Farelerde ultrason eşliğinde transtorasik intramiyokardiyal Enjeksiyon

Özet

Ekokardiyografi perkü- intramiyokardiyal enjeksiyon sıçangil kalp gen transfer ajanları veya hücre verilmesi için etkili, güvenilir ve hedeflenebilir yaklaşımı olmaktadır. Bu protokolde belirtilen adımları izleyerek, operatör hızla bu çok yönlü, minimal invaziv teknikle yetkin olabilir.

Özet

Kardiyovasküler hastalığı olan kemirgen modelleri patofizyolojik mekanizmaları araştıran ve olası rejeneratif tedaviler keşfetmek için önemlidir. Miyokard enjeksiyonunu içeren deneyler henüz torakotomi ile doğrudan cerrahi erişim tarafından yapılmaktadır. Koroner arter ligasyonu gibi başka bir deneysel manipülasyon sırasında yapıldığında uygun iken, intramiyokardiyal teslimat için invaziv bir işlem için ihtiyaç potansiyel deneysel tasarımlar sınırlar. Hiç ultrason çözünürlük ve gelişmiş girişimsel olmayan görüntüleme yöntemleri geliştirerek, rutin ultrason kılavuzluğunda perkütan intramiyokardiyal enjeksiyon yapmak artık mümkündür. Bu yöntem verimli ve güvenilir bir miyokard hedeflenen bölgeye ajanlar sunar. Bu tekniğin avantajları cerrahi morbidite kaçınma, seçici ultrason rehberliğinde miyokardiyumun bölgeleri hedef odası ve myocardiu için Enjektat teslim fırsatı bulunmaktadırBirden fazla, önceden belirlenmiş zaman aralıklarında m. Uygulanan teknikle, intramiyokardiyal enjeksiyon komplikasyonlar nadirdir ve farenin çabuk anestezik kurtarma normal aktiviteye dönüş. Bu protokolde belirtilen adımları izleyerek, temel ekokardiyografi deneyimi ile operatöre hızlı bu çok yönlü, minimal invaziv teknikle yetkin olabilir.

Giriş

Kalp hastalığı yılda 600.000 ölüm ¹ için muhasebe, Amerika Birleşik Devletleri'nde hem de erkek ve kadınlar için önde gelen ölüm nedenidir. Kardiyovasküler hastalığı olan kemirgen modelleri patofizyolojik mekanizmaları araştırmak için ve potansiyel tedavileri keşfetmek için kritik önem taşımaktadır. Gen tedavisi vektörleri miyokardial teslim hücreler, modifiye edilmiş RNA ve kalp hastalığı ^2-7 onların tedavi edici potansiyelinin bir diğer terapötik maddeler izin soruşturma kaynaklanıyor. Şu anda, fare modellerinde ⁶ terapötik ajanların miyokard teslimat için sınırlı seçenekler vardır. Direkt görüş altında intramiyokardiyal enjeksiyon yaygın olarak kullanılır, ama bir ya da sternotomi torakotomi gerektirir ve kalp, açıkta kalan bölümün sınırlıdır edilir. Böyle LAD ligasyonu gibi başka bir deneysel manipülasyon sırasında yapıldığında uygun iken, intramiyokardiyal teslimat için invaziv bir işlem için ihtiyaç potansiyel deneysel tasarımlar sınırlar ve bir tanıttıprosedüründen dditional etkileri (örneğin, torakotomi nedeniyle fibrozis). Viral vektörlerin perkütan perikardiyal dağıtım bildirilmiştir, ancak site ve terapötik maddenin dağılımı homojen değildir ve kontrol ⁸ zordur. Enjekte edilen malzemenin, ama verimli ve tekrarlanabilir koroner teslimat daha homojen dağılımı perkütan koroner enjeksiyon sonuçları sıçan modellerinde meydan okuyor.

Burada, biz ultrason rehberliğinde terapötik ajanların minimal invaziv, operatör kontrollü hedefleme sağlayan bir kapalı göğüs intramiyokardiyal enjeksiyon tekniği açıklar. Tekniği, öğrenmesi kolay, torakotomi ya da sternotomi ve bunların görevlisi deneysel komplikasyon ihtiyacını ortadan kaldırır ve zamanlama ve intramiyokardiyal enjeksiyon sitelerinde daha fazla esneklik sağlar. Bu nedenle, ekokardiyografi destekli enjeksiyon intramiyokardiyal manipüle bir teknik olarak basit ve son derece etkili bir metodu temsil ederfare deneysel modellerde myokarddaki.

Protokol

Tüm açıklanan adımlar Boston Çocuk Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokoller altında gerçekleştirildi.

1. Hazırlık

1. Intramiyokardiyal enjeksiyon için optimal sabit dönüştürücü pozisyon anatomi ve fonksiyonunun değerlendirilmesi tanımlanmasına yönelik en uygun standart görüşlerini vermeyebilece¤ini gibi, önce enjeksiyon protokolü başlamadan ekokardiyografi ile temel kardiyak anatomik ve fonksiyonel değerlendirme yapın.
2. Enjeksiyon kurulum Şekil 1A-1C gösterilmiştir. Kılıflı bir iğne ile boş bir şırınga, konik yukarı dönük, şırınga kelepçede (Şekil 1C) ve tarama kafası kıskacına ultrason transdüktörünün probu olarak güvenceye (Şekil 1B'ye bakınız). Tarama kafası kelepçe kilidi bilyalı mafsalı (Şekil 1B) gevşetin ve iğnenin eksenine paralel olacak şekilde bir dönüştürücü yönelimi işlemek. Taramaya Fixtarama kafası kelepçe top kilit eklemini sıkarak baş pozisyonu.
   Not: Yetişkin farelerde, enjeksiyon için bir 1 / 2,5 cm uzunluğa sahip olan bir 30 G iğne en uygunudur. Bir gaz geçirmez şırınga küçük hacimlerde daha hassas bir şekilde kontrol (5-10 ul) için kullanılabilir ise 1 ml şırınga içinde, daha büyük miktarlar için kullanılabilir.
3. Bütünüyle boyunca başını örtmek için bir spatula ile dönüştürücü ucu bolca ultrason jeli uygulayın. Dikkatlice iğne kınından ve iğne direk transdüser altında ve görselleştirme için ultrason jel içinde iğneyi ilerletmek için denetimlerini montaj kullanın. İğne ultrason görüntüsünün üzerinde uzunluğu boyunca açık bir şekilde görünür hale getirilir, böylece iğne kontrol parçasını kullanarak küçük ayarlamalar yapın. Dönüştürücü uygun Adım 1.4 iğne paralel doğrultuda ise, gelişmiş ve enjeksiyon kontrol düğmesi (Şekil 1C) ile çekilir, sonra iğne görüntü düzlemi içinde kalmalıdır.
4. Daha sonraki adımlarda, ihtiyacı rahatsız etmeyecekyatay eksende ya hareket ederek le / dönüştürücü yatay hizalama. Bunun yerine, iğnenin düşey eksende (y-ekseni) monte pozisyonu değiştirerek ve hayvan hareketli platformu enjeksiyon için kalbin alan hedeflenecek.
5. Hayvan platforma anestezi fare sonraki yerleştirilmesine olanak sağlamak üzere tarama yükseklik kontrolü (Şekil 1B) kullanılarak hayvan platformdan süperiorda dönüştürücüyü hareket ettirin. Bu iğnenin uzun eksenine transdüktörün x ekseni hizalama bozmayacak.
6. Şırınga kelepçe gelen hizalama için kullanılan ve dikkatle atın edildi şırınga çıkarın. Yeni bir iğne takın ve şırınga ucu ölü alan için izin, nihai hedef hacme enjekte edilecek ile şırınga. Hava kabarcıklarını çıkarmak için dikkatli olun. X ekseni hizalamasını ayarlayarak olmadan şırınga kelepçe içine şırınga yerleştirin. Tamamen enjeksiyon kontrolü kullanarak şırınga geri çekin.
   NOT: İlk eğitim amaçları için, Evan mavisi kullanımıboyası (% 1), Tripan mavi boya (% 0.4) ya da mikro-enjekte edilecek malzeme gibi floresan bir süspansiyonu yetkinliği ve hedeflenen enjeksiyon başarısını teyit operatöre yardımcı olabilir.

