JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

SIVQ-LCM lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) işlemi sürücü, bir bilgisayar algoritması, Mekansal Değişmeyen Vektör Nicelemek (SIVQ) sürdürür yenilikçi bir yaklaşımdır. SIVQ-LCM akışı büyük ölçüde araştırma ve klinik ortamlarda hem de uygulamaları ile, Mikrodiseksiyon hızını ve doğruluğunu artırır.

Özet

SIVQ-LCM otomatikleştirir ve daha geleneksel, kullanıcı bağımlı lazer diseksiyon sürecini düzenler yeni bir yöntemdir. Bu gelişmiş, hızlı bir şekilde özelleştirilebilir lazer diseksiyon platformu teknolojisi yaratmayı amaçlamaktadır. Bu raporda, biz ArcturusXT cihazın üzerine görüntü analiz yazılımı Mekansal Değişmeyen Vektör Kuantalama (SIVQ) entegrasyonunu açıklar. ArcturusXT sistem belirli bir hücre veya büyük alan disseksiyonlarında için izin, bir kızılötesi (IR) ve ultraviyole (UV) lazer hem de içerir. Temel amaç hızı, doğruluk ve örnek iş verimini arttırmak için lazer diseksiyon tekrarlanabilirliği geliştirmektir. Bu yeni yaklaşım, hayvan ve araştırma ve klinik iş akışları insan dokularında hem mikrodiseksiyon kolaylaştırır.

Giriş

Başlangıçta 1990'ların ortalarında geliştirilen lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) tam mikroskopik 1, 2 yoluyla histolojik doku bölümünden belirli hücreleri veya hücre bölgeleri yakalamak için kullanıcı sağlar. Doku sıyrıklar karşı LCM moleküler analizi de uzun çalışma yöntemi 3-12 değerini göstermektedir. Buna ek olarak, 13, 14 görüntüleme için kullanılabilir teknoloji üç video protokol yayınlar vardır. Ilgi konusu hedef doku heterojen bölüm veya zaman hücreler, çok sayıda bu tür proteomik gibi özel bir aşağı akıntı uygulamaları için gerekli olan dağılmış bir hücre nüfusu, ancak kanıtlanmış değerine rağmen, LCM sıkıcı ve zahmetli olabilir. Insan operatör yerleştirilen yük LCM süreci 15 yönlendirecek güçlü bir görüntü analizi algoritması birleştirerek LCM için bir yarı-otomatik bir diseksiyon yaklaşım geliştirmeye götürdü.

, NIH laboratuvar genişletilmiş önce geliştirilen ve içsel doku seçim sürecini yarı otomatikleştirmek için izin vermek için bir şekilde Mekansal değişmez vektör nicemlemeyi (SIVQ) algoritması bildirdi böylece akılda patolog veya yaşam bilim adamı ile kullanılabilir bir araç yapma, mikrodiseksiyon yönlendirilmelidir. Mekansal değişmez vektör sayısallaştırma (SIVQ) kullanıcı sadece istatistiksel eşik ayarlayarak, tüm histolojik resmi aramak için kullanılabilecek bir halka vektörü (yüklem görüntü özelliği) oluşturmak için bir ilgi histolojik özelliği "tık" sağlayan bir algoritma olarak 16-21 gerekli. Oluşan ısı haritası ilk yüklem görüntü özelliği maçların kalitesini görüntüler ve daha sonra tek bir renkle LCM alet içine alınabilir (kırmızı) açıklama haritası dönüştürülür. Otomatik seçim yazılımı, AutoScanXT, sonra esaslı bir harita çizmek için kullanılırSIVQ ait açıklama doku numunesinden hedef hücrelerin yakalama yol üzerinde. Aşağıda ayrıntılı bir protokol mikrodisseksiyon iş akışına SIVQ uygulanmasını açıklar.

Protokol

Açıklanan protokol, insan doku örneklerinin kullanımı NIH kurallarına uygun olarak kullanıldı.

1.. Doku Hazırlanması

  1. Önce başına, Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK) protokolleri doğrultusunda insan doku örnekleri elde.
  2. Doku / hücre blok türü ve buna tekabül eden işleme yöntemi [dondurulmuş formalinle sabitlenmiş parafine gömülmüş (FFPE), etanol ya da sabitlenmiş parafine gömülmüş (EFPE)] seçin. Formalin fiksasyon etanol tespit ve flaş dondurulmuş ardından, optimum histoloji sağlar. Bununla birlikte, sabitleme ve doku işleme yöntemleri DNA, RNA ve protein miktarı ve alt moleküler analiz için kalitesini etkileyebilir ve dikkate alınmalıdır.
  3. Seçim kayıcı türü (cam, cam membran veya metal çerçeve membranı) üzerine doku / hücre blok bölümleri kesilir. SIVQ analizler her üç slayt tiplerinde eşit derecede iyi çalışır. Şunu unutmayın ki sahte-lamel yöntem iksilenler ve Ethan ile (aşağıda tarif edilmiştir)slayt sahnede ters olmalıdır yana ol metal çerçeve membran slaytlar üzerinde gerçekleştirilemez.
  4. Arka ilgi hücreleri belirlemek için bir kimyasal veya İHK-tabanlı doku leke seçin. Bu boyama yöntemleri de DNA, RNA ve protein kalitesi ve doku miktarını etkileyebilir. Protokolü ile devam etmeden önce biyomoleküllerin temel kalitesini değerlendirmek için boyandıktan sonra doku sınayın. DAB 15, immunofloresan, hızlı, kırmızı, de novo kırmızı, mavi toluidin ve hematoksilen ve eozin (H & E) (yayınlanmamış veri) ile immünhistokimyasal (İHK): SIVQ-LCM ile boyanan doku / sitoloji slaytlar üzerinde yapılmıştır.

2.. Numune Görüntüleme

  1. Yük mikrodisseksiyon aracın motorlu sahneye slaytlar ve ilgili yazılımı başlatmak. Yüklenen slaytlar pozisyonlarını tayin ve yakalanan görüntü dosyalarını jpeg formatında kaydedilecek sağlamak için onay kutularını seçin.
  2. Im optimizeyaş manuel odaklama tekerlek veya diseksiyonu cihazın yazılımı aracılığıyla kullanarak, ekrandaki görüntünün parlaklığını ve odak ayarlayarak kalitesi.
    1. Diseksiyon cihazın yazılımına Görüntü Araç Kutusu'nu kullanarak, uygun bir lamba parlaklığı ve kamera kazanç ayarlayın. Örnek değerler difüzör ile, parlaklık = 60 ve kazanç = 220 bulunmaktadır.
    2. Elle veya yazılım otofokus özelliği ile odaklanın.
  3. Diseksiyon işlemi için bir yol haritası sağlamak için slayt bir küçük bakış görüntü yakalayın.
    1. Bir uncoverslipped sürgünün en iyi görüntü kalitesini sağlamak için, alet üzerinde kondansatör altında difüzör kullanmak veya, refrakter indeksi (yalancı lamel) geliştirmek için, etanol ya da ksilen ya da küçük bir miktar (~ 30 ul) ekleyin. Ksilen kullanırken, bir davlumbaz ve koruyucu laboratuvar önlüğü, gözlük, göz, ve eldiven kullanımı dahil, toksik ve uygun güvenlik önlemleri kullanılmalıdır edilmektedir farkında olmak.
    2. Etanol veya iksilenler çözüm tamamen temizlenir veya kapağı üzerindeki polimer bozuk olacak kadar slaytta LCM kap koymayın.
  4. 10X, 20X, 40X büyütme veya disseke edilecek alanların slayt ve fotoğraf çekimi gidin. Gerekirse, daha önce 22 açıklandığı gibi (Microsoft Office Picture Manager) Otomatik Düzelt olarak yazılım ile imajını geliştirmek. Görüntüler onları otomatik seçim yazılımı yeniden ithal izin vermek için jpeg formatında ele olmalıdır.

Görüntü 3. Algoritma Analizi

  1. Transferi SIVQ klasörüne mikrodisseksiyon cihazdan çekilen görüntüleri. Yükleyin ve diseksiyon cihaza bağlı bilgisayara ArcturusXT, Otomatik Tarama ve SIVQ yazılım paketlerini açın. SIVQ yazılımına erişim için, Dr Ulysses BALIS (ulysses@med.umich.edu) ile irtibata geçiniz.
  2. Açık SIVQ ve çekilen görüntüyü ilgi (jpeg) yükleyin.
  3. Ilgi alanına gidin ve / veya vitrinlerde (Çerçevesi 5 ve 6) boyutunu ayarlayın. SIVQ yazılım, Viewport 5 ön-işleme görüntüyü gösterir ve Çerçevesi 6 post-processing görüntüsünü 16 göstermektedir.
  4. Halka vektör ve kullanılacak halkaların sayısı boyutunu seçin.
  5. ViewPort'un 6 üzerine sağ tıklayarak çekilecek yüklem görüntü özelliğini seçin.
  6. Görüntüyü analiz etmek "tarama" tıklayın.
  7. İki kayar çubuklarını kullanarak görüntü eşleştirme istatistiksel olasılığını ayarlayın. Üst bar genel vektör özgüllük ayarlar ve (seçilen "Stat" değişkeni tarafından tanımlanan hassasiyet ile) aşırı dahil alanını temsil edebilir ki ilk tarama alanı dışlamak için kullanılır. Tersine, daha düşük bir sürgü tarama yapıldıktan sonra bir eşleşme olarak sınıflandırılır artan alanının amacı ile, duyarlılığı artırmak için kullanılmaktadır. Bu kaymak kontrollerin Hem İYEilk temel hassasiyet eşiği olarak lizedirler "Stat" değişken.
  8. Görüntüyü kaydetmek için, (görüntü şimdi c :/ vq_test klasörü / resimlerim kaydedilir) "jpeg olarak kaydetmek" tıklayın.
  9. Algoritması ile görüntüyü analiz. Algoritma analiz çıktısı SIVQ-LCM kullanılmak için açıklamalı bir görüntü ile sonuçlanması gerekmektedir. Şu anda, SIVQ çekirdek motor güncel sürümü tam üretim versiyonu (mevcut Q1 2014) basitleştirilmiş entegrasyonu için tam bir yazılım geliştirme kiti (SDK) ve uygulama programlama arabirimi (API) dahil olacağı beklentisi ile beta sürümü test olduğunu kullanıcı tarafından oluşturulan uzaysal filtreler ve çekirdek halka eşleşen motor ile aşağı akışı veri işleme adımlar. Bu SDK belgelerine tam bir set ile dağıtılacaktır.
    1. SIVQ heatmap bir düzgün kırmızı renge değişir emin olun.
  10. Görüntü ihracat. Bu p konum koordinatları yeniden gömmek için gereklidirOrijinal diseksiyon enstrüman görüntü dosyası başlığı yapıştırmak için bir HEX editörü kullanarak ost-analiz jpeg görüntü. Uygun veri "Image Start" işaretleyici (0xFF, 0xD8) ve ilk "Kuantalama Tablo tanımla" işaretleyici (0xFF, 0xDB) arasında bulunabilir.

4. Mikrodiseksiyon

  1. Görüntüler SIVQ analizi için yakalanan ilgi bölgesi, merkezinde LCM kapağı yerleştirin.
  2. Kalibre ve Kalite Kontrol (QC) UV / IR lazerler ve güç, süre, lazer yerle ve (üretici tarafından önerilen gibi) UV kesim hız dahil parametrelerini optimize. Analiz görüntüyü yeniden ithal etmeden önce bu kalibrasyonları gerçekleştirin.
  3. Açık AutoScanXT (otomatik seçim yazılımı) ve c :/ vq_test klasörü / resimlerim gelen analiz görüntüyü içe.
  4. SIVQ notunu tanımak ve diseksiyon haritası oluşturmak için otomatik seçim yazılımı eğitin.
    1. Bir Trai oluşturmak içinning dosyası, SIVQ analiz görüntünün "kırmızı boya" on ("mavi daireler" ile işaretlenmiş) ilgi dört bölge seçin.
    2. Disseke olması değildir ("kırmızı kareler" ile işaretlenmiş) arka plan alanları seçin.
    3. Sonraki kullanımlar için kaydedilebilir eğitim dosyası oluşturmak için "Analyze" butonuna tıklayın.
  5. Uygun kızılötesi (IR) ve / veya ultraviyole (UV) lazerler kullanılarak mikrodiseksiyon gerçekleştirin.
    1. "Canlı" görüntüsünün üzerine seçili alanları kopyalayın.
    2. "Microdissect" Araç kutusunda, uygun IR yakalama veya UV kesme düğmelerini seçin.
  6. Diseksiyon tamamlandıktan sonra, QC istasyonuna LCM kapağı taşımak ve disseke doku / hücrelerin bir görüntü yakalamak. Başka bir yaklaşım önce QC istasyonuna hareketli slayt boş bir alanı kap yerleştirmek için, bu kullanıcının çeşitli büyütme fotoğraf çekmek için izin verir.
  7. Verimliliği daha da kaldırma değerlendirmek için Mikrodiseksiyon sonra ilgi doku alanının görüntüsünü yakalayabilir.
  8. İstediğiniz hücreleri başarıyla disseke varsa, ArcturusXT yazılım "mevcut sahne" butonuna tıklayın ve alt analizi için moleküler çıkarma prosedürünü başlatmak için LCM kapağı çıkarın.

Sonuçlar

Bir FFPE insan meme dokusu bölüm standart İHK protokolü 23 kullanılarak AE1/AE3 CytoKeratin immunohistokimyasal oldu. Boyama işleminden sonra, doku slayt ArcturusXT platformu üzerine yerleştirilir ve yukarıda tarif edildiği gibi SIVQ-LCM protokolü başlatıldı. Doku Mikrodiseksiyon için üstlerinden olamaz yana, İHK + lekeli hücrelerin görsel (Şekil 1A) ayırt etmek zor olabilir. Bu nedenle, daha iyi endeksi eşleşmesi ve daha iyi bir görüntü sağlamak için, ksilenler bi...

Tartışmalar

Biz FFPE insan göğüs dokusundan immüno-epitel hücreleri microdissect için SIVQ-LCM uygulanması için bir protokol mevcut. Örneğin SIVQ gibi bir görüntü analiz algoritması kullanılması, eller-on mikrodiseksiyon işlemi için gerekli süreyi azaltır. Operatör zaman ve çaba genellikle ilgi hücrelerinin tam diseksiyon için oran-sınırlayıcı bir adımdır, çünkü bu alan için potansiyel olarak önemli bir ilerlemedir. Büyük olasılıkla da piyasada mevcut diğer mikrodisseksiyon araçlara SIVQ ve ...

Açıklamalar

Michael R. Emmert-Buck lazer yakalama mikrodiseksiyon kapsayan NIH-tutulan patent üzerinde bir mucit ve NIH Teknoloji Transferi Programı aracılığıyla telif bazlı ödeme alır.

Teşekkürler

Çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri İntramural Araştırma Programı, Ulusal Kanser Enstitüsü, Kanser Araştırma Merkezi tarafından kısmen desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Positive Charged Glass SlidesThermo Scientific4951Plus-001
Xylenes, ACS reagent, ≥98.5% xylenes + ethylbenzene basis Sigma Aldrich247642CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.
Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, AnhydrousThe Warner-Graham Company6.505E+12CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.
Arcturus CapSure Macro LCM CapsLife TechnologiesLCM0211
ArcturusXT Laser Microdissection InstrumentLife TechnologiesARCTURUSXT
AutoScanXT SoftwareLife TechnologiesAn optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM.
Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ)University of MichiganThis tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu]

Referanslar

  1. Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
  2. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
  3. Edwards, R. A. Laser capture microdissection of mammalian tissue. J Vis Exp. (8), (2007).
  4. El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian journal of gastroenterology. 44, 787-795 (2009).
  5. Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature. 1, 586-603 (2006).
  6. Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & experimental metastasis. 25, 81-88 (2008).
  7. Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in molecular biology. 980, 61-120 (2013).
  8. Silvestri, A., et al. Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 90, 787-796 (2010).
  9. Eberle, F. C., et al. Immunoguided laser assisted microdissection techniques for DNA methylation analysis of archival tissue specimens. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 12, 394-401 (2010).
  10. Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC medical genomics. 4, 48 (2011).
  11. Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC medical genomics. 2, 13 (2009).
  12. Zheng, J., Garg, S., Wang, J., Loose, D. S., Hauer-Jensen, M. Laser capture microdissected mucosa versus whole tissue specimens for assessment of radiation-induced dynamic molecular and pathway changes in the small intestine. PloS one. 8, e53711 (2013).
  13. Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury. J Vis Exp. (74), (2013).
  14. Iyer, E. P., Cox, D. N. Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons. J Vis Exp. (39), (2010).
  15. Hipp, J., et al. SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling. Journal of pathology informatics. 2, 19 (2011).
  16. Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology. J Pathol Inform. 2, 13 (2011).
  17. Hipp, J., et al. Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm. Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).
  18. Hipp, J., et al. Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification. Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).
  19. Hipp, J., et al. Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ. Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).
  20. Cheng, J., et al. Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies. Journal of pathology. 2, 37 (2011).
  21. Roy Chowdhuri, S., et al. Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples. Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).
  22. Hipp, J., et al. Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool. Journal of pathology. 2, (2011).
  23. Hanson, J. C., et al. Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments. Nature. 6, 457-467 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 89SIVQLCMki iselle tirilmi t pdijital patolojig r nt analiziArcturusXT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır