Anlamak Basitleştirilmiş kullanma Erken Organogenez<em&gt; In Situ</emIçinde&gt; Hibridizasyon Protokolü<em&gt; Ksenopus</em

Özet

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Özet

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Giriş

The expression pattern of a specific gene is an important piece of information in determining the potential role for that gene in the development of a specific organ or cell type. Simply put, if it is not expressed at the right time and place it is unlikely to play a key role. In Xenopus, as in most early embryos, the most commonly used assay for detecting the expression of a gene is whole mount in situ hybridization using labeled antisense RNA probes. The use of antibody staining to assess expression of a gene in Xenopus is becoming more common as researchers discover antibodies, usually raised against mammalian proteins, that cross react to the Xenopus homologue or generate their own ^1-3. However, the vast majority of studies on Xenopus organogenesis still utilize antisense RNA probes. When antibodies are used, each individual antibody often requires optimization for the primary antibody concentration or fixation protocols. In contrast, the protocol for in situ hybridizations is essentially invariant for different probes. The basic concept is relatively simple and an excellent standard protocol has been well established ⁴. Our protocol is a streamlined version of the original protocol ⁴ that still provides excellent detection of gene expression patterns in the early embryo. The embryos are fixed and then prepared for hybridization by changing solutions and temperatures such that it allows for high stringency binding of the labeled antisense RNA probe to its target mRNA. The unbound probe is washed away and the embryos are then prepared for binding of an antibody against the label on the RNA probes. Excess antibody is then washed away and an enzymatic color reaction is used to localize where the RNA probe is bound in the embryo. There are now a number of Xenopus transgenic lines that drive expression of fluorescent proteins in specific tissues and these are available at the Xenopus stock centers such as the National Xenopus Resource in Woods Hole. While very useful for many experiments that require examining organogenesis in living embryos, this option requires separate housing for the transgenic lines.

In situ hybridization can clearly delineate where specific organs or cell types will form in the early embryo (Figure 1). The technique is remarkably sensitive given that one can detect gene expression in a small number of cells in a single embryo ⁵. However, in situ hybridization using the intensity of colorimetric staining is not considered quantifiable because the color reaction is not a linear one. Despite difficulty in quantifying staining intensity, changes in expression are often quite noticeable; particularly when the in situ hybridization shows quantifiable increases or decreases in the size of expression domains ^6,7.

The clear advantages of whole mount in situ hybridization make it a critical assay in the study of early development. However, it is a time consuming one that requires many steps over several days. This protocol is a simplified version of the standard protocol that eliminates several steps without reducing the quality of the in situ result. The simplification also eliminates sources of variability, making trouble shooting easier if an in situ hybridization is not optimal. Specifically, we have eliminated the use of proteinase K and RNAse treatments of the embryo, two steps that can depend on reagent quality and can also reduce signal intensity if overdone. The protocol also provides some degree of cost saving due to eliminating the use of several reagents. Finally, this protocol also provides some simple guidelines for improved capturing of images of in situ hybridization results. Although this protocol is optimized for work in Xenopus embryos, it is likely that at least some of the simplifications will be applicable to in situ hybridization work in other embryo systems.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Embriyo Hazırlık