2. Enjeksiyon

1. Isıtma platformunun entegre sıcak açın ve 37 ° C için ayarlayın. Operatöre en yakın hayvanın anestezi hortum kelepçesi ve kafa ile, normal görüntüleme doğrultusundan hayvan platformunu 180 ° yerleştirin. Bu (göğsün sol tarafında) kalp şırınga kelepçe ve iğne ipsilateral olmasını sağlar. Not: Hayvan platforma ek küçük ayarlamalar dönme yönünde enjeksiyonu (Şekil 2A) için kullanılacak Parasternal kısa eksen görüntü düzlemi için doğru şekilde yönlendirmek için kalp gerekli olabilir.
2. Daha önce ⁹ bildirildiği gibi ekokardiyografi için fareler hazırlamak. % 2 izofluran ile indüksiyon odasında fare anestezisi. Epilasyon kremi An ile göğüs tüylerdensklera kurumasını önlemek için her iki göze jel yağlama uygulanır d.
3. Tarama kafası yükseklik kontrolü (Şekil 1B) ile dönüştürücüye kaldırın. % 1-3 izofluran (Şekil 2A-2B) teslim bir burun konisi içinde burnu ile ısıtılan hayvan platformun üstünde anestezi fare sırtüstü yerleştirin. Yavaşça bir rektal prob takın ve elektrik kontağı için elektrot jeli uygulayarak, EKG elektrotları için dört pençeleri bantlayın.
   NOT: anestezi uygun seviyede bir hayvanın insani tedavisi için sağlanmalıdır. Kalp hızında herhangi bir değişiklik ve göğüs duvarından iğnenin yerleştirilmesi için hiçbir yanıt olmalıdır. Hipotermi göreceli bradikardi, ventriküler dilatasyon ve olası rahatsızlıklara neden olacak gibi hayvan platformunun entegre homeostatik sıcaklık kontrolleri, normotermi (37 ± 0.5 ° C) muhafaza için kullanılmalıdır.
4. Fare hayvan platformu üzerinde sabitlendikten sonra, depila üzerine dönüştürücüyü düşürmektarama kafası yükseklik kontrolü (Şekil 1B) kullanarak ted göğüs. Kalp standart ekokardiyografik tekniği gereği, parasternal kısa eksen yönelim görselleştirilebileceğini için enjeksiyon için en uygun ultrason kurulum. Kısa eksen görüntü düzlemi (Şekil 2A-2B) enjeksiyon için uygun bir akustik pencere elde etmek için hayvan platformunu 20-30 ° saat yönünde döndürür. Not: Alternatif olarak, enjeksiyon, hayvan platformun (Şekil 2C) içinde saat yönünün tersine döner bir Parasternal uzun eksen yönünde de yapılabilir.
5. Görüş alanını ayarlamak ve sol ventrikül miyokard içinde istenilen enjeksiyon siteyi hedef hayvan platformu ayar denetimlerini kullanın. Sol ventrikül myokard (Şekil 3A-3C) istenen enjeksiyon yerini hedef kalp tabanına apeks geri ve ileri-Pan. Not: midpapillary parasternal kısa eksen görüntüde (Şekil 3A) reproducibl sunuyorenjeksiyon yerinde takip görüntüleme izin e görülecek. Not: Alternatif olarak, Parasternal uzun eksen, önceden tanımlanmış bir enjeksiyon bölgesine (Şekil 3D) hedeflemek için kullanılabilir.
6. Tamamen geri çekilmiş şırınga kıskacına şırınga ile başlayarak, yavaş yavaş enjeksiyon kontrol saat yönünde (Şekil 4A) döndürülmesi ile hayvanın göğsüne doğru şırınga ilerletin. O göğüs yaklaştıkça kalp ve iğne ucu hem açık ultrason görüntülenmesine izin verecek, göğsün sol tarafında üzerinde ultrason jeli bol kullanın ve ekokardiyografi kontrolleri bakış geniş bir alanı ayarlayarak akustik pencere optimize. Enjeksiyon için hedef bölgede odak noktası / dilimini ayarlayın. Iğne küçük ayarlamalar kontrolleri kendi uzunluğu boyunca iğne görüntüsünü optimize edebilirsiniz montaj.
   Not: bazı ultrason makinesi dijital hedef miyokarda aracılığıyla iğnenin uzun ekseni boyunca uzanan bir çizgi için bir iğne kılavuz işlevi vardır yazılım(Şekil 4B). Böyle bir yazılım aracı yararlı olabilir, ancak gerekli değildir yapabilirsiniz.
7. Hayvan uygun sedasyon ile dikkatlice tüm eğimli iğne ucu konumunu gözlemleyerek, fare göğüs duvarından ve miyokard içine iğne ilerlemek (% 1-3 izofluran 0.5-0.8 L / dk% 100 oksijen ile karıştırılır) kez. Iğne ucu hedef kadardır (Şekil 4C) içinde olduğunda ilerleyen durdurun. Bütün Eğimli ucu perikard boşluğuna Enjektat sızıntısı önlemek için, güvenli miyokard içinde olmalıdır.
8. Uç istenen konumda olduğunda, şırınga pistonu iterek nolu enjekte edilecek malzeme sağlar. 5-30 sn içinde yavaş yavaş Enjektat sunun (hacmine bağlı olarak teslim ediliyor). Enjekte edilecek 50 kadar ul ventrikül fonksiyonunu bozmadan teslim edilebilir. Enjekte miyokard bölgeye geçici bir echobright görünüm başarılı bir enjeksiyon sonrasında belirgin olabilir. Göreceli bradycard kısa (saniye) dönemiia bazen miyokard içine enjeksiyonu ile kaydetti ve hızlı bir şekilde giderir edilir.
9. Enjektat uygulanan edildikten sonra, derhal enjeksiyon kontrol düğmesinin saat yönünün tersine dönme tarafından iğneyi çıkartın. Fare korunmuş ventrikül fonksiyonu ve hiçbir girişim sonrası komplikasyonlar onaylamak için ekokardiyografik gözlem birkaç dakika boyunca anestezi altında tutulmalıdır. Gerektiğinde, miyokardın daha çok sayıda bölgeleri seri hayvan platformun ayarlanması ile yaklaşımı iğne açısının konumunu yeniden enjekte edilebilir. Intramiyokardiyal enjeksiyonundan sonra, fare kendi başına bir kafes içine yerleştirildi ve gözlem altında anesteziden bırakılır.
10. O sternum yatma korumak için yeterli bilince kavuşana kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayın. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete intramiyokardiyal enjeksiyon geçirmiş bir hayvanı iade etmeyin. Kafes re ile bir termoregülasyonlu pad üzerinde konulmalıdırsu ve fare diyet ADY sağlanması. İşlem sonrası rahatsızlık beklenen ve uygun kısa bir süre müdahale sonrası normal davranışını devam etmek için başarısızlık potansiyel bir komplikasyon (Tartışma) göstermektedir değildir.
11. Dikkatle intramiyokardiyal enjeksiyon tamamlanması operatörü ya da çevredekilere diyez yaralanma riskini en aza indirmek için hemen sonra iğne atın. Bir iğne tekrar kullanımı daha zorlu miyokardiyumu delmek için yapım ucu köreltme ve komplikasyon riski daha yüksektir sonuçlanan neden olabilir.

