Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama<em&gt; Drosophila</em&gt; Dokular<em&gt; Yerinde</em

Özet

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Özet

Drosophila yapılan çalışmalar embriyo ve larva gibi hücre kaderi şartname ve organogenezis gibi gelişimsel süreçlerine önemli bilgi sağlar melanogaster. İmmünoboyama doku ve organların geliştirilmesi görselleştirme sağlar. Bununla birlikte, embriyojenez sonunda oluşturan bir koruyucu üst deri geç dönem embriyo ve larvalarına antikorların geçirmesini engeller. Immün önce diseksiyon düzenli Drosophila larva dokularının analiz etmek için kullanılır iken, küçük dokular bulmak ve izole etmek zor olabilir çünkü, bazı analizler için verimsiz kanıtlıyor. Sonikasyon larva Drosophila immünoboyamasıdır protokoller diseksiyon için bir alternatif sağlar. Geç evre embriyo ve larvaların çok sayıda hızlı, eşzamanlı işleme izin verir ve yerinde morfolojisi tutar. Formaldehit içinde tespit sonra, bir numune ultrasonik banyoda tutulur. Numune, daha sonra antigen-spesifik primer ant ile imüno tabi tutuluribodies ve floresan etiketli sekonder antikorlar floresan mikroskobu ile hedef hücre tiplerini ve spesifik proteinlerin görselleştirmek için. Sonikasyon işlemi sırasında numunenin üstüne, bir sonikasyon probu, hem de sonikasyon süresi ve yoğunluğu, uygun yerleştirilmesi kritik öneme sahiptir. Standart immünoboyama protokolleri Ek bir küçük değişiklikler, yüksek kaliteli lekeler için gerekli olabilir. Gürültü oranı düşük sinyalli antikorlar için, daha uzun inkubasyon süreleri tipik olarak gereklidir. Bu Sonication kolaylaştırdı protokol konseptinin bir kanıtı olarak, gelişim aşamaları bir dizi üç doku tiplerinin (testisler, yumurtalıklar, ve nöral dokular) arasında immunohistokimyasal göstermektedir.

Giriş

Drosophila embriyoları ve larvaları birçok organda ve dokuda gelişim süreçlerini incelemek için mükemmel bir model sunmaktadır. Tek tek hücrelerin Görüntüleme hücrelerinin geliştiği karmaşık ortamları tespit etmek için, bu çalışmalarda genellikle gereklidir. Dokusunun Görselleştirme imüno yoluyla gerçekleştirilebilir. Protokolleri 17 saat Yumurtlayarak (AEL) ^1-3 sonra embriyonik Drosophila dokular (1....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bir Toplama Cage 1. Hazırlık

1. CO ₂ genç, bereketli sinekler uyutmak. Bir kafese sineklere aktarın. Optimal verim elde 4 yaşı 2-7 gün arasında değişen 100-120 yetişkin sinekler kullanmak için: erkeklerin kadın 1 oranında. Sinekler uygun bir alışma dönemi Veren, ~ 24 saat tespiti için numune alınması öncesinde. 48 saat alışma dönemi - kafes bakire kadın ile kuruldu ise, erkeklere bir kullanımı 36 evlendirdi.
2. Kafesin açık ucunda, kafesin açıklığın üzerine merkezi maya hamur bir bozuk para büyüklüğünde damla ile önceden hazırlanmış bir elma suyu agar plaka yerleştirin. Sonra, bant ile sabitleyin. Elma suyu agar plaka ve Parafilm ile kafesi ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Geç evre embriyonik ve larva in situ dokularının analizi içinde sonikasyon bazlı imüno etkinliğini göstermek için, vahşi tip embriyoları ve larva testis, yumurtalık immün ve nöral doku için işlenmiştir. Numuneler konfokal mikroskobu ile görüntülendi ve temsili sonuçları (Şekil 1 ve Şekil 2) gösterilmiştir. Sonuçlar tarif edilen protokol Drosophila gelişiminin geç embriyonik erken aracılığıyla / orta L3 aşamalarında morfolojik özellik.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokol, böylece başarılı bir diseksiyon için olan ihtiyacı ortadan kaldırarak, in situ Drosophila embriyonik ve larva hedef dokulara immunostain için bir yöntem sağlar. Erken embriyolar ^1,2,3 boyanması için önce protokoller gereğince, koryonik membran% 50 çamaşır suyu (NaOCl) kullanılarak kaldırılır. Numuneler formaldehit ve metanol giderilmiştir. Larva kütikül yüzer eski numune neden olduğu için, bütün numune daha sonra larva tutulmasını sağlamak için bir hücre.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx)			For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT.
Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X)			For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C.
Triton 10%			For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
PEMS			0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT.
Pipes			For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT.
Formaldehyde			37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane		CAS 142-82-5	n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol		CAS 67-56-1	Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate buffer Tween (PBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C.
Tween 10%			For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C.
Normal goat serum (NGS)	ackson ImmunoResearch Laboratories	005-000-121	To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)		CAS: 281-57-9	To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution			1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C.
Apple juice plates			To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C.
Tegosept 10%			To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C.
Yeast paste			~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C.
Table 2: Staining Materials
DAPI	Invitrogen	D3571	1:1000, stock at 5 mg/ml.
Rabbit anti-Vasa			1:250, a gift from Ruth Lehmann.
Mouse anti-Fasciclin III	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10	1:10
Mouse anti-1B1	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1	1:4
Guniea pig anti-Traffic Jam			1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003).
Mouse anti-Prospero	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A	1:10
Rat anti-Elav	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7EBA10	1:30
mouse anti-Repo	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	8D12	1:10
Goat anti-rabbit Alexa546	Invitrogen	A11010	1:500
Goat anti-mouse Alexa488	Invitrogen	A11029	1:500
Goat anti-guniea pig Alexa633	Invitrogen	A21105	1:500
Goat anti-rat Alexa488	Invitrogen	A11006	1:500
Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages	Hand-made; Genesee Scientific Corporation	Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101	Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier	Branson	Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator probe	Branson	Model #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter	Nalgene	190-25-20	0.2 μm cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software	Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.		Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit	Nalgene	450-0020	0.2 μm cellulose nitrate membrane filter