1. Embriyo kültürü, pH 8.0 öncesinde tespit ^8% 2.5 sistein kullanarak de-jöle embriyoların bir parçası olarak rutin yapılmadıysa. Kesinlikle gerekli olmasa da daha sonra elle ince forseps kullanarak önce tespite döllenme zarfı çıkarmak için, yararlıdır.
   1. Embriyo transferi için cam Pasteur pipetler kullanın. pipet embriyolar yani bir embriyo almak için yeterince geniş bir noktada cam pipet kesmek için bir elmas kalem kullanın aktarmak için yeterince geniş değil. Hızlı keskin kenarları eritmek için bir Bunsen beki alevi ile kesme ucu geçirerek kestikten sonra pipetler keskin kenarları ortadan kaldırmak.
      NOT: Bakım görsel muayene ile soğutulan görünüyor olsa cam hala yanıklara neden olabilecek kadar sıcak olabilir gibi, alınması gerekiyor.
2. Aşamalarında embriyo tespiti gerçekleştirin. İlk olarak, embriyo tespit kullanılmak üzere cam gibi tüp hazırlanır. Finalde dahil olmak üzere tüm adımlar için bu şişeleri kullanınDepolama. Sürecin her aşamasında embriyoların izlenmesi için izin kapaklı iyi bir teflon conta ile açık şişeleri kullanın. Kalıcı bir kalem kullanarak uygun deneysel bilgilerle şişeleri Etiket ve hatta kalıcı işaretleyici nedeniyle alkol ve diğer çözücülerin kullanımı prosedürü boyunca kaybolur gibi, sonra şeffaf bir bantla etiketi kapsar.
   1. Embriyoların düzeltmek için Mempfa kullanın. Bir seferde 50-100 ml gruplar halinde% 8 paraformaldehit bir stok yapın. Çözelti içine paraformaldehid elde etmek için gerekli olan, 50-60 ° C, gerekli _H2O ve ısı yaklaşık 75% kullanın.
      Not: Bu çözüm formaldehit yerine paraformaldehid kullanır ki Memfa eski yayınlanmış protokol sürümlerinde kullanılan biraz daha farklıdır.
   2. 10N NaOH 2-3 damla ekleyin veya pH kadar 7.5 (pH kontrol etmek kullanım pH kağıdı) yaklaşık. Paraformaldehyde çok zehirli, bu nedenle bir davlumbaz stok çözüm üretmek. Para kezformaldehid çözeltisi içinde yeni bir kap içine Whatman kağıt içinden çözelti filtre edilir ve nihai hacme O _H2 eklenir. Gerekirse, 1-2 hafta boyunca 4 ° C 'de paraformaldehit çözeltisi saklayın.
   3. Mempfa sabitleme çözeltisi (Tablo 1) geri kalan bileşenlerin monte edin. Paraformaldehid nihai çalışma konsantrasyonu% 4 olduğundan emin olun. Stoklar olarak 4 ° C 'de sabitleme çözeltisi tüm bileşenleri saklayın.
   4. Bir kesim cam pipet kullanarak, Mempfa solüsyonu (Tablo 1) yaklaşık 3-4 ml ile dolu olan etiketli cam şişelere embriyolar ekleyerek embriyolar düzeltmek. Vialde fazla 20-30 embriyo tespit kaçının. Embriyo ortamından sıvı transferi minimum embriyolar ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat ya da gece boyunca 4 ° C'de Mempfa çözeltisi embriyolar düzeltildi.
   5. Geç endoderm yapılar için elle izole bağırsak ve endoderm türevleri ^9,10 üzerinde situs gerçekleştirmekProbun iyi nüfuz etmesi için izin verir ve aynı zamanda kavite boyama kaçınan.
   6. -20 ° C'de% 100 metanol ihtiva eden bir çözelti saklayın. Paraformaldehit tespit edildikten sonra, yaklaşık 4 ml -20 ° C, embriyo depolanması için% 100 metanol ile Mempfa çözeltisi değiştirin.
   7. Cam veya diğer embriyolar yapışmasını embriyolar önlemek için metanol ilave edildikten sonra şişeleri çalkalanır. Ayrıca, gevşek ise metanol zamanla dondurucuda buharlaşması nedeniyle flakon sıkıca kapatılmış olduğundan emin olun.
      Not: Embriyolar in situ hibridizasyon kalite kaybı ile boyanmadan önce metanol içinde, muhtemelen daha az bir yıl için depolanmıştır ve üzerinde olabilir.

