Deniz taşemen Karaciğer Metamorfoz sırasında Safra Hastalığı gözünüzde Yeni Bir Açıklama Yöntemi ( Petromyzon marinus)

Özet

Deniz taşemen Başkalaşım sırasında safra kesesi ve safra yolları, insan safra atrezi ile benzer bir süreç kaybedersiniz. Yeni bir tespit ve açıklama yöntemi (AÇIKLIK) lazer tarama konfokal mikroskopi kullanılarak tüm safra yolları görselleştirmek için güncellenmiştir. Bu yöntem safra dejenerasyonu incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Özet

Biliyer atrezi Tayvan 5,000 içinde 1 bildirilen frekans ile tahmini 1 15,000 güneydoğu ABD'de frekans, ancak Doğu Asya ülkelerinde daha yaygın olan, bebeklik nadir bir hastalıktır. Çok biliyer atrezi yönetimi hakkında bilinmesine rağmen, patogenezi hala zor olduğunu. Deniz taşemen (Petromyzon marinus) safra dejenerasyonun mekanizması ve ilerlemesini incelemek için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Larva, parazit ve yetişkin: Deniz taşemen üç farklı yaşam evrelerinde yoluyla gelişir. Larva parazitik koleje geçiş sırasında, deniz taşemen dış morfolojisi ve iç organlarda dramatik yeniden yapılanma ve yeniden birlikte metamorfoz tabi. Karaciğerde, tüm bilier sistem safra kesesi ve safra dahil, kaybolur. "AÇIKLIK" adı verilen yeni geliştirilmiş bir yöntem metamorfik deniz lamprey de bağırsak ile tüm karaciğer ve kavşak netleştirmek için güncellenmiştir.safra dejenerasyon süreci lazer tarama konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülendi ve deniz taşemen metamorfoz sırasında ayırt edildi. Bu yöntem, eşsiz bir hayvan modelinde safra yolları atrezisi incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Giriş

Deniz taşemen üç ayrı yaşam boyunca gelişir ^1,2 aşamaları. Larva deniz taşemen (L) bentik filtre besleyiciler olarak yuvalarda çoğu zaman harcamak. Dış morfoloji ve iç organlarda ³ yeniden dramatik değişiklikler yedi metamorfik aşamaları geçtikten sonra, elde edilen yavrular (JV) kütle 100 defadan fazla vücut artırarak, konak balık kan ve doku sıvıları ile beslenirler sırasında bir parazit sahne girin . Okyanus veya büyük göllerde konak balık besleme, 1.0 ila 1.5 yıl sonra, yetişkin erken bahar aylarında beslenme durdurma ve yumurtlamak için akarsulara göç ve ardından ^1,2 ölür.

Metamorfoz sırasında, deniz taşemen karaciğer safra kesesi ve safra yolları, tüm, insan bebekte hastalık safra yolları atrezisi taklit eden evrimsel bir mutant fenotip kaybeder. Bebek biliyer atrezi ^4,5,6,7 ciddi tıbbi komplikasyonlar nadir bir pediatrik karaciğer hastalığıdır, 8,9,10, ancak safra atrezi patogenezi ve etyolojisi ⁴ büyük ölçüde bilinmemektedir. Cerrahi müdahale (Kasai prosedürü) ⁵ gerçekleştirilir sürece biliyer atrezi ile hastalar doğumdan sonra iki yıl içinde ölmektedir. Daha sonra, bu hastalar geniş klinik yönetimi ve genellikle karaciğer nakli ^6. gerektirir. Biliyer atrezi etiyopatogenezinin Birçok teori gibi viral enfeksiyon, konjenital malformasyon, otoimmün hastalık, toksik ve hakaret olarak önerilmiştir. Ancak, safra atrezi gelişimine her katkısı ^7,8,9,10 sonuçsuz kalır.

Patolojik safra yolları atrezisi acı bebeklerin aksine, deniz taşemen gelişimsel kapsamlı stres nekroinflamasyon, fibrozis veya siroz ¹⁰ olmadan safra yolları atrezisi programlanmış geçireceği. Hayvanlar, bu süreçte ¹⁰ sırasında geçici kolestazınız acı, ama bu gelişimsel duruma adapte olabilirile de novo sentezi ve bu ¹¹ karaciğer safra tuzunun sentezi azaltma olarak bilinen mekanizmaları ek olarak gelişim safra atrezi, sonra bağırsak safra tuzlarının salgılanması. Deniz lamprey Bu gelişim süreci biliyer atrezi ilerlemesini incelemek için bilinen tek fırsat sağlar.

"AÇIKLIK" adı verilen yeni geliştirilmiş bir yöntem, bir optik şeffaf Nanogeçirgen hidrojel ¹² içine bozulmamış dokusu dönüştürerek karmaşık memeli sinir sistemlerinde yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar. Deniz taşemen karaciğer ve modifiye BERRAKLIK protokolünü kullanarak, safra dejenerasyon sağlam doku görüntüleme karaciğer metamorfoz boyunca belgelenmiştir olabilir.

Protokol

1.. Çözüm Hazırlığı

1. 1 L sağlayın 10x 0.1 M fosfat tampon tuzlu su (PBS, pH 7.4): 26.2 gr sodyum fosfat (monobazik), 115 g sodyum fosfat (dibazik), 87.66 g NaCI ve tartılır. Yaklaşık 800 ml distile H ₂ O içinde çözülür, pH ayarlanması, ve distile H ₂ O. ile 1 L'ye hacmi getirmek
   1. 1 L 0.1 M fosfat tampon tuzlu su (pH 7.4) Marka: 100 ml 10x PBS alın ve 900 ml damıtık _H2O eklemek
   2. 100 ml 10x PBS al, 1 ml Triton X-100 ekleyin ve damıtık _H2O ile 1 L'ye getir hacim: 1 L 0.1 M fosfat tampon tuzlu su (pH 7.4),% 0.1 Triton X-100 ile yapın
2. 26.2 g sodyum fosfat (monobazik) ve 115 g sodyum fosfat (dibazik) tartılır: 1 L 10x 0.1 M fosfat tamponu (PB, pH 7.4) olun. Yaklaşık 800 ml distile H ₂ O içinde çözülür, pH ayarlanması, ve distile H ₂ O. ile 1 L'ye hacmi getirmek
   1. 1 L 0.1 M fosfat tamponu (pH 7.4) Marka: Al 100 ml 10x PB,ve H ₂ O. damıtılmış 900 ml ekle
   2. % 0.1 Triton X-100 ile 1 L 0.1 M fosfat tamponu (pH 7.4) Marka: 100 ml 10x PB al, 1 ml Triton X-100 ekleyin ve damıtık _H2O ile 1 L'ye kadar ses getirmek
3. 400 ml hidrojel monomer çözeltisi (% 4 akrilamit,% 0.25 bis-akrilamid,% 4 paraformaldehit,% 0.0075 amonyum persülfat, 0.1 M PBS içinde% 0.0005 saponin) Marka: 0.3 g amonyum persülfat ve 0.2 g saponin tartılır. 210 ml damıtılmış ₂ H ekleme O, 40 ml% 40 akrilamit,% 2 10 mi bis-akrilamid, 40 ml 10x PBS (pH 7.4), 100 ml% 16 paraformaldehit ve iyice karıştırın.
4. (0.2 M borik asit,% 4 SDS) 4 L temizleme çözeltisi oluşturunuz: SDS g 49,464 g borik asit ve 160 tartılır. , Yaklaşık 3,5 L distile H ₂ O eritin NaOH ile 8.5 pH ayarlamak ve 4 L. hacmi getirmek
5. 1 L% 80 gliserol çözeltisi Marka:, 800 ml gliserol ölçmek 200 ml damıtık _H2O ekleyin ve iyice karıştırın.

2.. Doku Hazırlanması

1. Her bir 15 ml santrifüj tüpüne hidrojel monomer çözeltisi ve kısım 10 mi hazırlayın.
2. Bütün doku inceleyin ve 4 ° C'de 2 gün için hidrojel saptamak Hidrojel çözelti en az 10x doku hacmi olduğundan emin olun.
3. Bir çeker ocak için (15 ml santrifüj tüpüne) hidrojel sabit doku getirin.
4. , TEMED 5 ul ekleyerek hidrojel sabit doku polimerize iyice karıştırın ve 2-3 saat boyunca oda sıcaklığında, çeker ocak içinde bekletin.
5. İyice fazla jelin çıkarılması. Not: Ekstra jel boyama esnasında temizleme sürecini ve antikor sokulmasına engel olacaktır.
6. Doku saydam hale gelinceye kadar, birkaç gün boyunca 70 rpm'de ve 50 ° C'de ayarlanmış bir kuluçka çalkalayıcı içinde çözelti temizleme 10 ml sabit doku inkübe edin. , En az günde bir kez temizleme çözeltisi değiştirmek ve temizleme solüsyonu değiştirirken dokudan fazla jelin çıkarılması.
7. 70 r% 0.1 Triton X-100 ile 10 ml 0.1 M PB içerisinde dokuyu durulayınpm ve 37 ° C gecede. Bu adım 3 kez tekrarlayın ve tampon çözeltisi değiştirirken dokudan fazla jelin çıkarılması.
8. 2 gün boyunca 70 rpm ve 37 ° C 'de% 0.1 Triton X-100 ile PB primer antikor çözeltisi içindeki açıklık dokuyu inkübe edin. Not: Bütün daldırın doku için yeterli birincil antikor çözüm olun.
9. Gece boyunca 70 rpm ve 37 ° C 'de% 0.1 Triton X-100 ile 10 ml PB doku durulayın. Bu adım 3 kez tekrarlayın ve tampon çözeltisi değiştirirken dokudan fazla jelin çıkarılması.
10. Karanlık bir odada ya da loş ışık altında, aşağıdaki adımları uygulayın. Fotoğraf beyazlatma önlemek için folyo ile örtün örnekleri.
11. % 0.1 Triton X-100 ile PB floresan ikincil antikor çözeltisi ve 1 gün boyunca 70 rpm ve 37 ° C de bloke serumu ile berraklaştırılmış dokuyu inkübe edin.
12. Gece boyunca 70 rpm ve 37 ° C 'de% 0.1 Triton X-100 ile 10 ml PB doku durulayın. Bu adımı 3 kez tekrarlayın ve aşırı jel f kaldırmakTampon çözeltisi değiştirirken doku rom.
13. Gece boyunca 70 rpm ve 37 ° C de 10 ml PBS içinde doku durulayın. Bu adım 3 kez tekrarlayın ve tampon çözeltisi değiştirirken dokudan fazla jelin çıkarılması.
14. 70 rpm ve 37 ° C sıcaklıkta gece boyunca% 80 gliserol içinde berraklaştırılmış doku inkübe edin.
15. Önce konfokal mikroskopi için 4 ° C'de floresan lekeli doku saklayın.

Sonuçlar

Birçok önemli gelişme olayları deniz taşemen Başkalaşım sırasında Hepatobilier sistemde meydana. Safra kanalı ve safra kesesi apoptozu ve dejenere (Şekil 1) tabi. Ve konfokal mikroskopi kullanılarak anti-apoptotik işaretleyici BCL2 (cholangiocytes ve hepatositler önce ve başkalaşım ¹³ sonrasında mevcut CK19) karaciğer hücre işaretleyici sitokeratin 19, modifiye arıtma yöntemi ve boyama birleştiren, tüm safra sistemi Z-ekseni (boyunca yakalandı Şekil 2)

Tartışmalar

Bu protokol, nano gözenekli bir hidrojel oluşturmak üzere, poliakrilamid ile bozulmamış doku çapraz bağlar ve daha sonra optik saydamlık ve makromoleküler geçirgenliği elde etmek için doku plazma zarı uzak şeritler "açıklık" ¹² olarak adlandırılan yeni bir yöntem, modifiye edilir. "BERRAKLIK" uzun menzilli projeksiyon ve sinir sisteminde yerel devre kablolama sağlam doku görüntüleme sağlar. Bu yeni yöntem, başkalaşım sırasında deniz lamprey karaciğerde tüm ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide	Bio-Rad	161-0140
2% bis-acrylamide	Bio-Rad	161-0142
TEMED	Bio-Rad	161-0800
ammonium persulfate	Sigma	A3678-25G
boric acid	Sigma	B7901-1KG
saponin	Sigma	47036
sodium dodecyl sulfate	Sigma	L337-500G
sodium phosphate (monobasic)	Sigma	04269-1KG
sodium phosphate (dibasic)	Sigma	S5136-1KG
Triton X-100	Sigma	X100-500ML
glycerol	Sigma	G9012-500ML
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-S
NaOH pellets	EMD	SX0590-3
15 ml centrifuge tubes	Any brand
dissecting tools	Any brand