Sonuçlar

Mavi Dye veya Floresan Mikrokürelerin sahip fare intramiyokardiyal Enjeksiyon

Evan mavisi Enjeksiyon eğitim amaçlı yararlıdır. Kısa bir süre enjeksiyonundan sonra, orta papiller kas seviyesinde miyokardı infiltre mavi boya ile, fare euthanize ve enjekte edilen mavi boya konumunu görselleştirmek için kalp çıkarın. Şekil 5 başarılı bir enjeksiyon bir örneğini göstermektedir (Şekil 5A, kapalı bölge ) noktalı çizgi ile. Evans mavisi birka...

Tartışmalar

Biyolojik, kan akışı yoluyla doğrudan enjeksiyon intramiyokardiyal, intraperikardiyal enjeksiyon veya dolaylı olarak uygulanması ile miyokard teslim edilebilir. Miyokard infarktüsü modellerde Yeni hücre tabanlı tedavi denemeleri enjekte edilecek ^12-14 teslim açık bir torakotomi yaklaşımı tarif var. Miyokard terapötik müdahalenin başarısında önemli bir faktör teslim rota seçimine bağlı. Biyolojik en yüksek lokal doz intramiyokardiyal dağıtım ^15,16 ile elde edilir. Direkt...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 2100 ultrasound imaging system	Visualsonics
Vevo Integrated Rail System III	Visualsonics
Microscan MS400 transducer	Visualsonics
Microscan MS550D transducer	Visualsonics
PrecisionGlide needles	BD	305128	30 G x 1 in/2.5 cm
1 cc slip tip syringe	Exel International	26048	or equivalent
Gastight 50 μl glass syringes	Hamilton	1705
Trypan blue stain (0.4%)	Gibco	15250	or equivalent
Isoflurane	Baxter	AHN3640	or equivalent
Aquasonic 100	Parker Laboratories	(01-08)	or equivalent
Polystyrene microspheres (red fluorescent)	Life Technologies	F-8842	or equivalent