JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Özet

Memeli kortekste, nöronlar son derece karmaşık ağları ve sinaps bilgi alışverişi oluşturur. Sinaptik gücü, hem de sinaps ekleme / kaldırma değişiklikleri, nöronal plastisite yapısal temel sağlayan, bir deneyim bağımlı bir şekilde meydana gelir. Kortekste en uyarıcı sinapsların postsinaptik bileşenleri olarak, dendritik dikenler sinaps iyi bir vekil olarak kabul edilir. Fare genetik ve floresan etiketleme teknikleri, bireysel nöronlar ve bunların sinaptik yapılarının alarak avantajları sağlam beyinde etiketli olabilir. Burada in vivo zamanla floresan etiketli postsinaptik dendritik dikenler takip için iki-foton lazer tarama mikroskobu kullanarak bir Transkranial görüntüleme protokolü tanıtmak. Bu protokol sağlam kafatası tutar ve menenjlerin maruz kalma ve korteks tarafından kaynaklanan inflamatuar etkileri ortadan kaldıran inceltilmiş-kafatası hazırlık, kullanır. Bu nedenle, görsel su sonra hemen elde edilebilirrgery gerçekleştirilir. Deneysel prosedür saat yıla kadar değişen çeşitli zaman aralıklarında tekrar tekrar yapılabilir. Bu preparatın Bu uygulama aynı zamanda, fizyolojik ve patolojik koşullar altında, değişik bölge ve kortikal katmanları, hem de diğer hücre türlerini araştırmak için genişletilebilir.

Giriş

Memeli korteks duyusal algı ve hareket kontrolü soyut bilgi işleme ve biliş, birçok beyin fonksiyonları katılır. Çeşitli kortikal işlevleri nöronların farklı iletişim ve bireysel sinaps bilgi alışverişi oluşur farklı sinirsel devreler, üzerine inşa. Sinapsların yapısı ve işlevi sürekli deneyimleri ve patolojiler yanıt modifiye ediliyor. Olgun Beyinde, sinaptik plastisite oluşumu ve fonksiyonel bir nöral bakımında önemli bir rol oynayan, kuvvet değişiklikler ve sinaps ekleme / kaldırma hem şeklini alır. Dendritik dikenler, memeli beyninde uyarıcı sinapsların çoğunluğunun postsinaptik bileşenleridir. Sürekli ciro ve dikenler morfolojik değişimler sinaptik bağlantıları 1-7 modifikasyon iyi bir göstergesi olarak hizmet inanılmaktadır.

Iki-fotonlu lazer tarama mikroskopi kalın, opak hazırlıkları ve sağlam 8 beyin canlı görüntüleme için uygun hale düşük fototoksisite aracılığıyla derin nüfuz sunuyor. Floresan etiketleme ile birlikte, iki-foton görüntüleme yaşayan beyin içine gözetleme ve yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip bireysel sinapsların yapısal reorganizasyon takip için güçlü bir araç sağlar. Çeşitli yöntemler, canlı görüntüleme 9-13 için fareler hazırlamak için kullanılmıştır. Burada, biz fare kortekste postsinaptik dendritik dikenler yapısal plastisite araştırmak için in vivo iki foton görüntüleme bir inceltilmiş-kafatası hazırlanmasını açıklar. Bu yaklaşımı kullanarak, bizim yeni çalışmalar, floresanla işaretlenmiş alt-nöronal ve in vivo etiketleme teknikleri hızlı bir gelişme ile transgenik hayvanların artan durumu ile öğrenme, motor beceri tepki olarak dendritik omurga değişikliklerin bir dinamik resim tasvir var, burada açıklanan benzer prosedürler de uygulanabilir araştırılmakte başka hücre tipleri ve kortikal bölgelerinde, diğer manipülasyonlar ile birlikte, hem de 16-23 hastalık modellerinde kullanılmıştır.

Protokol

Onay cerrahi ve görüntüleme araştırmanın başlamasından önce eve kurumlardan elde edilmesi gerekmektedir. Bu yazıda anlatılan deneyler University of California, Santa Cruz Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapıldı.

