Lifli iskelelerinin içine Microspheres ibra Elektroeğirme Büyüme Faktörü

Özet

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

Özet

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

Giriş

Sinir doku mühendisliği devam eden zorluklardan biri sinirleri doğal olarak yetişen hücre dışı matris, taklit eden bir sinir kanalı (NC) yaratıyor. Araştırma hücreler, mekanik, topografik, yapışkan ve kimyasal sinyaller dahil olmak üzere ^1-3 ortamında birçok faktöre yanıt göstermiştir. Bu alandaki başlıca sorunlardan biri, sinyallerin uygun kombinasyonunu belirlemek ve hücre büyümesini desteklemek için ⁴ uzun bir süre boyunca muhafaza ipuçlarını bir sistem imal edilir. Çevresel nöronlar yumuşak alt-tabakanın tercih ettikleri bilinmektedir hizalanır lifler tarafından yönlendirilebilir ve sinir büyüme faktörü (NGF) ^5-7 yanıt. Hafta boyunca kimyasal ipuçları sağlayabilir NC'ler yakın allogreftlere, sinir onarımı ^8,9 güncel altın standardın için geliştirilmiş fonksiyonel iyileşmeyi sağlamak için gösterilmiştir.

Malzemeler ve üretim yöntemleri, çeşitli mekanik ve topografik üretmek için kullanılabilirdiğerleri ^10-13 işaret eder. Mekanik ipuçları ^1,13 kritik uygulama için uygun malzeme seçimi yaparak, seçilen malzeme doğasında vardır. Üretim yöntemleri topografik ipuçları faz ayrılması, öz-montaj ve ^1,13 electrospinning dahil kontrol etmek. Mikro uygulamalar, mikroflüidik, photopatterning, dağlama, tuz halindeki salamuralar, köpükler ya da gaz için, aynı zamanda ^14-17 kullanılabilir. ELEKTROSPİNNİNG nedeniyle esneklik ve üretim ^13,18-23 kolaylığı doku kültürü için elyaflı alt mühendisi en popüler yolu olarak ortaya çıkmıştır. Electrospun nanolifler kendini püskürtmek ve boşaltmak için ^24, kısa bir aralık üzerinden germek için neden olan polimer solüsyonuna, bir yüksek voltaj uygulanarak imal edilmektedir. Bir hizalanmış iskele topraklanmış döner mandrel üzerine elyafların toplanması ile oluşturulabilir ve bağlantısız iskeleler ve durağan bir plaka ²⁵ üzerinde toplanır. Yapışma sinyal elyaflı skafold wit kaplanması ile elde edilebilirs fibronektin veya ²⁶ electrospinning önce HA gibi RGD gibi bir yapışma peptidi, konjuge.

Onlar kontrollü salım için bir kaynak gerekiyor çünkü bu tür büyüme faktörleri gibi kimyasal sinyalleri, uzun dönemler boyunca korumak için en zor. Birçok sistem başarı çeşitli düzeylerde ile electrospun lifli ağlara kontrollü salımını eklemek için denenmiştir. Bu yöntemler harman elektrospinning, emülsiyon elektrospinning, çekirdek-kabuk elektrospinning ve protein konjugasyon ²⁷ içerir. Buna ek olarak, elektro geleneksel olarak bu nedenle proteinin biyo kabul edilmelidir muhafaza, proteinin ²⁸ canlılığını etkileyebilen uçucu bir çözücü içinde yapılır.

Bu yaklaşım, özellikle periferik sinir büyüme için ayarlanabilir bir iskele oluşturmak için mekanik, topografik, kimyasal ve yapıştırıcı sinyalleri birleştirerek giderir. İskele mekanik tam sentetize edilmesi ile kontrol edilirMetakrilatlanmış Hyaluronik Asit (HA). Methacrylation siteleri fotoğraf reaktif crosslinkers bağlamak için kullanılır. Çapraz malzeme artık suda çözünür ve münhasıran enzimler ²⁹ tarafından bozuldu. Çapraz bağlama miktarı degradasyon oranı, mekanik ve malzemenin diğer fiziksel özelliklerini değiştirir. ~ 500 Pa arasında bir gerilme modülüne sahiptir methacrylation% 30 ile HA kullanılarak, sinir dokusunun doğal mekanik yakındır ve tipik olarak nöronlar ^26,29 tercih edilen yumuşak bir alt-tabakayı oluşturur. Dönen mandrel üzerinde Elektrospinning topografik bir işaret sağlayacak şekilde ayarlanır lifleri oluşturmak için kullanılır. Ile birlikte mikro-elektrospinning kullanma süreleri zarfında iskele içinde kimyasal sinyaller sağlar. Kimyasal sinyali oluşturmak için kullanılan NGF içeren nörit büyüme mikroküreler desteklemek için. NGF üretimi sırasında zorlu çözücüler karşılaşmasa bu yüzden çoğu electrospun malzemelerin aksine HA su içinde çözünür. SCA, yapışkan bir sinyali eklemek içinffold fibronektin ile kaplanır. NGF fibronektin (yapıştırıcı) ile kaplanmış mikroküreler (kimyasal) bırakmadan yumuşak (mekanik) hizalanmış (topografik) lifler: tamamlandı sisteminin yukarıda açıklanan sinyalleri dört türlerini içerir. Üretim ve bu sistemin test bu protokolü tarif edilmiştir.

Proses, bir su-içinde-yağ-içinde-su emülsiyonu ile çift mikrosferlerin üretimi ile başlar. Emülsiyon, bir yüzey aktif madde, polivinil alkol (PVA) ile stabilize edilir. İç su fazı protein içerir. Bu diklorometan (DCM) içinde çözüldü PLGA kabuk malzeme içeren, yağ fazına ilave edilir olarak, yüzey aktif madde DCM proteini koruyan fazlar arasında bir bariyer oluşturur. Bu emülsiyon, mikro kürelerin dış yüzeyini oluşturmak için polivinil alkol içeren bir su fazı içinde dağılmış daha uzundur. Kararlı bir emülsiyon, DCM buharlaşmasını sağlamak için karıştırılır. Durulama ve liyofılleme sonra kuru mikroküreler cont ile bırakılır, geri kalan proteini.

Mikroküreler tamamlandıktan sonra onlar iskelelerinin içine electrospun hazırdır. Öncelikle elektro solüsyon hazırlanır. Solüsyonun viskozitesi uygun elyaf formasyonu için çok önemlidir. Saf HA Çözümleri Bu zorunluluğa uymayan; PEO üretebilmektedir izin vermek için bir taşıyıcı polimer olarak ilave edilir. Bu mikrosferler, mikro-dağılmış olan elyaflı yapı iskeleti sonuçlanan çözeltisi ve electrospun eklenir.

Üretim işlemi tamamlandıktan sonra, protein, varlığını doğrulamak için test edilmelidir. Bunu yapmak için, NGF'ye tepki veren bir birincil hücre kullanılabilir. Bu protokol, 8-10 günlük tavuk embriyolarından sırt kök gangliyon (DRG) kullanır. Hücre demetleri NGF veya boş olanlar ile dolu küreleri içeren iskelelerinin üzerine ekilir. NGF hala canlı olup olmadığını NGF içeren iskelelerde gelişmiş akson büyümesini görmelisiniz. NGF artık geçerli değilse o olacakdeğil genişletmek için nevritlerle teşvik ve denetime benzer görünmelidir.

Burada tarif edilen prosedür, kesin malzeme basit değişiklikler, electrospinning yöntemi ve sistemi, çeşitli doku ve hücre tipleri için optimize edilebilir proteinleri ile, ancak, sinir destek üzerinde odaklanmıştır.

Protokol

1. Su / Yağ / Su Çift Emülsiyon Mikroküre Üretimi

1. Üretim ve% 2 iyonu giderilmiş suda bir polivinil alkol (PVA) v çözeltileri% 0.5 a / hazırlar. Berrak olana kadar 50 ° C de karıştırdıktan çözüm, bu birkaç saat alabilir. Deiyonize su içinde% 2 h / h İzopropil Alkol içinde bir çözeltisi hazırlandı.
2. Arzu edilen hidrofilik, proteinin bir sulu çözelti hazırlayın. Aşağıdaki tablo, örnek formülasyonları sağlar.

Tablo 1:. Örnek Protein Çözümleri aşağıdaki protein çözümleri başarıyla kapsüllü ve electrospun bu protokolü kullanarak edilmiştir. Gerektiğinde diğer hidrofilik, protein çözeltileri kullanılabilir.

3. 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içine% 0.5 PVA çözeltisi 40 ml yerleştirin ve bir kenara.
4. 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde 65:35 300 mg 'poli 3 ml diklorometan (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA). , Bir girdaplı karıştırıcı PLGA çözünmesini hızlandırmak için kullanılabilir.
5. Protein çözeltisi ve 200 ul% 2 PVA-çözeltisinden 4 ul birleştirin. PLGA solüsyonu içine dökün protein (1.4 adım). Çözümler çoğunlukla ayrı kalacaktır.
6. Buzlu su içeren bir deney kabı içine tüp yerleştirin. ~ 10 Watt (RMS) bir değnek sonikator kullanarak, bir üniforma kremsi beyaz emülsiyon oluşturulur kadar bir kaç saniye (5-10) için çözüm çalkalayın.
7. % 0.5 PVA (adım 1.3) ihtiva eden 50 ml'lik bir tüp içine emülsiyonu dökün. ~ 20 saniye boyunca bir vorteks mikserde yüksek hızda çözüm karıştırın. Çözelti bulanık bir görünüm geliştirecektir.
8. 2 dakika boyunca 350 rpm'de bir karıştırma plakası üzerinde 200 ml'lik bir cam ve yere emülsiyonu aktarın. Karıştırma plakası üzerinde beher% 2 izopropil alkol 50 ml ilave edilir. Karışım sertleştirmek üzere DCM buharlaşmaya izin vermek için 1 saat içinde ve en az bir PLGA için karıştırma devam etmesini sağlar.
9. Transferi to santrifüj tüpleri içine mikro-küre çözeltisi.
10. 3 dakika boyunca 425 x g'de santrifüj. Mikro küreler, bu tüpün altında toplanır ve beyaz görünür. Dikkatlice mikrosferler üzerinde tüpten çıkarın ve 500 ml'lik bir şişe içinde depolar.
11. Tam tüpü üç çeyreği doldurulması ve sıvı içindeki mikro küreleri dağıtmak için sallama ile, iyonu giderilmiş su ile mikro küreleri durulayın.
12. Tekrar 1.10 ve 1.11 dört kez yineleyin.
13. Son durulama sonra, diğer örnekleri ile 500ml şişe içinde tekrar yer supernatant çıkarın. Daha sonra en az 24 saat boyunca liyofilize, santrifüj tüpü içinde toplanmıştır küreleri dondurun.
14. Bir ışık mikroskobu altında veya bir Taramalı Elektron Mikroskobu ile mikroküreler gözünüzde canlandırın. 60 um'den daha büyük olmayan bir mikro-etkili üretebilmektedir içindir. Mikro-küreler çok büyük olursa, uzun sonikasyon veya girdaplama kere adım 1.6, 1.7 ya da gerekli olabilir.
15. -20 ° C derin dondurucuda kurutulmuş mikroküreler saklayın.
16. Opsiyonel: Aşama 1.10 ^30'dan 500ml şişe içinde protein miktarı test etmek için, üreticinin talimatlarına göre, bir protein deneyi kullanın. Bu mikro-kapsüllenmiş protein üretim sürecinde kullanılan ne çözeltide miktarının çıkarılması ile yüzde hesaplamak için kullanılır.

. Mikrosferde protein yer PLGA solüsyonu ³¹ ml x 2 Rhodamine ug / ekleyin ve bir FITC konjüge protein kapsüllemek görselleştirmek için 1 bir örneğini göstermektedir: Not.

Mikrokürelerin 2. Elektrospinning

1. Önceki elektro çözeltisinin hazırlanması için, 37 ° C sıcaklıkta eritilmesi ile, iyonu giderilmiş su içinde foto-başlatıcı bir% 0.5 w / v solüsyonu oluşturmak. Bu işlem birkaç saat sürebilir.
2. Hyaluronik asit (Meha) metaakrilat karşı ^29,% 3 (Burdick ve ark. Sentez için bakınız) w / 2% oluşturma/ hac 900 kD poli (etilen oksid) (PEO) ve% 0.05 w / v, deiyonize su içinde foto başlatıcı ağırlık solüsyonu.
   1. İstenen hacme için Meha ve PEO doğru miktarını hesaplayın. Örneğin, çözelti, 10 ml electrospinning Meha, 200 mg ve 300 mg PEO gerektirir.
   2. Istenen son hacminin (9 Bu örnek için mi)% 90 deiyonize su içinde çözülür PEO. Bu işlem birkaç saat sürebilir, 37 ° C'de ısıtılmış bir karıştırma plakası veya su banyosu işlemi hızlandırmak için kullanılabilir.
   3. Sonraki Meha ekleyin ve berraklaşana kadar karıştırın çözelti üzere, bir girdaplı karıştırıcı kullanılır. Bu sadece bir kaç dakika sürer.
   4. Son olarak geriye kalan% 10 hacim (bu, örneğin, 1 mi) doldurmak üzere% 0.5 foto başlatıcı çözeltisi ekleyin.
3. 400 mg / ml kadar, istenen yoğunlukta mikro küreleri ekleyin. Bu mikrosferler, eşit çözelti içinde dağıtılır kadar vorteksli bir mikserde çözüm karıştırın.
4. Bir şırıngaya çözüm aktarın ve 6 inç ve 18 kalibrelik bl iliştirmekulastırınız ucu iğne.
5. Bir şırınga pompası şırınga ve 1.2 ml / saat olarak dağıtmak için ayarlanmış.
6. Toplama plakası ya da bir mandrel üzerine bir alüminyum folyo tabakası bantlayın. Bu bitmiş skafoldun kolay temizlemek ve saklanmasına olanak vermektedir. Bir dönen mandrel uyumlu lifleri oluşturmak için kullanılır. Düz bir plaka ya da hareketsiz mandrel rasgele düzenlenmiş fiberlerin sonuçlanacaktır.
7. Toplama aparatı ile yüksek gerilim güç kaynağından topraklama kablosu bağlayın. Iğne pozitif kablosunu bağlayın.
8. Iğne ucu ve toplama yüzeyi arasında 15 cm olacak şekilde şırınga pompası ve bir toplama yüzeyi ayarlayın.
9. Çözüm şırınganın ucunda görünür olduğunda, polimer pompalama başlatın, gerilim kaynağı açmak ve 24 kV DİKKAT gerilimini ayarlamak:. Sisteminin herhangi bir metal parçası dokunmayın üzerindeki gerilim açıldıktan sonra. Şarj ayrıca cilde elektrikli parçalardan kısa mesafelerde atlayabilir.
10. D kadar çözüm çalıştırınesired iskele kalınlığı elde edilir. Tam bir gerilim kaynağı ve şırınga pompası kapattığınızda.
11. Iskele ekli ile folyoyu çıkartın. Tamamlanan proteini içeren iskeleler -20 ° C dondurucu içinde saklanır.

3. Protein biyoaktivitenin test edilmesi

1. Hücre kültürü ortamı hazırlayın. Ekleme,% 10 h / h Fetal Sığır Serumu Dulbecco Modified Eagle Medium,% 1 h / h, L-glutamin, ve% 1 hacim / hacim Penisilin-Streptomisin.
2. Bir plaka tamamen içine sığacak seçiniz cam lamelleri.
3. Üretici tarafından tarif edildiği gibi tedavi etmek için lamelleri 3-(trimetoksisilil) propil metakrilat kullanın. Methacrylation lamelleri iskele bağlılığı artırır.
4. Electrospinning önce çıkarılabilir çift taraflı bant ile electrospinner toplanma alanına metakrile lamelleri takın. Lamelleri üzerine İplik işleme ve görüntüleme kolaylaştırır.
5. Yukarıda tarif edildiği gibi arzu edilen kalınlığına Electrospin.
6. Biryıkıldıktan sonra dikkatlice mandrelinden lamelleri çıkarın elektrospinning. Net azot odasına İSKELE kaplı lamelleri yerleştirin ve tüm oksijen temizlendi olduğundan emin olun.
7. 15 dakika boyunca, 10 mW / cm ^2, 365 nm ışık altında haznesi ve iskele yerleştirin. Uygun büyüklükte plaka içine bir yer çapraz bağlama sonrası. Iskele tarafı yukarı dönük olduğundan emin olun.
8. 30 dakika boyunca bir antiseptik lamba altında Yer iskelelerinin sterilize etmek. İstenen fibronektin ya da diğer protein hücre yapışmasını geliştirmek için bir kaplama olarak kullanılırsa. Kat iskelelerinin için üreticinin talimatlarına uyun.
9. Hasat Dorsal Kök Ganglia (DRG) gibi daha önce Hollenbeck ³² tarafından tarif. Bir DRG test edilen her iskele kaplı lamel için gerekli olacaktır.
10. Oyuklu bir plaka içerisinde her bir platform üzerinde ortam 100-200 ul koyun. Dikkatlice ortam damlacık her bir platform üzerinde bir DRG yerleştirin. Kalın İskele için daha fazla medya gerekli olabilir; DRG tamamen batık ve FLOA değil gerekirting.
11. Hücre iskeleti iskelesine yapışmasının sağlanması için 4 saat boyunca 37 ° C'de iskele ve DRG inkübe edin.
12. Kuyunun için uygun seviyeye medyayı doldurun ve geri kuvöz içine yerleştirin. 4-6 gün inkübe devam edin.
13. İnkübasyon süresinden sonra, dikkatli bir şekilde, her bir oyuktan ortamını çıkarın ve hafifçe bir kez PBS ile yıkayın. / Hac% 4 paraformaldehid ağırlık ile 30 dakika boyunca hücreleri saptamak.
14. Nörofilament bir antikor leke kullanılarak Leke hücreleri. Bu ölçümü için nörit büyümesinin görselleştirme sağlayacaktır. DAPI ayrıca hücrelerin çekirdekleri görüntülemek için kullanılabilir. Bir örnek boyama protokolü Sundararaghavan ve arkadaşları ¹⁴ tarafından tarif edilmiştir.
15. Bir floresan mikroskop kullanılarak hücrelerin görselleştirmek.
    1. Mikroskop sahnede plaka yerleştirin.
    2. DAPI'nin için filtre ve uyarma ayarları kullanarak hücre kitlesini bulun.
    3. Hücrenin kez genişletilmiş nevritlerle görselleştirmek için FITC'ye için filtreyi geçiş olduğunu. Utoplamak ve tüm yapıyı görmek için gerekli olduğunca çok fotoğraf birleştirmek mikroskop dikiş fonksiyonu şarkı. DAPI'nin, FITC'ye ve parlak bir alan için tekrarlayın.

Sonuçlar

85 üzerinde% protein kapsülleme çapında mikroküreler ± 14 mikron 50 sürekli üretilen ve iskeleler içine electrospun edilmiştir. Ebat üç ayrı üretim serisi ikinci mikro-örnekleri görüntüleme ile saptanmıştır. Ticari laboratuar yazılımı kullanılarak ölçülür bir optik mikroskop ve uzunlukları üzerinde tutulmuş ve görüntüler. Şekil 1 boyut dağılımının bir histogramı gösterir. Encapsulation oranı da üretim sürecinde kaçan protein miktarının tarafından, üç a...

Tartışmalar

Birçok çalışma, sinir hücreleri, topografik ipuçlarının (fiber hizalama) ve kimyasal uyaranlara (büyüme faktörleri) ^1,2,10,11,35 yönettiği edilebileceğini göstermiştir. Elektro uyumlu lifleri oluşturmak için, basit bir yöntemdir. Büyüme faktörleri, sinir büyüme ancak sinir boruları (NC) içine dahil etmek için, uzun süreli salınımı için bir yöntem gereklidir ediyoruz. Her iki ipuçları ile daha sağlam bir sistem oluşturmak için, bu iki sinyal kombine edilmelidir. Çeşitli ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Invitrogen	D1306
Irgacure 2959	BASF	24650-42-8	Protect from light
PEO 900 kDa	Sigma-Aldrich	189456
Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B	Polysciences, Inc.	23591-100	Prepare stock solution in DMSO
Syringe Pump	KD Scientific	KDS100
Power Source	Gamma High Voltage	ES30P-5W
Motor	Triem Electric Motors, Inc	0132022-15	Must attach to a custom built mandrel
Tachometer	Network Tool Warehouse	ESI-330	Use to monitor mandrel speed
Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter	EXFO	S1000
Needles	Fisher Scientific	14-825-16H
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-81
Polyvinyl Alcohol	Sigma-Aldrich	P8136-250G
Isoporopyl Alcohol	Sigma-Aldrich	I9030-500mL
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP9703-100
BSA-FITC	Sigma-Aldrich	080M7400
β-Nerve Growth Factor (NGF)	R&D Systems	1156-NG
65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA)	Sigma-Aldrich	1001554270
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	34856-2L
Coomassie (Bradford) Protein Assay	Thermo Scientific	1856209
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate	Sigma-Aldrich	1001558456
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F2006
DMEM	Lonza	12-604F
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
PBS	Hyclone	SH30256.01
Glutamine	Fisher Scientific	G7513
Pen-Strep	Sigma-Aldrich	P4333
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	A11313