2. Probe Hazırlık

1. Digoksigenin-işaretli problar için şablon DNA 1-2 ug kullanın. Bir sınırlama ile, ilgi konusu genin 5 'ucunda uygun bir DNA dizisini ihtiva eden kesik plazmid tha için uygun enzimT vektörü antisens sondaları oluşturulur.
   Not: Plazmid uygun bir RNA polimeraz bağlama bölgesi (örneğin, T7, T3, veya SP6) olması gerekir.
2. DNA, su, NTP prob sentez reaksiyonu monte edilmeden önce oda sıcaklığına kadar ısınmaya karıştırmak ve polimeraz tamponu izin verir. Tablo 2'de listelenen sırada, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü RNA sentezi, reaksiyon bileşenlerini ekleyin. Su seviyesini ayarlama 20 ul prob sentez reaksiyonunun toplam hacmi getirmek ekledi. Polimeraz tampona bileşenleri yüksek konsantrasyonlarda ve soğuk hedef DNA zaman uyarabileceği reaksiyon oda sıcaklığında bir araya getirin.
3. 37 ° C'de 2 saat boyunca transkripsiyon reaksiyonu inkübe edin.
   NOT: biraz daha uzun iki saatten İnkübasyonlar hiçbir yan etkilere yol açar, ama aynı zamanda çok az verim artışı göstermektedir. Bir saat süre ile kuluçkalanmıştır ise, verim yine de iyi bir prob için yeterli indirgenmiş fakat edilecektir.
   1. Bitirmek için transkripsiyon reaksiyonu için beklerken, prob kalitesini test etmek için kullanılacak bir agaroz jeli tercih. 1x TAE tamponda 100 ml agaroz 1 ug Erime kaynama noktası, çözeltinin ısıtılması (Tablo 1 e bakınız). Agaroz toz tamamen çözülene zaman ısı çözüm çıkarın.
   2. Agaroz ultraviyole (UV) ışık altında RNA görüntülenmesine olanak vermek üzere yaklaşık 60 ° C'ye soğuduğunda agaroz jeli, yaklaşık 100 ml 2 ul etidyum bromür stok solüsyonu (10 mg / ml) ilave et.
      Not: gelecek jeller tekrar eritmeden dökülebilir, böylece bu agaroz jel çözeltisi, 60 ° C'lik bir kuluçka makinesi içinde tutulabilir. Nedeniyle potansiyel toksisite etidyum bromür ele dikkatli olun.
4. Şablon DNA ortadan kaldırmak için 37 ° C'de bir 10 dakika daha 2 saat inkübasyondan sonra, transkripsiyon reaksiyonu 1 ul DNaseI (RNAse serbest derece) ilave edilir ve inkübe edilir.
5. Reaksiyon karışımı 1 ul çıkarınTE tamponu (10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA), 5M _NH4 Asetat 10 ul ve 220 ​​ul% 1 SDS ve 80 ul% 1 agaroz-TAE jel üzerinde ve geri kalan (20 ul), kontrol soğuk etanol. Vortex karışımı şiddetle ve RNA kalite kontrol sonuçları bilinmektedir kadar buz üzerinde bir kenara.
   1. % 1 agaroz-TAE jel üzerinde çökeltme işleminden önce çıkarılması RNA'nın 1 ul çalıştırın. Jel üzerinde yüklenmesini kolaylaştırmak için su, 4-5 | il ve RNA standart yükleme boyası 1 ul ekle. (Tartışma) prob kalitesini kontrol etmek için bir UV ışık transilluminator'de kullanılarak jel üzerinde RNA görüntüleyin.
6. 10-15 dakika süre ile tam hızda bir mikrosantrfuj eğirme adım 2.5 buz üzerinde bir kenara geri kalan RNA çökeltilmesi. Bir çizilmiş cam pipet ile süpernatant kapalı çizin ve kısaca kurumasını bekleyin.
   1. Eppendorf tüpü içinde RNA melezleme, 1 ml tampon (Tablo 1) ile prob yeniden süspanse edin. Girdap ve briefly tekrar 37 ° C ve girdaba boruyu ısı. 15 ml kap polistiren tüp vida bir prob çözüm aktarın ve RNA hibridizasyon tamponu ile 7-10 ml doldurun. Not: Prob (10 kat daha fazla seyreltme hala iş görebilir) genellikle düşük bir arka plana neden ancak boyama reaksiyonlar da daha uzun sürer daha seyreltilebilir.

In situ Hibridizasyon 3.

1. -20 ° C'de metanol içinde depolanmıştır embriyolar alın ve oda sıcaklığına kadar ısınmasına izin verildi. Cam şişeler içinde tüm prosedürü uygulayın. Bir grup farklı embriyolar farklı prob tarafından baktı olacak olursa, sondalar ilk gününde değişkenliği ve emek azaltmak için eklenir hemen önce kadar bir tek şişede saklayın.
   1. Prob ilave hazırlık Tablo 3 (yıkama tarifleri için bakınız Tablo 1) de tarif edilen bir metanol dizi embriyolar rehidrate. Yavaşça Embry girdapHer değişiklikten sonra os onlar tarafta veya birbirlerine yapışmasını değil emin, ve bir nutator şişeleri montaj embriyolar rock. Sıvıları aktarırken, embriyolar orada sıkışıp değil emin olmak için kapaklar içini kontrol edin.
   2. Tablo 3'te tarif edildiği gibi prob çözeltisi içinde bir kez, bir gece boyunca embriyolar hibridize olur.
2. Prob çözüm çıkarın. 15 ml saklayarak kullanılan prob kaydet -20 ° C'de tarih ve prob kullanılmıştır kaç kez ile işaretlenmiş kap polistiren tüp, vida.
   NOT: kolorimetrik reaksiyonlar istenilen yoğunluğu ulaşmak için anormal uzun zaman almaya başlayana kadar aynı prob yerinde döllemeler sonraki birçok kez tekrar edilebilir.
   1. Prob çıkarıldıktan sonra, Tablo 4'te açıklanan yıkama dizi prob karşı antikor lekelemesi için embriyolar hazırlayın. Sıcaklık değiştirme t hareket ettirerek (Tablo 4) gerektiğindedoğrudan uygun sıcaklığa ayarlanır melezleme fırınlarına bağlı embriyoların şişeleri ile o nutator.
   2. MAB uygun hacimde Makyaj + HTSS + br + embriyolar antikor ilave edilmeden önce bloke olmasına neden olur + HTSS + br bloke etme çözeltisi MAB inkübe edilmektedir, o zaman, anti-Dig antikoru (Tablo 4) embriyolar. Kullanım gününde engelleme çözümleri taze olun.
3. Antikor çözeltisini çıkarın ve antikor ile gece boyu inkübasyondan aşağıdaki Tablo 5'te belirtildiği gibi yıkama başlar. Alkalin fosfataz alt-tabaka ile boyama için hazırlama ve mümkün olduğu kadar arka planı azaltmak için en az on iki 30 dakika yıkama yapın. Yıkama adımları için, MAB tampon veya TBT çözeltisi (Tablo 1) kullanın.
   NOT: TBT çözümü 2 mg olan TTW olduğunu / BSA ml.
   1. BM Mor alkalen fosfataz substrat ile son yıkama solüsyonu değiştirin. Boyama REAC gerçekleştirinOda sıcaklığında veya 37 ° C ya da manda.
      Not: Boyama 37 ° C'de daha hızlıdır, ancak, gece boyunca bırakılırsa, kabul edilemez arka plan renklenmesi genellikle bir sonucu olabilir. boyama reaksiyonları genellikle gecede boyama gerektirir ve oda sıcaklığı bunun için güvenli olduğunu.
   2. Daha fazla boyama gereklidir ve BM mor çözüm mavi renk alıyorsa, taze BM Purple ile boyama çözüm yerine ve 37 ° C içine tüpleri koymak. Hedef mRNA'nın çok bol ise, bir gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta boyama çözeltisi embriyolar koymak ve daha sonra oda sıcaklığına embriyolar hareket ya da 37 ° C boyama reaksiyonu daha iyi kontrol edilmesi izin verir.
   3. Nihai sonuç için zaman farklı hedef RNA'lar arasında önemli farklılıklar gibi, dikkatle yeni reaksiyonları izleyin. Tutarlılık için, daha uzun inkübasyon ile ortaya çıkan ifade yeni siteler varken (3.4 bakınız) boyama reaksiyonu durdurmak. Önemli bir şekilde, in situ hibridizasyon, eğer bir test olarak kullanılmaktadırFarklı tedavi grupları şu an deneyleri için, deney ve kontrol embriyoları arasındaki renk reaksiyonları için aynı zamanda kullanılır.
4. Boyama reaksiyonu durdurun ve Tablo 6'da belirtildiği gibi sıvıları değiştirerek depolama ve görüntü kaydı için embriyolar hazırlayın. Leke çıkarma embriyoların yaklaşık metanol mor renk olarak görünür, çünkü bu aşamada embriyolar kaya vermeyin.
   Not: Bu, ağır arka plan veya oyuk lekeleme çıkarmak için yeterli değildir, ancak sık sık embriyolar, boyama çözeltisi ve en azından kısmen bu kaldırmak soğuk metanolden açık mavi lekelenme mevcuttur. Soğuk metanol ile -20 ° C dondurucu içinde muhafaza edilir, metanol anlamına gelir.
   1. Embriyoların rehydrate ve Mempfa (Tablo 6) ile lekeyi düzeltmek. Sabit bir kez, Mempfa kaldırmak ve% 25 metanol ile embriyolar yıkayın.
   2. % 25 metanol çıkartın ve ağartma çözeltisi ilave endojen pigment gidermegereklidir. Yanıklara neden olabilir ağartma çözümü ele dikkatli olun. Nispeten hızlı olur ve beyazlatma derecesi farklı etkileri (Şekil 2) için değiştirilebilir yakından beyazlatma gözlemleyin.
   3. Ağartma sonrası uzun süreli depolama için% 100 metanol ile bir metanol dizi embriyolar kurutmak, ya da kısa süreli depolama ve daha sonra görüntüleme için PBS'ye transferi (bakınız Tablo 6).