1. Cerrahi

  1. Tüm cerrahi aletler otoklav ve iyice ameliyat öncesi% 70 alkol ile çalışma alanını sterilize.
  2. KX anestetik çözeltisi (200 mg / kg ketamin ve 20 mg / kg ksilazin) intraperitonal (IP) enjeksiyon ile fare anestezisi fare vücut ağırlığına göre Not:. KX doz sağlık durumu suşu, yaşa göre ayarlanmış edilebilir ve Farelerin. Optimum dozun belirlenmesi için veteriner danışmanlık da tavsiye edilir.
  3. Farenin ayak basarak ve anestezi durumunu izlemek için refleksif bir tepki için kontrol ederek periyodik bir ayak tutam testini gerçekleştirin.Fare tamamen ameliyat başlamadan önce anestezi emin olun Not:. Uzun görüntüleme oturumları sırasında, gerekirse ek KX yönetmek, periyodik fare anestezi durumunu kontrol edin.
  4. Ameliyat sırasında vücut ısısını korumak için bir ısıtma pedi üzerinde fare yerleştirin.
  5. Kafa derisi maruz bir jilet kullanarak fare başını tıraş.
  6. Alkol pedleri ve betadine alternatif ile cildi silerek traş alanı sterilize edin. Herhangi bir kalıntı saç kupürleri çıkarın.
  7. Yavaşça bu nedenle deney sırasında dehidratasyon neden olduğu kalıcı hasarı önlemede, hem gözleri yağlamak için göz merhemi uygulanır.
  8. Kafa derisinin orta hat boyunca düz bir kesi yapmak ve kafatasının kenarlarına doğru yanal cildi taşıyın.
  9. Kafatasına bağlı bağ doku çıkarın.

2.. Inceltilmiş-kafatası Hazırlık

  1. Ster dayalı görüntüleme bölgeyi tespit. eotaxic koordinatlar Not: büyük kan damarları, blok ışık penetrasyonunu önlemek ve görüntülü yapıları bulanıklık çalışın. Kafatası steril tuzlu su ile nemli olduğunda damarsal iyi görülmektedir.
  2. Kafatasının (0.5-1.0 mm çapında) ince bir dairesel bölgeye yüksek hızlı mikro matkap kullanın. Yerine kafatası karşı tutarak ve bastırarak yerine, kafatası yüzeyi matkap paralel hareket. Matkap dış kompakt kemik tabakası ve orta süngerimsi kemik tabakası hem kadar kaldırılır Not:. Aşırı ısınma nedeniyle zarar görmesini önlemek için, matkap ile kafatası arasındaki uzun süreli temasından kaçının.
  3. Matkap-inceltilmiş bölgenin merkezinde bir mikrocerrahi bıçak ile iç kompakt kemik tabakası inceltme devam edin. Bir eşit yaklaşık bir kalınlığı olan küçük bir bölge (200-300 mikron çapında) inceltilmiş kadar kafatası karşı basmadan kafatası kazımak için yaklaşık 45 ° 'lik bir açı ile mikro bıçak tutunly 20-30 mikron elde edilir. . Nedeniyle kafatasının bir oto-floresan için, kalınlığı iki foton mikroskop altında Not kafatasının üst ve alt yüzey arasındaki mesafeyi tarama ile ölçülebilir: en az 20 um bir kalınlığı kafatası iyi bir görüntü kalitesi sağlar, ancak, daha sonraki yeniden görüntüleme oturumları incelme süreci zorlaştırır çünkü bu tavsiye edilmez. Aşırı inceltme önlemek için, kafatası kalınlığı (Tartışma) ameliyat sırasında periyodik olarak kontrol edilmesi gerekmektedir.

3. Immobilizasyonu

  1. Dikkatle kemik enkaz kaldırmak.
  2. Otoklavlanmış olan steril kafa plakası, merkezi açıklığın her bir kenarında siyanoakrilat yapıştırıcı bir damla (bkz. Şekil 1) koyun. . Açıklığın ortasına Not bulunan inceltilmiş bölge ile kafatası sıkıca kafa plakası tutun: Tutkal, inceltilmiş r karışması durumundakazara egion, mikrocerrahi bıçak ile dikkatlice çıkarın.
  3. Yavaşça kafa plakasının merkezi açıklığın kenarlarına kafatası taraftan deri çekin.
  4. Kafa plakası de kafatası bağlı olduğu kadar, yaklaşık 10 dakika bekleyin.
  5. (Bkz. Şekil 1) tutma plakasının iki yan bloklar üzerinde kafa plaka koyun ve ardından tutma plaka üzerinde fare hareketsiz kafa plakasının kenarları üzerinde vidaları sıkın Not:. Arasında deri ya da bıyık olduğundan emin olun vidaları sıkmadan önce kafa plaka ve blokları. Hayvanın geri hafifçe dokundu zaman iyi bir hareketsiz preparat mikroskop altında, kafatası gözlenebilir bir hareket göstermelidir.
  6. . Polimerleşmemiş tutkal kaldırmak için tuzlu su ile maruz kafatası durulayın Not: polimerleşmemiş tutkal görüntüleri buğulu ve zarar hedeflerini mikroskop gibi, kalan tutkal kaldırmak için önemlidir <./ Li>

4. Görüntüleme

  1. (Bkz. Şekil 2) sonraki görüntüleme oturumlarda görüntülü bölgeyi taşınmaya kullanılan Haritası 1, gibi inceltilmiş bölge ile maruz kafatası damar bir fotoğraf çekin.
  2. Görüntüleme mikroskop altında fare yerleştirin. Epifloresans kullanarak 10X hava objektif altında inceltilmiş alan bulmak ve bakış merkezine ince alanı taşımak.
  3. Kafatasının üst tuzlu bir damla ekleyin ve steril su ile durulanır edilmiş 60X objektif, geçin. Bireysel dendritik dikenler açıkça dendritler boyunca görüntülenmiştir bir bölge seçin. Belirlemek ve epifluorescent görünümü ve damarsal fotoğraf arasındaki damarsal karşılaştırarak Haritada 1 ilgili bölgeyi etiket.
  4. Fluorophores göre Ayarlama iki-fotonlu lazer dalga boyu. Örneğin, YFP için 920 nm; GFP için 890 nm; DsRed ve tdTomato 24 için 1,000 nm.
  5. 2 ile görüntü yığınlarını Edinme60X objektif kullanılarak z-ekseni boyunca um adımlar. Bu görüntü yığını yaklaşık 200 mikron x 200 mikron alanı (512 x 512 piksel) kapsar ve (bkz. Şekil 2) sonraki görüntüleme oturumları sırasında tehcir için 2 Haritası olarak kullanılır.
  6. 3X dijital zoom kullanarak 2 Haritası içinde dokuz görüntü yığınlarını edinin. . Her bir görüntü yığını z ekseni boyunca not 0,7 um adımlarla 70 um x 70 um (512 x 512 piksel) yaklaşık bir alanı kaplamaktadır: fototoksisite en aza indirmek için örnekler hızda ölçüldüğünde lazerin yoğunluğu 40 mW altında olmalıdır.

5. Kurtarma

  1. Görüntüleme ardından, yavaşça kafatası kafa plaka ayırmak.
  2. İyice kafatası ve tüm kalan tutkal kaldırmak için cilt temizlemek Not:. Ciltte herhangi bir kalan tutkal tahrişe neden ve kafatası üzerinde kalan tutkal kafatasının erozyon ve neden olurken cilt iyileşme yavaşlarngiogenesis yeni yetişen kemik tabakasında, daha sonraki tehcir ve yeniden görüntüleme zorlaştırır.
  3. Kafatası ve tuzlu birkaç kez cildi durulayın.
  4. Steril cerrahi sütür ile kafa derisi dikin.
  5. Ayrı bir kafes içinde bir ısıtma pedi üzerinde hayvan tutun. Post-operatif ağrı azaltmak için deri altına buprenorfin analjezik (0.1 mg / kg) yönetmek. Tam iyileşme sonra eve kafesine hayvan dönün. Kesi iyileşmiş ve dikişler kadar (günde en az bir kez kontrol edin) yakından hayvan izleyin. Gerekirse buprenorfin analjezik sonraki enjeksiyonları yönetmek.

6. Tekrar görüntü

  1. Tekrarlayın 1,1-1,8 adımları.
  2. Tekrar 3,1-3,6 adımları
  3. 1 Harita için damar desen ve 2 Harita için dendritik şube desen karşılaştırarak daha önce görüntülenmiş bölgeyi bulun.
  4. Tekrar görüntü alma 1 hafta içinde gerçekleştirilirse, inceltilmiş yeniden üstüne yeni çıkan kemik ince tabakayı kaldırmak için adım 2.3 tekrarlayınmikrocerrahi bıçak kullanarak dür. Tekrar görüntü alma fazla 1 hafta sonra gerçekleştirilirse, Adım 2.2 ve 2.3 hem de tekrar Not:. Yeni çıkan kemik tabaka azaltılmış resim kalitesine neden orijinal kompakt kemik tabakası ile karşılaştırıldığında, daha az yoğunlaştırılmış bir yapı oluşur. Bu nedenle, aynı kaliteyi elde etmek için, bir önceki görüntüleme oturumu biraz daha ince kafatası için gereklidir.
  5. Daha önce iki foton mikroskop altında görüntü yığınlarını çekilen eşleşme görüntü yığınlarını elde etmek için konumunu ve yönünü ayarlayın.
  6. Adım 4.6 gibi görüntü kazanır.
  7. Tekrar görüntüleme sonra 5,1-5,5 adımları.

Sonuçlar

YFP-H hattı farelerde 25'de, sarı floresan protein kortekstekinden yüzeysel tabakalarına apikal dendrit çıkıntı tabaka V piramidal nöronlar, bir alt grubunda ifade eder. Inceltilmiş-kafatası hazırlık, floresan etiketli dendritik kesimleri hkr saatten ay arasında değişen çeşitli görüntüleme aralıklarında iki foton mikroskop altında görüntülenebilir. Burada bireysel dikenleri yanı sıra filopodia açıkça dendrit boyunca görselleştirilebilen bir 1 aylık fare, motor kortekste ...

Tartışmalar

Başarılı bir inceltilmiş kafatası hazırlık elde etmek için, bu protokolde birkaç adım çok önemlidir. 1) kafatası kalınlığı. Kafatası kemiği, iki yüksek yoğunluklu kompakt kemik tabakaları ve düşük yoğunluklu süngersi kemiğin bir orta tabaka ile, bir sandviç yapıya sahiptir. Yüksek hızlı mikro delme kompakt kemik ve süngersi kemiğin dış katmanlarını çıkarılması için uygun olmakla birlikte, mikrocerrahi bıçak kompakt kemik iç tabaka inceltme için idealdir. Gelişim sırasın...

Açıklamalar

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

Biz grafik gösterim için James Perna teşekkür ederim. Bu çalışma YZ Ruh Sağlığı Ulusal Enstitüsü hibe tarafından desteklenmiştir

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
KetamineBioniche Pharma67457-034-10Mixed with xylazine for anesthesia
XylazineLloyd laboratories139-236Mixed with ketamine for anesthesia
SalineHospira0409-7983-090.9% NaCl for injection and imaging
Razor bladesElectron microscopy sciences72000Double-edge stainless steel razor blades
Alcohol padsFisher Scientific06-669-62Sterile alcohol prep pads
Eye ointmentHenry Schein102-9470Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant
High-speed micro drillFine Science Tools18000-17The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area
Micro drill steel burrsFine Science Tools19007-141.4 mm diameter
Microsurgical bladeSurgistar6961The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone
Cyanoacrylate glueFisher ScientificNC9062131Fix the head plate onto the skull
SutureHavard Apparatus510461Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament
Dissecting microscopeOlympusSZ61
CCD cameraInfinity
Two-photon microscopePrairie TechnologiesUltima IV
10X objectiveOlympusNA 0.30, air
60X objectiveOlympusNA 1.1, IR permeable, water immersion
Ti-sapphire laserSpectra-PhysicsMai Tai HP

Referanslar

  1. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
  2. Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).
  3. Yu, X., Zuo, Y. Spine plasticity in the motor cortex. Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).
  4. Harms, K. J., Dunaevsky, A. Dendritic spine plasticity: looking beyond development. Brain research. 1184, 65-71 (2007).
  5. Segal, M. Dendritic spines and long-term plasticity. Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).
  6. Tada, T., Sheng, M. Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis. Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).
  7. Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).
  8. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  9. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature protocols. 5, 201-208 (2010).
  10. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).
  11. Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature methods. 7, 981-984 (2010).
  12. Szu, J. I., et al. Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging. J Vis Exp. , (2012).
  13. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , (2008).
  14. Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462, 915-919 (2009).
  15. Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo. Nature. 483, 92-95 (2012).
  16. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).
  17. Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).
  18. Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).
  19. Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis. J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).
  20. Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices. Glia. 60, 541-558 (2012).
  21. Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization. Nature. 465, 478-482 (2010).
  22. Kelly, E. A., Majewska, A. K. Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation. J Vis Exp. , (2010).
  23. Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J Vis Exp. , (2010).
  24. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  25. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  26. Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. , (2012).
  27. Zhang, L., et al. Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window. J Vis Exp. , (2012).
  28. Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. , (2012).
  29. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240, 237-246 (2001).
  30. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. , (2010).
  31. Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
  32. Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).
  33. Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression. PloS one. 3, (2008).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 87dendritik omurgafare korteksIn vivoIki foton mikroskopiinceltilmi kafatasg r nt leme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır