöntemi, EC 35 mm çanak üzerinde yetiştirilen ve bir tek tabaka elde sonra, EC PPFC bağlı olan ve kayma gerilme tabanlı deneyleri yapılmaktadır.

Bununla birlikte, PPFC ve mevcut sistem hasta ve EC'ler türetilen tümör hücrelerinin (kapalı zaman eğrilerinin), dolaşımdaki arasında yapışma etkileşimleri incelemek için pek çok sınırlamalar mevcut temel olarak, kapalı zaman eğrilerinin kan hücrelerinin milyonlarca arasında dolaşan, primer tümörden döken hücre nadir nüfus, çünkü (1 CTC ⁹ kan hücreleri başına 10) ^4. Bu nedenle, kültürlenmiş hücre çizgileri sınırsız kaynağı aksine, düşük CTC sayısı çalma analiz için etkileşimleri kaydetmek için uygun bir akış kanalı genişliği gerektiren, çok az ve nadir CTC / EC etkileşimleri yol açar. Hasta kapalı zaman eğrilerinin elde edilen saf olmayan bir nüfus olduğu ek olarak, bu nedenle tanımlama işareti özel olarak CTCS izlemek için gereklidir. Bu sorunu çözmek için, biz (PCA) CT prostat kanseri tespit etmek için yeni bir yöntem geliştirdiCs neredeyse tüm bu kapalı zaman eğrileri, kendi hücre yüzeyinde ^5,6 prostat spesifik zar antijeni (PSMA) belirtisi göstermesi gerçeğinden yararlanarak. Bu raporda, biz sonunda metastaz mekanizmasını anlamak için, EC 'ile prostat CTC etkileşimleri çalışmak için yeni sistemin potansiyel yarar göstermek için, prostat kanseri hücre hattı MDA PCa2b (MDA) kullanılır.

Metodoloji vivo vasküler sistemde ^7-9 taklit çeşitli kesme bazlı deneyler için uygulanabilir. PKa CTC / EC etkileşimleri incelemek Bunun yanı sıra, akım odası sistemi kolayca periferal kan tek-çekirdekli hücreleri ya da analiz EC'ler ile tümör hücrelerinin etkileşimleri için adapte edilebilir. Sökülmesi ve akış odasının Reassembling kolaylığı, bir mikroslayd III ^(0.1) (bundan sonra mikroslayd olarak anılacaktır), perfüzyon ve pr ikna etmek için farklı sitokinler ile ECS uyarıcı altında kültür ECS sağlarifadesini otein. Bunun yanı sıra, kültürlü EC, örneğin E-ve P-selektin, rekombinant proteinleri, tümör hücreleri ile Mikroslayd ve etkileşimler üzerine kaplanabilir laminar akış koşulları altında ¹⁰ gözlenebilir.

Protokol

Gözlem CTC-endotel Etkileşimleri Lam 1. Ekimi HUVEC'ler

1. Doku kültürü kaputu altında, ilk olarak, PBS ile 1 mm kanal genişliğini mikroslayd durulayın. Yavaşça kat 50 ug / ml fibronektin (PBS içinde çözülmüş) bir 1 ml'lik luer-lock şırınga kullanılarak 200 ul Mikroslayd.
2. Kapak ile Mikroslayd örtün ve 30 dakika boyunca doku kültürü kaputu içine tutun. Mikroslayd içindeki sıvının yavaş dağıtım kanalında kabarcık oluşumunu engeller.
3. Ilık (37 ° C) HUVEC büyüme ortamında 200 ul serpmek (M199 ortamı, 1 M HEPES,% 20 FBS, 5 mg / ml heparin, 100 ug / ml endotelyal hücre büyüme faktörü ve L-glutamin) Mikroslayd üzerinden ve boyunca inkübe Oda sıcaklığında 20 dakika. Perfüzyon sırasında HUVEC hücre süspansiyonu hazırlamak.
4. PBS ile durulayın HUVECler ve oda sıcaklığında 1-2 dakika boyunca% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. 5 dakika boyunca 180 x g 'de 2 ml büyüme ortamı içinde santrifüj HUVECler.
5. Bir neuba kullanarak hücre konsantrasyonunu ölçünuer hemositometre ve büyüme ortamı ul 10 ⁷ HUVEC hücre/100 hazırlamak. Daha sonra, dikkatli bir şekilde 200 ul pipet kullanarak Mikroslayd girişinden orta çıkarın.
6. Göz seviyesine mikroslayd ve 1 ml luer-lock şırınga kullanılarak getirmek, yavaşça kanal içine HUVEC'lerin hazırlanmış konsantrasyonu 200 ul serpmek. Dikkat kabarcık oluşumunu önlemek için bu adım gereklidir. Kabarcıklar görünüyorsa, kabarcıklar çıkış kanalını girmek kadar biraz daha uzun bir süre için sızdırılmasını tutun.
7. Giriş ve çıkış Mikroslayd hem HUVEC ortamının eşit bir hacmi (~ 80 ul) koyun. Bu, her iki yönde hücrelerinin akışını engeller.
8. Slayt örtün ve 1.5 saat için inkübatör (37 ° C) tutun.

Bir mikro Gecelik HUVEC Kültür Akış Odası Meclis 2.. Hazırlanması

1. 15 mi boyunca inkübatör içinde bir steril 20 ml şırınga, dişi ve erkek Luer bağlantıları, boru ve bir şırınga pompası yerleştirinn.
2. Minimum ölü hacmi için, 0.04 inç iç çaplı boru kullanın. Daha küçük boru çapı baloncuk oluşumunu engeller.
3. Ilık (37 ° C) HUVEC ortamı (12 mi) ile 20 ml şırınga doldurun. Şırınga üzerine konnektörleri ile tüp takın. Kabarcıklarını çıkarın. Mikroslayd Bu montaj bağlayın.
4. Tamamen HUVEC medya ile Mikroslayd giriş doldurun. Yanındaki mikroslayd için konnektöre bağlı doldurulmuş 20 ml şırınga getirin. Yavaşça mikroslayd için bağlacı takın.
5. Kuvöz içine set-up getirmek ve 10 ul / dk kesme hızında ayarlanmış şırınga pompası, bağlanın. 37 ° C'de inkübatör hücreleri O / N bırak
6. Bir sonraki gün, Mikroslayd girişine bağlı soketi kaldırarak kurulumu sökülmesi.
7. EC'lere on E-selektin ekspresyonunu için 4 ml medyada ng / ml 10 IL-1β içeren yeni büyüme ortamı hazırlamak. 10 ml şırınga içinde ortam aspire. T Kaldıro Mikroslayd girişinden ortam ve slayt için şırınga bağlayın.
8. Kuluçka makinesi içinde, 4 saat boyunca 10 ul / dak kesme oranında şırınga pompası ayarlayın.

3. Anti-PSMA'nm Hazırlama (J591-488) Etiketli Prostat Kanseri Hücreleri

1. HUVEC IL-1β İnkübasyon sırasında, anti-J591 PSMA-Alexa488 etiketli PCa hücrelerini hazırlamak. 1 dakika boyunca MDA hücreler% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. Bu, hücre yüzeyi üzerinde mevcut olan peptidi etkileyebilir gibi uzun süreler boyunca tripsin üzere hücrelerin maruz bırakılmamalıdır. Enzim hücre ayrışma reaktif yerine de tripsin kullanılabilir. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj.
2. 1 ml H / H tamponu (Hanks dengeli tuz solution/0.1% HSA/10 mM HEPES / 1 mM _CaCI2) içinde MDA hücre pelletini. Karanlık bir yerde, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 20 ug / ml 'de anti-J591 PSMA-Alexa488 antikor ekleyin. Inkübasyon sırasında hücreleri tekrar süspansiyon.
3. 30 dakika sonra, 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj hücre çözümü. Aspihızı ve 1 ml H / H tampon içinde pelletini. Etiketlenmiş MDA hücre sayımı ve 1x10 ⁶ hücre / ml nihai konsantrasyona getirin. J591-488 etiketli MDA hücreleri ile 5 ml şırınga doldurun ve kabarcıkları giderin.

4. PCa'nın Hastalarda Anti-PSMA'ya (J591-488) Etiketli KTC Zenginleştir hazırlanması

1. (Sodyum sitrat ihtiva eder), bir mavi kapak tüp içinde prostat kanseri hastalarından alınan 7.5 ml kan toplamak. Yavaşça% 0.1 BSA / 1 mM EDTA / PBS içinde kan 1:01 seyreltin.
2. 5.3 ml Ficoll-Paque Plus 50 ml konik bir tüp içinde ekleyin. Katman Ficoll Paque üstünde kan seyreltilmiştir. 30 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj.
3. Ön kaplama, tüm tüpler veya uçlarına% 2 FBS/RPMI-1640 / 1 mM CaCl _2/4 mM _MgCI2 yüzeylerine kapalı zaman eğrileri non-spesifik bağlanma önlemek için (R / S tamponu) ile kapalı zaman eğrileri ile temas. Kapalı zaman eğrileri ile temas eden ortam ve tampon içinde, 4 ° C sıcaklığı muhafaza edin.
4. Periferal kan tek çekirdekli hücre (PBMC) fraksiyonu toplamak30 ml R / S tampon ihtiva eden bir 50-ml konik bir tüp içinde arabirimden CTCS ihtiva etmektedir. 8 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj.
5. Pelet yeniden süspanse edin ve 8 dakika boyunca 400 x g'de R / S tampon maddesi içinde tekrar yıkayın. Santrifüj işleminden sonra H / H tampon içinde pelletini. Karanlık bir yerde, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 20 ug / ml 'de anti-J591 PSMA-488 antikor ekleyin.
6. 30 dakika sonra, 5 dakika boyunca 800 x g'de J591-488 etiketli CTCS içeren PBMC santrifüj. H / H tamponunda süspanse. Numune ile bir 1 ml şırınga (R / S tampon maddesi ile önceden kaplanmış) doldurun.

5. Mikroskop hazırlanması, Şırınga pompası ve Akış Odası Meclis

1. Ters mikroskop açın ve 10X objektif de Kohler aydınlatma ayarlayın. Mikroskop örnek aşaması ile aynı seviyede şırınga pompası getirin ve 1 din / cm ² kesme stresi (~ 10 ul / dak) olarak ayarlayın.
2. Zeiss Axiovision yazılımını açın. Bilgisayar ekranında hedefi seçin. Yeni Oluşturyazılım araçları seçeneği altında klasör.
3. Axiovision akıllı deneyler seçeneğini açın ve 30 dakika boyunca kısa 30 sn video kayıt ayarlarını.
4. Canlı floresan video, görüntü seçenekleri-12 msn Pozlama, 2 x 2 bin, 5 Kazancı ayarlayın. Bu parametreler Zeiss MRM kamera ile video kare oranı (~ saniyede 23 kare) yakın videoları ulaşmada yardımcı olur.
5. , Bilgisayar ekranında 10 X objektif de akış kanalı tam genişliğini görselleştirmek bir C-mount adaptörü (0.63 xf/60 mm Arayüz) kullanın.
6. Cıvalı lamba açın.
7. Şırınga pompa üzerine şırınga ve hücreleri ihtiva eden konektörü yerleştirin.
8. Bring IL-1β inkübatör HUVECler uyarılır. HUVECler içeren Mikroslayd doldurulmuş giriş kanalı için bağlayıcı takın.
9. Boru bağlı bir bağlantı parçası ile çıkış kanalı bağlayın. Yoluyla akışını toplamak için bir çanak ya da 15 ml konik bir tüp içine boru koyun.
10. Infusi başlayın10 ul / dk 'da Mikroslayd aracılığıyla. Endotel hücreleri ve MDA etiketli hücreler veya epifloresans mikroskopta 488-nm filtre altında hastalardan türetilen etiketli kapalı zaman eğrileri arasındaki etkileşimi dikkate alınmalıdır.
11. 30 sn kısa videolar gibi deney kaydetmeye başlayın. Oynatma analiz sırasında, haddeleme hızını ölçmek. Haddeleme hız zamanla hücreler tarafından kat edilen mesafenin bölünmesiyle ölçülür.

Mikroslayd 6. Immün

1. 10 dakika boyunca, IL-1β uyarımlı HUVEC hücreleri MDA perfüze sonra Mikroslayd giriş ve çıkışından Ortamı çıkarın.
2. 200 ul ucunu kullanarak, 5 dakika boyunca Mikroslayd girişine kalsiyum ve magnezyum ihtiva eden ılık (37 ° C) PBS koydu. Bankta bir pervane gibi onun kapağını kullanarak mikroslayd eğin. İmmunosteyn sırasında tüm inkubasyon için bir eğik pozisyonda mikroslayd tutun.
3. Girişine sıcak% 2 formaldehit delinmesiyle HUVECler Fix
4. oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. 5 dakika her biri için iki kez PBS ile yıkayın.
5. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içerisinde% 5 BSA içinde triton-X-100 (% 0.1) ilave edin.
6. 5 dakika her biri için iki kez PBS ile yıkayın. 30 dakika boyunca PBS içerisinde% 5 BSA ile bloke edin.
7. Birincil antikor, keçi anti-inkübe VE-cadherin (1:100),% 2.5 BSA O / N 4 ° C'de
8. Ertesi gün, her biri 5 dakika boyunca PBS ile iki kere yıkayın. 45 dakika boyunca ikinci eşek anti-keçi 647 antikor ekleyin. 5 dakika her biri için iki kez PBS ile yıkayın.
9. 1 saat boyunca insanlaştırılmış J591-Alexa488 konjüge edilmiş antikor ile oda sıcaklığında inkübe edin.
10. 5 dakika her biri için iki kez PBS ile yıkayın. 5 dakika için DAPI ekleyin. 5 dakika için damıtılmış su ile yıkayın.
11. PBS ekleyin (veya uzun süreli depolama için Mowiol). Konfokal mikroskop altında Mikroslayd görselleştirmek.

Sonuçlar

Şekil 1, bu mikroslayd üzerinde EC'ler bir tek tabaka bir O / N kültür gösterir. Şekil 1A döküntü Mikroslayd 100% 70% 10X objektif (Şekil 1B) kullanılarak görülebilir iken, 5X objektif kullanarak görünür olduğunu göstermektedir. E-selektin aracılık ettiği işlemleri için, kenarlarında haddeleme hücre video kayıt ve oynatma analiz için Mikroslayd% 70'den fazlası mevcut kılan olarak kabul edilmez. Bizim tecrübelerimize göre, başlang?...

Tartışmalar

Nedeniyle kan hücreleri arasında kapalı zaman eğrileri düşük sayıda, bu hücre popülasyonu olarak saf CTCS izole etmek güçtür. CTC / EC etkileşimleri çalışmak için, kapalı zaman eğrileri nadir ve saf olmayan nüfus iki büyük zorluklar teşkil etmektedir: Kan hücrelerinin arasında kapalı zaman eğrileri a) belirlenmesi; b) CTC / EC etkileşimlerinin Gözlem.

Kan hücreleri arasında prostat CTCS belirlenmesi ilk sınırlamasını aşmak içi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microslide	Ibidi	80331
Fibronectin	Millipore	FC010
Plastic tubing	Cole Parmer	EW-96115-08
Male Luer adapter	GlycoTech	31-001
Female Luer adapter	GlycoTech	31-001
Syringe pump	Chemyx Inc	Fusion 100
Luer-lock syringe	BD Biosciences	309628
M199 medium	Sigma	M7653
Endothelial Mitogen	Biomedical Technologies	BT-203
HBSS	Sigma	H9269
Anti-PSMA J591-488	Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology
Interleukin-1 beta	Peprotech	200-01B
Trypsin	Millipore	SM-2002-C
Heparin	Sigma	H-3149
HUVECs	Weill Cornell Medical College-Department of Surgery		provided by Marco Seandel
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-5648
10x objective	Zeiss Plan Neofluar
Enzyme free cell dissociation reagent	Millipore	S-004-C
RPMI-1640	Lonza	12-702-F
Ficoll-paque plus	GE healthcare	17-1440-02