4. Görüntüleme Embriyolar

1. Bir embriyo boyama işlemi tamamlandıktan sonra, görüntü embriyo ilgi gen ifade nerede bilgi daha geniş bir kitleye yakalanan böylece. Temizlenmemiş embriyolar görüntülemek için bir arka plan olarak agaroz% 1 kullanın.
   NOT: Agaroz embriyo ve boyama reaksiyonu mavi renk ile de tezat bir mavi / gri arka plan verir. Aynı zamanda rahatsız edici gölgeler ve embriyo dikkatini başka yöne yansımaları yaygın yardımcı olur.
   1. Suya agaroz ekleyin ve agaroz çözeltisi içinde kalıncaya kadar kaynatın ve sonra petri içine dökülmeden önce 50 soğumaya bırakın. TAE jeli çözeltisi gibi, birden fazla kullanım için 55 ° C inkübatör agaroz çözeltisi saklayın. Petri kabına yaklaşık 2 mm'lik bir derinliğe kadar agaroz dökün. Gerekirse, arka plan biraz farklı gölge elde etmek agaroz derinliğini ayarlayın.
   2. Sulu bir çözeltisi (PBS veya ttw) metanol içinde depolama rehidrasyon sonra, bir metanol dizi kullanılarak, (bakınız Tablo 6) agaroz baz ile bir petri tabağına embriyolar yerleştirin. Temiz bir çözüm tutun ve gerekirse, iyi görüntülerin temiz arka plan bozabilir küçük partiküler madde ortadan kaldırmak için basit filtreleme kullanın.
   3. Görüntü gibi ventral taraftan gibi alternatif görünümler, gelen embriyolar, Şekil 3 ince forseps kullanarak embriyo sığacak ve (yönlendirme için bu kanallarda embriyolar yerleştirmek için agaroz ince kanallar kesmek ). Kolayca zarar olarak embriyolar manipüle özen gösterin.
      NOT: Çoğu aşamaları çözeltide yerleştirilen zaman varsayalım karakteristik bir konuma sahip. Örneğin, blastula aşamalı embriyolar hayvan yan yukarı oturup eğilimindedir. Embriyolar uzatmak için başladığınızda, onların yan yattı.
2. Görüntüye derinlik sağlayan embriyo üzerinde gölgeler oluşturarak, sığ bir açıdan embriyo aydınlatmak ve yüzey yapılarını ayırt yardımcı olmak için fiber optik ışık kaynağı kullanın. Ağartma yararlı yerlerinden sağlayan pigment, ortadan Çünkü güçlü ağartılmış embriyolar için gölgeleme kullanın.
3. Böyle beynin, (Şekil 4) Notokordun, akciğer, veya bölgelerde olduğu gibi, derin embriyonun içinde görüntü boyama embriyolar temizleyin. Bunu gerçekleştirmek için,% 100 metanol kadar metanol dizi embriyolar koydu.
   1. Metanol içinde tam daldırma sonra, çözelti, bir kısım benzil alkol embriyo transferi ve iki bölüm benzil olamaznzoate (BABB). embriyolar başlangıçta yüzeyde yüzer ancak metanol Babb ile karışır gibi, onlar Babb içine batar. Cam şişeler veya yemekler Babb ile ilgili her adımı gerçekleştirin; BABB herhangi bir plastik veya boya eriyecek.
   2. Bir kez, temizlenmiş embriyodan altına gelen iletilen ışık embriyolar görüntüleyin. Kontrastı artırmak ve en iyi renk sağlamak için aşağıdaki ışık yoğunluğunu yanı sıra açısını ayarlayın.
   3. Görüntüleme temizlenir embriyolar baz kapalı cam petri yükseltmek zaman. Sadece embriyolar ile çanak bölgesi yükselir, böylece onu yükseltmek için diğer iki petri kapakları kullanarak yapın.
      NOT: Bu odak dışında tabanını alarak ve görüntü ile müdahale edebilir mikroskop baz kusurlar veya lekeleri rahatsız edici etkilerinin ortadan kaldırılması avantajına sahiptir.

5. Çift İn situ Hibridizasyon

1. Aynı anda tw ifade desenini görüntülemek içinTek bir embriyo farklı genler o iki prob farklı genlerin her biri için bir sentez. Yukarıda tarif edildiği gibi, bir etiket olarak DIG-11-UTP ile bir prob sentez. Situ hibridizasyonlar için tek olarak kullanılan çok 3 kat daha fazla konsantre edilmiş sonda elde etmek için RNA, hibridizasyon tamponu içinde transkripsiyon reaksiyonu ürünü seyreltin.
   1. DIG DIG 11-UTP ile ikame edilmesi gerektiğini floresein-12-UTP dışında problanmış etiketli için izlenen aynı protokol ile ilgili diğer prob sentez. Situ hibridizasyonlar için tek olarak kullanılan çok 3 kat daha fazla konsantre edilmiş sonda elde etmek için RNA, hibridizasyon tamponu içinde transkripsiyon reaksiyonu ürünü seyreltin.
   2. 1: 1 oranında iki konsantre probları karıştırın. En iyi sonuçları elde etmek için in situ hibridizasyon protokol tek güçlü ifadesini gösterir geni için, floresein-işaretli prob kullanılır.
2. In situ hibridizasyon protokolü aynı için tek için tarif edilen/ Em> hibridizasyonları, çift prob kullanımı dışında in situ hibridizasyon probu tek yerine ilk günün sonunda (etiketli-digoxigenin ve floresan işaretli prob 1.5x konsantre karışımı içeren prob).
   1. Anti-DIP-AP Fab fragmanları yerine 4,000 seyreltme ile 1: Anti-florosin AP Fab fragmanları hariç, in situ hibridizasyon protokolü çift ikinci gününde tek melezleştirme protokolü takip edin. Yerinde protokolünde single olarak embriyo aşırı antikor yıkayın ve BM-Mor AP substratı kullanılarak ilk renkli reaksiyonu yürütmek.
3. İlk renk reaksiyonundan sonra, 0.1 M glisin pH MAB beş ila on dakika yıkama yapılmıştır 2.0 40 dk için floresein antikor etkisiz hale getirirler. 90 dakika için MAB + HTSS + BR embriyolar engelleyin. 1 anti-DIG antikoru ekleyin: MAB + HTSS + br 2000 seyreltme ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   1. Ertesi gün, inci embriyolar yıkayınoroughly MAB (30 dakika 12 yıkama) aşırı antikorları ayıklamak için.
   2. AP Tamponu içinde 10 dakika (tablo 1) için embriyolar yıkayın ve BCIP (AP tamponu içinde 0.5 mg / ml) ile boyanır.
      NOT: Yerinde birlikte ilk renkli reaksiyon ve ikinci (Şekil 5) için bir açık mavi renk reaksiyonu için bir koyu mavi-mor leke vermelidir.
   3. AP tampon kaldırarak nihai renk reaksiyonu durdurmak ve MAB ile üç kez yıkayın. 10 dakika boyunca Mempfa ile embriyolar Fix. MAB veya TBT 5 hızlı yıkama ile embriyolar yıkayın.
   4. O BCIP yalnız renk ortadan kaldıracak gibi bu renk kombinasyonu ile, sonrası boyama işlemlerinde metanol kullanımı, artık mümkün. % 0.02 sodyum azid ile PBS içinde boyama ve tespit sonrası embriyolar saklayın. Boyama yoğunluğu situs çift zayıf olabilir. Bu bir sorun ise, dört 2 saat süre her yıkar azaltır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Doku spesifik probların kullanımı belirli organların gelişim durumuna ilişkin olağanüstü bilgi verebilir. Aşağıdaki örneklerde, embriyonun sahne Nieuwkoop ve Faber evreleme masaya ¹¹ dayanmaktadır. Bir sondalar formu farklılaşma sonra genlerin, evre 28-30 ben kalp troponin, örneğin, (Şekil 1C), farklılaşmış bir organın varlığını veya boyutunu kullanıyorsa herhangi bir aşama sonrası farklılaşma de değerlendirilebilir. Yıllar önce, embriyolog, erken ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Belirli genlerin ifade desen görselleştirmek için in situ hibridizasyon kullanma yeteneği Xenopus embriyo belirli organları veya hücre tiplerini belirlemek için en sık kullanılan yöntem olmaya devam etmektedir. Bunun nedeni, bu teknik ile sunulan çeşitli avantajlar taşımaktadır. Bir genin ekspresyonu, bu hücrelere ¹⁸ arasında açık bir sınır önce kalp atalarda Nkx2.5 ekspresyonu için halinde de farklılaşma herhangi bir histolojik işareti önce belirli yapıl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labguake Tube Shakers	VWR	17-08-2011
VWR Vials	VWR	10-07-2012
L-Cysteine	BioShop	CYS342.500
Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM	Roche	11277057001
Digoxigenin-11-UTP	Roche	11209256910
Rnase inhibator (Rnase OUT)	Invitrogen	10777-019
T7 RNA Polymerase	Fermentas	EPO111
T3 RNA Polymerase	Fermentas	EPO101
SP6 RNA Polymerase	Fermentas	EPO131
Dnase 1	Invitrogen	18047-019
Sheep Serum	Wisent	31150
Blocking reagent	Roche	11096176001
BM purple Ap Substrate	Roche	11442094001
Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments	Roche	11093274910
Methanol	VWR	CAMX0485-7
NaCl	BioShop	SOD002.10
SDS	EM	7910
EDTA	BioShop	EDT001.500
Tris	BioShop	TRS003.5
Tween-20	EM	9480
MgSO4	Sigma	M-2643
Mops	BioShop	MOP001.250
EGTA	Sigma	E-3889-25G
Paraformaldehyde	BioShop	PAR070.500
Formamide	VWR	CAFX0420-4
RNA	Roche	10109223001
Maleic Acid	VWR	CAMX0100-3
tri-Sodium Citrate	BioShop	CIT001
Hydrogen Peroxide (30% Solution)	EM	HX0635-2
BSA	BioShop	ALB001.100
PVP-40	ICN	195451
Ficoll 400	GE Healthcare	17-0300-10
Benzyl Alcohol	Sigma	B-1042
Benzyl Benzoate	Sigma	B-6630
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500