Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Özet

Hematopoietik kök ve projenitör hücreler (HSPCs) ve kemik iliği niş arasındaki etkileşimin doğası tam olarak anlaşılamamıştır. Özel donanım modifikasyonları ve çok adımlı bir satın alma protokolü ex vivo görüntünün kemik iliği alanları içinde bağlantılı etiketli HSPCs, izleme etkileşimleri ve hareket için iki-foton ve konfokal mikroskopi kullanımına izin verir.

Özet

Sakinleştikten ve çoğalması, kendini yenileme ve farklılaşmış döl üretimi arasında hassas bir denge sayesinde, hematopoetik kök hücreler (HKH'lerin) tüm olgun kan hücresi soylarının ciro korumak. Belirli HSC kaderi açan karmaşık sinyallerin koordinasyon HKH'lerin ve hala anlaşılamamıştır karmaşık kemik iliği mikro, ^[1-2] arasındaki etkileşim dayanır.

Biz çok adım confocal ve in vivo görüntüleme teknikleri iki-foton ile istikrarlı hayvan konumlandırma için yeni geliştirilen bir örnek tutucu birleştirerek, yüksek çözünürlüklü 3D HSPCs içeren yığınları ve onların çevresindeki nişler elde etmek ve zamanla onları izlemek nasıl mümkün olduğunu açıklamak Çok noktalı time-lapse görüntüleme yoluyla. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme tespit ex vivo olarak etiketlenmiş hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPCs) kemik iliği içinde ikamet verir. Dahası, multi-noktalı time-lapse 3D görüntüleme, odaha hızlı alma ayarları ile btained, HSPC hareket ve HSPCs ve stroma hücreleri arasındaki karşılıklı etkileşimleri hakkında doğru bilgi sağlar.

GFP pozitif osteoblastik hücrelerde ilgili olarak HSPCs takibi bu yöntemin örnek teşkil eden bir uygulama olarak gösterilmiştir. Bu teknik, fare kemik iliği calvarium mekan içinde herhangi bir ilgi, uygun şekilde etiketlenmiş, hematopoietik ve stromal hücre izlemek için kullanılabilir.

Giriş

Kök hücre nişler gibi koku ampul, kas lifi, saç folikülü şişkinlik veya MSS subventricular ^4-7 olarak yıllardır ³ tanınan ve de birçok dokuda karakterize edilerek rağmen hematopoetik kök hücreler (HKH'lerin) ve kemik iliği mikro arasındaki etkileşimler ( BM) için hala tam olarak bağlı kemiğe boyunca tek hücrelerin yanı sıra dokunun kendisinin çok sıvı gözlemlemek zor anlaşılır. Farklı hücre tipleri ve düzenleme sinyallerinin karmaşık bir ağ sükunet arasındaki dengeyi düzenlemekten sorumlu olduğunu, kesip çıkartma veya HSC ya da mikro-kendisi stromal hücreler içindeki belirli genlerin aşırı ifade göre fonksiyonel çalışmalarda da bir dizi aracılığıyla, gösterilmiştir , çoğalma, genişleme ve HKH'lerin ^1-2 farklılaşması. HKH'lerin ve nişler arasındaki karışma yalnızca doğrudan gözlem yoluyla derinlemesine anlaşılabilir. Bu ach olduğunusadece mikroskopi açısından mevcut teknolojiyi birleştirerek gelişmiş görüntüleme protokollerinin gelişmesine ievable sayesinde, aynı zamanda numune tutucu çözümleri ve toplama yazılımı.

Fare kalvaryal kemiklerin BM bölmesine aktarılmıştır hematopoietik kök ve projenitör hücreleri (HSPCs) tek hücre çözünürlüklü canlı görüntüleme aşılanması HSPCs daha olgunlaşmamış hücrelerin SDF-1 ve VCAM-1-pozitif damarların ^8-9 yakınma ve bu lokalize olduğunu gösterdi onların döl ¹⁰ daha uzak ise GFP pozitif osteoblastik hücreler (osteoblast kısıtlı kollajen 1α promotör GFP sürücüler hangi Col2.3-GFP transgenik fare hattı,) 20 mikron - 15 içinde bulunur. Benzer gözlemler disseke ve kırık femur kemikleri ^11'den ve inceltilmiş tibeal kemiklerden ¹² elde edildi. Kalvarial kemik iliği Görüntüleme th içinde HSPCs doğrudan görselleştirme ulaşmak için en az invaziv bir yaklaşım kalırEIR yerli mikroçevresinin.

Herhangi bir canlı numune, görüntüleme ile, numune hareketi için gereksiz bozulmaları önlemek için mümkün olduğu kadar yine örnek tutmak için içsel bir ihtiyaç vardır. Nefes Kalvaryal kemik iliği görüntülerken kaçınılması gereken fare kafa salınım hareketleri neden olur. Onlar frontal kemiklerin engel çünkü beyin görüntüleme ve elektrofizyoloji örneğin kullanılan geleneksel stereotaktik sahipleri, kalvaryumun görüntüleme için uygun değildir. Canlı görüntüleme ve elektrofizyoloji çalışmaları ¹³ sırasında sıkıntı en aza indirmek için kullanılan bir fare tutucu başlayarak, 2 komponent tutucu bir ile tutuş sağlayan büyük bir koluna bağlı bir görüntüleme penceresi oluşturmak için fare kafasına sabitlenen küçük bir parça ile geliştirilmiştir mikroskop sahne sıkıca tutan ağır taban plakası. Hala yerinde kafasını hareketsizleştirerek ve yeterli m ortadan kaldırırken, fare kafatası kafa parçasını emniyete ücretsiz nefes sağlarnefes nedeniyle Hareketleri. Tutucu gövdeye baş parçasını birbirine bağlayan "kilit ve anahtar" mekanizması penceresinin büyüklüğü bu nedenle ameliyat basitleştirilmesi, konumlandırma netliği kadar artan en aza sağlar, ve aşamaya taban plakasının uygun Mikroskop doğru hizalama için izin verir. Doğru hareketli hücreleri izlemek için, çok noktalı bir zaman atlamalı protokol süresi noktaları arasındaki 5 dk aralıklarla zamanla hücrelerin izlenmesini sağlamak için tasarlanmıştır. Burada, etiketli MUYDUNUZ HKH'lerin col2.3GFP osteoblasitc muhabiri fareler ^10,14 enjekte ve yaklaşık 20 saat sonra görüntülenmiş. Tasarlanmıştır ve birden fazla saatlik bir süre içinde aynı bölgelerde hızlı çok noktalı zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için gereken görüntüleme ayarları detaylı olarak tarif edilmektedir fare tutucu.

Protokol

Hayvanların kullanımını içeren tüm işlemler, yerel mevzuata uygun olarak yürütülmektedir. Çalışmalarımız İngiltere'de Home Office yanı sıra Imperial College etik paneli tarafından onaylanmıştır. Izin prosedürleri proje ruhsat belgelerinde açıklanan ve her zaman hayvan refahını sağlamak yönergeleri izleyin edilir. Işin yapıldığı ülkenin hayvan deneyleri ile ilgili mevzuata uymak için emin olun.

1. Etiketleme ve HSPCs Enjeksiyon:

1. Lo Celso ^14-15 tarafından tarif edildiği gibi hasat hücreleri.
2. PBS içinde 10 ⁶ hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda, hücrelere hazırlayın. NOT: hücreleri saymak için Hemasitometre veya hücre ayırıcı tarafından sağlanan bilgileri kullanın; etiketlenmiş ve enjekte edilecek olan hücre sayısı (- 20,000 HSClerin, 100,000 - örneğin 10.000 leke 300,000 HPC), hücre tipine bağlı olarak değişir; en az 10 ⁵ hücreleri, 100 ul PBS içinde tekrar süspansiyon ile çalışma durumunda; Serum boyama inhibe gibi, herhangi bir serum olmadan PBS hücrelerin olması önemlidir.
3. 5 uM'lik bir nihai konsantrasyonda, hücre süspansiyonu için yaptığı ve solüsyonun dışında çökelmesi ve hücreleri etiketlemek için başarısız değildir boya sağlamak için derhal girdap süspansiyonu ekleyin.
4. , 5 dakika boyunca 500 x g'de eğirme sıvı ayrıldı ve, IV enjeksiyonu (- 150 ul ~ 100) için uygun bir hacmi içinde topağın tekrar askıda bırakılmasıyla yıkanmakta, daha sonra 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe
5. 200 ul PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri ve bir insülin şırınga içine toplar. NOT: fare için tüm hücre süspansiyonu tatbik edilmesini sağlar, bu nedenle hiçbir iğne ölü alanı vardır ve bu nedenle bir ensülin şırınga bilinen bir şırınga fazla tavsiye edilir.
6. Kuyruk ven enjeksiyon yoluyla ölümcül bir ışınlanmış fare içine hücreleri enjekte edilir. NOT: ti gelişir kemik iliği mikro (hematopoetik ve stromal bileşenleri hem de), üzerine Işınlama bilinir, önemli darbeben. Bu tutarlı bir ışınlama için zamanlama, hücre enjeksiyon (en iyi bütünleşme için radyasyondan sonra 4-24 saat) ve görüntüleme sağlamak için bu nedenle çok önemlidir. İşte ışınlama enjeksiyon öncesi 6 saat yapılır ve görüntüleme enjeksiyondan sonra 20 saat yapılır.
   1. Kuyruk toplardamanndan yapılan vasodilated görünene kadar sıcak odasına (37 ° C) fare yerleştirin.
   2. Süzgeç içine fareyi hareket ettirin ve dikkatle kuyruk damar içine iğne kaydırın.
   3. Ven içine hücreleri enjekte - enjeksiyon için hiçbir direnç karşılaştı edilmelidir.
   4. Hücreler, kemik iliği alanlarına göç olanak sağlamak amacıyla fare O / N bırakın.

2. Görüntüleme için Fare hazırlanması

1. Ince forseps ile bir çift ince bir çift makas gibi, steril bir ortamda bir kullanım öncesi başlık parçası ve mağaza otoklava.
2. Mümkün olduğu kadar taze anestetik Makyaj (0.38 ml Ketamin + 0.25 ml Medetomidin + 4.47 ml Su). NOT: otizofluran ve diğer enjektabl dahil olmak üzere ona onaylı anestetikler, çok etkili olacaktır. 1 saat için her 45 dakikada bir uygulanır, 50 ul - anlatılan kokteyl 30 üst-up ile, vücut ağırlığının her 10 gramı başına 0.1 ml periton içine tatbik edilecektir.
3. Gerekirse istendiğinde sahne kalibre, mikroskop ve yazılımı başlatmak iki foton lazer açın. Lazerler açın ve onları ısınmak ve görüntüleme için fareyi hazırlarken stabilize sağlar.
4. Intraperitoneal enjeksiyon ile anestezi için seçilen anestezik hazırlanan karışım (adım 2.2) kullanılarak fare anestezisi. Şimdi ve protokol boyunca düzenli aralıklarla pedal refleks ile derin anestezi başlangıcını izleyin. NOT: fare işlem boyunca dikkatle izlenmeli ve anestezi yıldırım görünüyorsa gerekir - (2.2 ayrıntılı olarak) (tipik sonra 45 60 dk) daha sonra bir üst-up dozunu uygulamak. Farklı yaş ve cinsiyet fareler arasında bazı varyasyon bekliyoruz. Bu koroYeterli önlemleri sağlamak için yerel veteriner memuru ile anestezi protokolünü görüşmek üzere tant fare refahını sağlamak için alınır.
5. Fare gözünde herhangi etanol elde etmek için değil sağlanması, bir doku üzerinde% 70 etanol ile kafa derisi üst çubukla.
6. Steril forseps ve makas kullanılarak, dikkatli bir yansıması için kalvaryumun alanı ortaya çıkarmak için kafa derisi orta bölümünü kaldırın: forseps ile cildi kaldırarak kulakları arasındaki başın arka kısmında küçük bir kesi yapmak. Cilt yukarıda tutarak, derinin altına makas kaydırın ve yavaşça istenen görüntüleme alanının dışından birlikte kesti.
7. Nemli tutmak için steril PBS ile nemlendirilmiş steril pamuklu çubukla maruz kemik silin.
8. Görüntüleme için hazır fare kafatası metal kafa parça takın.
   1. Bu, bir macun haline gelene kadar bir ağırlık tekne diş çimento yeterli miktarda karıştırıp ve hızlı bir şekilde s eklenecektir baş kısmının alt yüzeyine uygulamakkull.
   2. Çimento setleri önce, sonra, emin görüntüleme alanında herhangi bir diş çimento almak için değil yapım, fare kafatası üzerine baş kısmını yerleştirmek ayarlandığı için bekleyin.
   3. Kafatası nemli tutar Site içi Hidrojeli küçük bir miktar uygulayın.
9. Sahibine baş kısmını takın ve oluklar tutucu çentikler sığacak sağlanması, vidayı kullanarak sabitleyin.
10. Mikroskop aktarmadan önce steril PBS ile steril pamuk tomurcukları ile kafatası ve temiz gelen hidrojel çıkarın.
11. , Mikroskop aşamaya yuvasını fare altındaki ısıtma mat konumlandırmak, rektal termometre probu yerleştirin ve yapışkan bant ile sahnede yerde her şey güvenli.
12. Onlar anestezi altında iken kurumasına etmemelerini sağlamak için fare gözleri oftalmik merhem küçük bir damla koyun. NOT: anestezi altında iken fare görüntüleme işlemi sırasında herhangi bir anda sahipsiz bırakılmamalıdır.

3 İn Vivo Görüntüleme: Yüksek çözünürlüklü Bacaları ve Time-lapse Toplama

1. Göz parçaları ile kafatası odaklanın.
   1. , Saflaştırılmış, steril su ve bir su daldırma lens kullanarak görüntüleme penceresini doldurmak o su damlasını değecek şekilde indirin.
   2. Işık kaynağı gibi harici bir lamba kullanarak, mikroskop mercekleri kullanılarak kafatasının üst Odak.
   3. Merkezi dikiş üzerinde görüntüleme alanını yerleştirin ve bir başlangıç ​​pozisyonu olarak koronal sütür bulmak için kafa arkasına doğru hareket ettirin.
2. Eksitasyon ve emisyon tabloda belirtilen ilgili florofor etkili uyarı ve tespit izin vermek için mikroskop ayarlayın. NOT: Geleneksel galvanometre tarama kafası LAS-AF yazılım platformu ile çalışan bir Leica SP5 dik konfokal Burada kullanılan iken, prosedür kolayca diğer mikroskop / yazılım platformları çoğaltılmış olabilir. Burada kullanılan objektif Leica HCX IRAPO L 25x W / 0.95 NA bDiğer üreticilerin ut eşdeğer lensler uygun büyütme ve yüksek NA mevcuttur
   1. 512 x 512 piksel hem XY görüntülerin yanı sıra 400 Hz 3D Z-yığını ve set görüntüleme hızı ve çözünürlüğü yakalamak için bir moduna yazılımı yerleştirin. NOT: Kurulum ve donanım burada 620 mikron bir görüş alanı neden ve bu diğer platformlarda farklı olabilir.
   2. Birden fazla kanal / parça yanı sıra toplama yöntemi en azından yığınlarının mümkünse veya çerçeveler arasında var ayarlarını değiştirmek için ayarlanmış sağlamak, yakalanan edebiliyoruz, böylece yazılımı ayarlayın. Her yığının edinimi sonunda lazer aydınlatmasını kapatmak, 3 bağımsız çekim ayarlarını ayarlayın. Not: üç kanal kanallar arasında çapraz etkiyi azaltmak için, bu işlem için gerekli olacaktır.
   3. Kurulum iki foton SHG kemik sinyali (840 nm uyarım; 400-440 nm emisyon) için ilk ardışık tarama için ayarlar; MP lazer için deklanşörü açın ve M sağlamak% 25 ve lazer açıldığında - P kazancı ve ofset doğru kurulum vardır, lazer güç 12.5. Tek dedektör gibi uygun bir PMT seçin ve beyaz rengini değiştirmek. Not: Mevcut bir parlak, daha derin sinyal elde etmek için ne zaman uygun filtreler ile NDD dedektörler kemik tespiti için kullanılmalıdır.
   4. Tekrar kanal kurulumu kombine otofloresansı için GFP kanal için kullanılan prosedür (543 nm uyarma; 560 - 600nm emisyon) ve DiD (633 nm uyarım; 650-720 nm emisyon) ikinci ayarları altında iki uygun PMT kullanarak, tarayın. Otofloresansı için yeşil ve DiD için kırmızı kanal rengini değiştirin. Not: Otomatik-floresan kanal iki kanal yerleştirilmiştir edilir DiD pozitif hücrelerin daha kolay algılanmasını sağlar gibi yeşil kullanılarak - autofluorescent hücreler nedeniyle iki kanal süre olmak üzere sarı / turuncu renkte görünür DiD hücreleri sadece onlar sadece görünür beri kırmızı olarak görünür kanal DiD. Otomatik floresan kanalgörüntüleme amaçları GFP kanal ile karışıklığı önlemek için, kullanıcının, bu farklı bir renk değiştirilebilir istediği, ancak, yalnızca, bu karşılaştırma için kullanılan herhangi bir son analizde kullanılmaz.
   5. Son olarak kurulum GFP için üçüncü ve son tarama (488 nm uyarma; 500-530 nm emisyon); Gerekli ve sonra etrafında% 15 488 nm lazer çizgisinin lazer gücünü ayarlamak veya lazer için uygun bir seviye sadece aktif dedektörü olarak uygun bir PMT seçmek ve yeşil onun PseudoColor değiştirmek, kullanıldıkları takdirde obtüratör açık olduğundan emin olun.
   6. Seçilen kanalın bir önizleme taraması başlar ve dedektör Kazancı ayarlamak ve optimal pozlama için Ofset için bir 'Canlı' görüntüleme modunu etkinleştirin. Sıralı penceresinde her tarama için bu işlemi tekrarlayın.
   7. Kolayca yeniden bu çok kanallı tarama ayarları kaydedin. NOT: Bu kullanıcı sonraki oturumlarda ayarlarını yeniden sağlar.
3. 'Mark a olarak adlandırılan çok-pozisyon yakalama etkinleştirinnd gösterdi yazılım 'bulun ve koordinat noktalarını sıfırlayın.
4. Merkez ve koronal sütür arasındaki kesişme başlayarak, kemik görüntüleme alanını taramak, hem otoflüoresanı kullanarak kemik iliği alanının derinliğini tarama (sözde yeşil renkli) ve DiD (pseudo-kırmızı renkli) bir bileşik görüntüsü. NOT: autofluorescent hücreler her iki kanal mevcut olabilir ve etiketlenmiş hücreler kompozit görüntü kırmızı-tek hücreler olarak görünür MUYDUNUZ ise kompozit görüntü sarı / turuncu görünecektir.
5. Bir hücre tespit edildiğinde, Mark "sol taraftaki Yeni Pozisyon simgesini ekle" Find "penceresinde tıklayarak aracını yeni bir koordinat konumuna (x, y ve z) olarak işaretlemek 'Mark ve bulun' .
6. Görüş mevcut alan incelendiğinde edildiğinde, sol / sağ / yukarı / aşağı ya bakış bir alanın evre mesafe taşımak. Yavaş yavaş th solundaki bütün görüntüleme pencere alanının etrafında çalışma, görüş her alan için bu işlemi tekrarlayıne merkezi sütür, fare burnuna doğru hareket. Merkezi dikiş çatallanma görünürde sonra, dikiş sağ tarafına gidin ve (koronal sütür doğru, yani) ters yönde sol tarafı taramaya işlemi tekrarlayın. Kullanarak ilgi herhangi bir yeni hücre koordinatlarını işaretleyin 'Mark ve Bul' aracı.
7. Görüntüleme penceresi Tarama işlemi tamamlandıktan sonra, 'Mark ve bul kullanmak noktaları gözden aracını (istenen noktayı seçin ve tek tek her noktasını gözden). Her pozisyon için her hücrenin Z-yığını üst ve alt Set, (birçok yazılım platformları boşluk yakalayan azaltır her pozisyon için bağımsız z-yığınları yapmak için izin verecektir). Her noktası için, netleme ve aşağı ve 3D z-yığın yakalama için üst ve alt Z pozisyonlarını ayarlayabilir ve bireysel noktasını güncelleştirmek 'Mark ve bul. 5 um Z-Stack aralığını ayarlayın ve uygun bir kalite her sıralı tarama kanal için ortalama: Çizgi or Çerçeve ortalama. NOT: ortalamasına taramalarının sayısını arttırmak iktisap süreyi artırır.
8. Tüm tarama işlemine başlarken tarafından ilgi her bir nokta için yüksek kaliteli referans yığını Edinme (genellikle oldukça "Capture" den 'Başlat' olarak anılacaktır). NOT: Bu tarama gelecekte yüksek hızlı görüntüleme için bir referans olarak hareket edebilir.
9. Bir kez, yüksek kaliteli tarama ile tamamladı yakalanması için bir time-lapse ayarını etkinleştirin.
10. Time-lapse ayarları, istenilen uzunlukta (örneğin, 5 saat) 5 dakika ve genel çalışma süresi için zaman aralığını ayarlayın. Genel tarama için bu ayarları 'Uygula'. NOT: Bir 5 dakika zaman atlamalı aralığını sağlamak için bu tarama süresini azaltmak amacıyla, bir, ortalama için kullanılan taramaları sayısını azaltmak 512 x 512 piksel çözünürlüğünü sınırlamak, gerekli faz düzeltme ile (çift yönlü için tarama dönüştürmek gerekebilir ) Her iki tarama yön align ve / veya 600 Hz veya daha fazla (daha fazla 600 tarama hızını arttırmak içinHz) gösterdi yazılım platformu için görüntüleme alanının yakınlaştırma neden olacaktır. Bu sıralı görüntüleme modu, başlangıçta bir yüksek kaliteli görüntü yığını elde etmek için kullanılan iken, eşzamanlı kazanım time-lapse görüntüleme sırasında hızını artırmak için kullanıldığına dikkat etmek de önemlidir - bu ekstra yerleştirir kanallar arasında bazı hafif çapraz konuşma neden olabilir doğru ayrılmış referans yığınlarının ilk yakalama üzerinde önemi.
11. (Göstermiştir yazılımında 'Başlat' düğmesine tıklayarak önceki gibi) görüntüleme başlayın. NOT: kurumasına ve vital bulguları ve ısıtma-pad sıcaklığını izlemek değil, düzenli, gerektiğinde fareyi aşırı doz için dikkatli olmak, daha küçük dozlarda uygulanması ile anestezi uygun seviyesini korumak amacını sağlamak için su kontör emin olun boyunca.
12. Bittiğinde, rektal prob ve h telleri sağlanması, sahibinden lensi kaldırın ve daha sonra mikroskop aşamasından tutucusunu çıkarınmat yeme zarar görmezler.
13. Sahne sahibinin baş kısmını sökün ve dikkatlice fareyi çıkarın. Servikal dislokasyon kullanarak fare itlaf ve kafatası kapalı takarak metal kafa-parça kaldırın. Verilerin diske kaydetmek ve daha sonra analiz için sunucusuna aktarmak. Not: baş parçası, ideal olarak birkaç saat boyunca aseton içinde daldırma ve son olarak kalan çimento kapalı sürtünme ile temizlenir.

Sonuçlar

Yapılan özel bir kalvaryumun görüntüleme penceresi dahil yüksek hassasiyetli fare tutucu ölümcül ışınlanmış alıcı farelerde (Şekil 1A) enjekte FACS arıtılmış, etiketli HSPCs uzun süreli görüntüleme sağlar. Tipik olarak, 15 ile enjekte edilmesinden sonra - 20 bin işaretli hücrelerin, 8-15 hücreler kafatası ertesi gün kemik iliği görüntüleme alanı içinde genellikle tanınabilir. Tespit HSPCs (Şekil 1C ve film) 4D zaman atlamalı filmleri izledi 120 mikron kalınlığında, (Şekil 1B), - İşte yaklaşık 90 kemik iliği alanları HSPC içeren tek hücreli çözünürlüklü 3D yığınları kazanmak için nasıl gösterilir.

Diş çimento optimal hazır değilse, optimumun altında sonuçlar, örneğin, su ve tutucunun üst tepesinde edilebilir olsa da, sigara kapalı alanlardan akabilir, elde edilir, herhangi bir zaman süresi olan daldırma objektif değildir su içine siyah f yol açar Rames. Görüntülerin bazı sürüklenme ani atlar yol ancak fare ilerleyici ayrılması yol açan, uygun olmayan çimento yapışma ile vurgulanmış ve kurmak görüntüleme düzensizlikler tarafından edilebilir nedeni fare tutucunun malzemelerin termal genleşme kaçınılmazdır time-lapse görüntüleme sırasında odak. Daha önce görüntülenmiş pozisyonları Revisiting zaman çok noktalı time-lapse görüntüleme sırasında Drift de sahne hareketleri yanlışlıklar neden olabilir. Zaman atlamalı filmleri Drift ve kekeme eserler görüntü kaydı algoritmaları kullanarak düzeltilebilir.

Tablo 1. Uyarma ve emisyon ayarları.

Renk Kanal	Uyarma	Emisyon
GFP	500-530 nm
Otofloresans	543 nm	560-610 nm
DiD	633 nm	640-700 nm
SHG	840 nm (MP)	400-450 nm

13px; "> 488 nm

Fare kalvaryumun içinde HSPCs in vivo 4D görüntülemede Şekil 1.. Deney (A) Taslağı (B - C).. Elde edilmiş sonuçlara örnekler (B), 3 boyutlu bir yığından 2B dilim (toplam derinliği 114 um), kollajen kemik (beyaz) bir sinyal ihtiva eden etiketli MUYDUNUZ hücreler (kırmızı) , autofluorescent cells (sarı) ve osteoblastik hücreleri (yeşil). Ölçek çubukları:. Osteoblastik hücreleri (yeşil) yakınına göç bir etiketli MUYDUNUZ HSC (kırmızı) gösteren bir 4D time-lapse film 100 mikron (C) 2D dilimleri. Noktalı çizgi, hücre yer değiştirmesini ortaya koymaktadır. Ölçek çubukları: 50 um (B) ve 100 um (° C). NOT:. Video makalede sırasında gösterilmiştir (C) time-lapse edinimi elde film , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Ne gerçekleştirildi?

Bu protokol Fare kalvaryal kemik iliğinde arıtıldı FACS göçünü ex vivo etiketli nakledilen HSPCs izlemek için hızlandırılmış çok boyutlu görüntüleme kullanır. Tek nakledilen hücrelerin tanımlanması elde edilmiştir ve bu yüksek doğruluk ile zaman (saat) uzun süreler boyunca takip edilmiştir. Solunum kaynaklı hareket eserler minimize edilmiş ve hücreler tekrar tekrar uzun bir zaman boyunca reimaged edilmiştir.

Gelecek tarifi nedir?

Tekniğinin geliştirilmesi kısaltmak ve Not (fare kurtarma işlemini kolaylaştırmak için bir hafta veya daha fazla ve bu izofluran gibi gaz anestezik kullanımı boyunca, birden fazla gün görüntüleme için izin kurtarma deneylerde doğru ilerleme olabilir: Kurtarma deneyler kesinlikle gerektirir Steril cerrahi koşullar ve uygun analjezik uygulanması). DevBir in vivo boyaların daha büyük bir renk paleti yanı sıra, aynı zamanda, çok-etiketleme deneyleri kolaylaştırmak kemik iliği içinde hücre-hücre etkileşim daha fazla bilgi sağlar ve gelecekte daha karmaşık deneyler için sağlayacak hematopoietik hücrelerin etkili genetik etiketleme e Gelişim. Ayrıca, birden çok kemik iliği yapıları ve stroma bileşenlerinin eş zamanlı etiketleme HSPC nişler yer alan olayların bir daha tam bir resim sağlayacaktır. Hızlandırılmış filmlerin görüntü kararlılığı ayrıca stabilize edici mikroskop hem de görüntü tarihi algoritmaları kullanarak numune ve postacquisition sıcaklık gradyanları minimize preacquisition geliştirilebilir.

Sınırlamalar:

Açıklanan tekniği bazı sınırlamalar sunar. Enjekte edilebilir anestetiklerin uygulamasının ardından farelerin hayatta kalma süreleri önceden tahmin edilemez ve bu bireysel yanıtına bağlı olarak tecrübe komplikasyonlara çok kolayanestezik. Fare anestezi kurtarmak için ve fare ideal zaman atlamalı görüntüleme süresini sınırlayarak, tahsil edilecek olup olmadığını dikkatlice planlamak önemlidir genellikle, bir görüntüleme oturumu artık zordur. Enjekte anestezik kullanılması, her görüntüleme oturumda sürebilir zaman sınırlar. Bu anestezik küçük bir doz EÖ tarafından anestezi uzatmak mümkün olsa da, zor bu doğru ve fareyi doz aşımı in vivo görüntüleme erken fesih en sık nedenlerinden biridir gerçekleştirmek olduğunu. Izofluran> 2 saat uzun idare nadiren başarılı sonra gaz anestezi fare ancak hızlı iyileşme, daha az toksik ve daha uzun bir ilk görüntüleme oturumları için izin verir. Tekniğin diğer kısıtlılığı nedeniyle hızla görüntüler elde etmek için gerekliliğine, çok noktalı time-lapse görüntüleme sırasında elde edilebilir görüntülerin sınırlı çözünürlük. Fokal sürüklenme veya alanı ile birleştiğinde, (diski atlar) Yukarıdaki ussed, hücrelerin izleme zorlaştırabilir.

Alternatif yöntem Karşılaştırma:

HSPCs genellikle DiD lipofilik boya ile etiketlenmiş, ancak ^[16] gözden gibi DiR ve DII boyalar, eşdeğer alternatifler ve diğer hücre boyalar sürece yeterince parlak kullanılabilir vardır. Hücrelerin ex vivo etiketlendirmesi HKH'lerin uzun vadeli fonksiyonunu etkilemez gösterilmiştir olsak da, bu hücre bölünmesiyle seyreltildi ve neredeyse sınırlama (ya da herhangi bir başka kimyasal boya) sahiptir. HKH'lerin transplantasyonu izleyen ilk günlerde çoğalırlar yana, bu hücreler için gürültü oranı sinyal hızla bozulur. Genetik manipülasyon ve floresan proteinleri ifade ile hücrelerin etiketlenmesi endojen floresan proteinleri kafatası kemik yoluyla tespit edilebilir bir sinyal üretmek için yeterince yüksek seviyelerde ifade edilir sürece, uygulanabilir bir alternatif bir yöntemdir. Alternatif techn vardırMevcut iques kendi yararları ve sınırlamaları ile, kemik iliği alanı içinde her HSPCs görüntülenmesine gerçekleştirmek için. Konfokal görüntüleme cerrahi matkap ile tibia ve kemik minesinin incelmesi ekspojurlar takip ederken, fiber optik tabanlı görüntüleme cihazlarının yerleştirilmesi, uzun kemiklerde ^[8] kemik iliği sulandırma görüntüleme için izin ^[12] HSPCs ikamet detaylı görüntülerini üretti uzun kemiklerin çevresel alanları. Bununla birlikte, bu yöntemler, çok daha fazla invasif burada tarif edilen ve bu nedenle aynı fare içinde aynı kemik iliği alanda odaklanarak görüntüleme tekrar ederiz mani olandan bulunmaktadır. Ayrıca, bu teknikler geniş bir çevre dokuda hasar kaçınılmaz cevap veren gözlenen hücrelerini etkiler olasıdır. HSPCs kesilmiş, çatlak uyluk ^[11] üzerinde yer lamelleri ile kısa bir süre için görüntülenmiş olan, üzerine HSPCs doku bu sert, ancak hazırlama etkisi değil, Clear, ve teknik tek bir zaman noktasında elde etmek için gözlemler benzersiz kullanılmıştır. Sabit kemikler lekeli, seri bölüme ayrılır ve elde edilen görüntüleri damar atmalarını kullanılan, özellikle mükemmel 3D çözünürlük sağlayan bir 3D modeli yeniden inşa edilmiştir ^[17], ve son zamanlarda Lazer Tarama Cytometry (LaSC) kantitatif elde etmek için kullanılır olmuştur in situ HSPCs tedbirler hakkında, ^[18] immunboyama tarafından vurgulanan, ancak hücreler davranışları hakkında herhangi bir zamansal bilgi sağlayamıyoruz. Yeni yöntemin tarif edilen teknikler 4D hücrelerin izlenmesi için 3 boyutlu olarak iyi bir çözünürlük, yeterli geçici örnekleme bir kombinasyonunu sağlar ve bu nedenle, kemik iliği ile etkileşim HSPCs uzun süreli izleme elde etmek için ideal bir yaklaşım sağlar, göreceli olarak-invaziv mikroçevresinin.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine (Narketan 100 mg/ml)	Vetoquinol	407575 0107 C	Other anesthetics may be used in place of this.
Medetomidine (Domitor 1 mg/ml)	Elanco	134800-2	Other analgesics may be used in place of this.
Vibrant DiD cell labeling solution	Roche Products Ltd.	V22887	Other colors are available and may be used if required.
Lacrilube ophtalmic ointment	Allergan	n/a	avaliable by prescription by the local vet
Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement	Associated Dental Products Ltd. via Kemdent	SUN527	We use shade A3, but any shade of cement can be used.
PBS	multiple equivalent
Insulin syringes	Terumo Medical Corporation	SS10M3109	1 ml, 31 G
Mouse restrainer	Harvard Apparatus	340031	Cone type (small)
Autoclaved forceps and scissors	Agar Scientific	AGT577 AGT5034	Iris scissors - 90 mm; Dumont HP tweezers (0.06 mm tip)
Weigh boat and cement stirrer	VWR	611-1996/231-0370	5 ml weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor
Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser	Leica Microsystems		Call for quote
25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95)	Leica Microsystems	11506323	HCX IRAPO L lens
Custom designed mouse holder	Imperial College Engineering Workshop		See Figure 1 for details
Heating pad with rectal thermometer probe	BASi Instrumentation	FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502	Heat mat/ Control box/ Thermometer probe