Genomik Kopya Sayısı Variantların Algılama için dizi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (CGH Array)

Özet

Genomik kopya sayısı varyantları tespiti için Dizi CGH G-bantlı karyotip analizi yerini aldı. Bu kağıt teknolojisi ve teşhis hizmet laboratuvarında uygulanmasını açıklar.

Özet

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient’s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Giriş

Bu silmeler veya kromozomal bölümlerinin ekstra kopyaları zihinsel engeli, dismorfik ve congentical malformasyonlar neden olduğu uzun yıllardır bilinmektedir ve bazı durumlarda genetik sendromlara neden olmuştur ^1. Ancak, bu değişikliklerin genom tespiti için 2000'li yılların ortalarında kadar mevcut tek teknoloji olamaz dengesizlik bölge ve doğasına bağlı olarak, 5-10Mb etrafında bir çözünürlüğe sahip kromozom analizi,-bantlı, G, ve hangi Malzeme, aynı bant modeli farklı bir kromozom bir bölge ile ikame edilmiş anormal kromozom algılar. Böyle situ hibridizasyon ve multipleks ligasyon-spesifik prob amplifikasyon floresan gibi yardımcı sitogenetik teknikler şüpheli spesifik sendromik dengesizlik durumlarında, belirli loci sorgulama için kullanılabilir olmuştur, ama bu dizi karşılaştırmalı genomik hibridizasyon getirilmesi kadar değildi (dizi CGH) Rutin klinik tanı s içinekopya sayısının genom algılama (CNVs) varyantları ervice ^2-5 (genellikle 120KB civarında) bir ölçüde artmış çözünürlükte mümkün oldu. Bazı bölgelerde normal popülasyona ^6-7 yaygındır için araştırma çalışmaları yanında, klinik hizmet çalışmaları diğer CNVs ederken, daha önce saptanamayan, otizm ve epilepsi ^8-11 gibi neurodisabilities ile ilişkili, CNVs olduğunu göstermiştir.

Bu yazıda anlatılan protokol bizim İngiltere Ulusal Sağlık Servisi (NHS) klinik tanı laboratuvarında kullanılan; Bu devlet destekli hizmet maliyetini en aza indirmek için yeni melezleme stratejileri, toplu test ve robotik kullanın.

Aşağıda detayları verilen protokol önce, yüksek kaliteli DNA, uygun başlangıç ​​malzemesi, yaygın olarak kan, kültürlenmiş hücreler ya da doku numunelerinin elde edilmesi gerekmektedir. 280 emme oranı (b gerekir: Spektrofotometri konsantrasyonunun ölçülmesi için kullanılabilir ve 260 kontrol (> 50 ng / ul olması gerekir)e 1,8-2,0). Jel elektroforezi, DNA önemli bir bozulma olmadan yüksek moleküler ağırlığa sahip olup olmadığını kontrol etmek için kullanılabilir.

Bu protokol otomatik sıvı taşıma robotik kullanarak çalıştırmak başına 96 numune etiketleme yüksek verim laboratuvarlar için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, otomasyon olmaksızın daha düşük verim laboratuarlar için adapte edilmiş olabilir.

Protokol

1. Etiketleme Reaksiyon

1. Kullanıma hazır -20 ° C'de plakalar ve mağaza 96 oyuklu içine üretici tarafından tavsiye edilen derişimlerde, ön kısım siyanin 3 ve 5 etiketli dUTPs, etiketlenmemiş nükleotidleri ve rastgele primerler Kullanımdan önce. Bu protokol, kısım uygun etiketli dUTP'nin 10.5 ul ve 10.5 ul etiketsiz nükleotidler ve her kuyuya rastgele primerler amaçları için.
2. Işıksız bir ortamda, yaklaşık 1 saat süreyle 4 ° C 'de nükleotid primerler hazır kullanımlı 96 gözlü levha, çözülme.
3. Çözülmüş sonra, ışıksız bir ortamda, en az 30 dakika, oda sıcaklığında, bu plaka dengeye getirin.
4. En az 15 dakika boyunca 60 ° C 'de DNA örnekleri dengelenmesi.
5. Bir sıvı kotarma robotu kullanılarak, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna, nükleaz içermeyen su akıtın.
   Not: su hacmi, her giriş bir DNA numunesi konsantrasyonuna bağlı olacaktır ve 50 ng / ul nihai konsantrasyona neden olmak için yeterli olmalıdır.
6. Bir sıvı han kullanılmasıdling robotu, 96-çukurlu plaka içinde bir kuyu içine pipet DNA 1 ug (1.5), 20 ul toplam hacim getirmek.
   NOT: Veri Elde niteliği tehlikeye bununla birlikte DNA'nın küçük miktarları kullanılabilir (değerli örnekler için, 400 ng kadar giriş DNA miktarları kullanılabilir).
7. Bir sıvı kotarma robotu kullanılarak seyreltilmiş DNA plakanın her oyuğuna dengelenmiş nükleotid primerler 20 ul transfer.
8. Şerit kapaklar (sıkı mühür önemlidir) ile 96-plaka Seal.
9. Bir ısıtılmış kapak ile, bir PCR makinesi içinde, 10 dakika boyunca 99 ° C'de DNA'nın denatüre edilmesi ve daha sonra tavlama primerler, 5 dakika için buz üzerinde soğuk ek.
10. Bir sıvı kotarma robotu kullanarak, iyice her DNA'lar ve pipet karışımı elde etmek için Klenow DNA polimeraz enzimi Exo 10 ul ekle.
    NOT: toplam hacim 50 ul olmalıdır.
11. 96 oyuklu plaka kapatın ve 16 saat 37 ° C'de inkübe edin.
    Not: 4 st daha kısa bir kuluçkalama, ancak bir O / N yeterlidircubation daha uygun olabilir.
12. Bir sıvı kotarma robotu kullanılarak, her bir durdurma tamponu 5 ul ilave edin.
    Not: etiketleme reaksiyonu için kullanılan reaktif bir özeti Tablo 1'de gösterilmiştir.

Adi Nükleotidlerinin 2. Kaldırma

1. Silika-membran esaslı spin sütunları ve özel spin kolon işleme robot (spin sütunları elle de işlenebilir) kullanarak nükleotidleri çıkarın. Üreticinin talimatlarını izleyin.
   1. Iyi bir 2 ml tüp her içeriğini aktarmak; kuyu kimlikleri ile ön-etiket bu.
      NOT: Bu adım, bir sıvı kotarma robotu kullanılarak elle veya tercihen gerçekleştirilebilir.
   2. Bir spin kolon işleme robot kullanıyorsanız, o zaman 2 ml tüpler, DNA saflaştırma kolonlanyla ve ilişkili tamponlar ile robot yükleyin.
   3. Silika etiketli DNA bağlamak için etiketleme reaksiyonuna 250 ul yüksek tuz, DNA bağlama tamponu (tampon PB) EkleMembran.
   4. 500 ul yıkama tamponu (PE tampon A) ile iki kez membran yıkama ile yabancı maddelerin çıkarın.
   5. ~ 12 ul bir hacim içinde, saflaştırılmış etiketli DNA kurtarmak için zara 15 ul düşük tuz elüsyon tamponu (EB tampon A) ekleyin.

3. Hyb Çiftleri birleştirin

1. Cyanine 3 ve 5-etiketli DNA uygun çiftleri birleştirin, COT-1 DNA üretici tarafından sağlanan engelleme karışımı ve sıvı taşıma robotu kullanarak üretici tarafından sağlanan hibridizasyon tamponu.
   NOT: Paylaşılan CNVs bir sorun yoksa bu hyb çiftleri (örneğin, rutin çok olduğu gibi, böyle bir kraniyosinostozlar hasta vs renal displazi hasta olarak fenotip-uyumsuz örnekleri, eşleştirmek numune vs örnek ve referans veya örnek olabilir ) aynı klinik olarak anlamlı KNV taşımak için olası. Bir referans DNA kullanıyorsanız, ticari DNA kaynağı önerilir, ve numune ile birlikte işleme tabi tutulmalıdır.
   1. Bir sıvı taşıma ro kullanılmasıBot, COT-1 DNA (3333 ng / ul) ekleyin üretici tarafından sağlanan her bir çukura 1.1 ul COT-1 DNA, 4.95 ul bloke karışım ve 24,75 ihtiva ettiği şekilde, 96 oyuklu plakanın her oyuğuna karışım ve hibridizasyon tamponu bloke ul hibridizasyon tamponu.
   2. Her bir oyuğa, uygun siyanin 3-etiketli DNA 9.35 ul ekleyin. Ön-ıslak her ipucu doğruluğunu pipetle geliştirmek için.
   3. Her bir oyuğa, uygun siyanin 5-etiketli DNA 9.35 ul ekleyin. Ön-ıslak her ipucu doğruluğunu pipetle geliştirmek için.
   4. 1 dakika boyunca 96 gözlü plaka ve vorteks kapatın. Her bir alt içeriğini toplamak için 96 oyuklu plaka dönerler.

4. Melezleme

1. 65 ° C bir melezleşme firinda bir destek slayt ve her dizi slayt için bir melezleme odasına prewarm.
   1. Diziler için geçerli olmadan önce bir ön-hibridizasyon inkübasyon etiketli DNA denatüre. 24 saat için bir döner fırın içinde hibridizasyon yapın.
   2. 30 dakika boyunca 70 ° C'de 96-çukurlu plaka inkübe ve ardından en az 5 dakika boyunca 37 ° C'de bırakın.
   3. 42 ° C'de ısıtılmış bir platform üzerinde çalışarak, kullanımdan önce bir hibridizasyon odasına her sırt slayt yükleyin. Conta slayt şeffaf kısmı melezleme odasının 'pencereli' kısmı ile aynı hizada olduğundan emin olun.
   4. Pipet önceden hazırlanmış melezleme karışımı 42 ul slayt destek dizi üzerindeki uygun pozisyonda üzerine (bölüm 3). Ön-ıslak her ipucu doğruluğunu pipetle geliştirmek için. Pipet yavaş yavaş emin her pozisyon merkezinde, üzerine sıvı kauçuk halka sınır dokunmaz.
   5. Destek slayt tüm pozisyonları doldurulur sonra, dikkatle üzerinde dizi slayt düşürmek ve melezleme odasına monte. Üzerinde yazılı olan dizinin yan destek slayt baktığından emin olun. Tam melezleme odası vidasını sıkın emin olun.
   6. Monte hibridizasyon odasına kontrol edin. EOrada kauçuk halka sınırları dışında melezleme karışımı kaçak ve melezleme odası dikey sonuna dinlenmiş olduğunda her hava kabarcığı yüksekliği ~ 4 mm olduğunu nsure. Hibridizasyon odasına döndürün ve konumda ve hareket etmiyor sıkışmış hava kabarcıkları olmadığını kontrol edin. Bunlardan herhangi varsa, odayı bankta bir keskin musluk verin. Tüm hava kabarcıkları hareket olduğunu kontrol edin.
   7. 24 saat boyunca 65 ° C'de döner fırına melezleştirme odasına yerleştirin. Fırın rotor dengeli olduğundan emin olun; Gerekirse diğer boş odaları kullanın.

5. Yıkama ve Tarama Slaytlar

1. Fazla etiketli DNA kaldırmak ve daha sonra her sonda floresan ölçmek için tarama diziler yıkayın.
   1. Fırın ve demonte dışarı hibridizasyon odaları atın. dizi ve conta slaytlar araya sıkışmış olacak; yıkama tamponu 1 bu batığın ve onları ayrı gözetlemek için plastik, düz kenarlı forseps bir çift kullanın.
   2. Diconta slayt scard ve tampon 1 batık bir rafa dizi slayt yerleştirin.
   3. Kuvvetli bir şekilde karıştırma 5 dakika için taze yıkama tamponu 1 ~ 700 ml bir dizi slayt yıkayın (pire ve manyetik bir karıştırıcı kullanılır).
   4. ~ 700 ml yıkama tamponu 2 dizi slayt aktarın ve kuvvetli bir şekilde karıştırıldı, 90 sn için yıkayın. Yavaşça yıkama tamponu 2 dışarı dizi slaytlar asansör, onlar kuru ortaya çıkmalıdır.
   5. Bir slayt koruyucusu kullanarak, tarayıcı bir slayt tutucu içine dizi slayt yükleyin. Dizi tarayıcıya slayt yükleyin ve dizi üreticisinin talimatları izleyerek tarayın.

Sonuçlar

Bir hibritlenmiş dizi Her prob kırmızı ve yeşil fluorochromes bir karışımı olarak görüntülenmiştir (Şekil 1). her bir prob için yeşil floresan sinyalinin kırmızı oranı tarayıcı tarafından ölçülür ve ilgili yazılım genomik pozisyonuna göre log2 oranları gibi, bu çizer ve dış önceden belirlenmiş sınırları düşen bölgeleri tanımlar. Elde edilen dizi izleri genomik dengesiz olarak tanımlanan bölgeler yoruma imkan vermek. Örneğin, Williams sendromu, kromozom 7...

Tartışmalar

Dizi CGH gibi triploidi gibi dengeli düzenlenmeleri veya ploidisi anormallikleri tespit olmayacaktır. Ayrıca, düşük seviyeli mozaik dengesizlikler tespit edilemeyebilir. Ancak dizi CGH birçok sitogenetik laboratuvarda yerini aldı G-bantlı kromozom analizi daha KNV tespiti için daha yüksek bir çözünürlüğe sahip. Bu nedenle genom KNV tespiti için geçerli altın standarttır. Gelecekte yeni nesil dizileme teknolojileri ile değiştirilebilir, ancak şu anda, kendi maliyet ve teknik karmaşıklığı bu h...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGH microarray 8 x 60K	Agilent	G4126
Array CGH wash buffers	Agilent	5188-5226
Array CGH hybridisation buffer	Agilent	5188-5380
Minelute purification kit	Qiagen	28006
Array CGH labelling kit	Enzo	ENZ-42672-0000