Meme Kanseri Cerrahisinde Potansiyel Yakın kızılötesi Floresans Görüntüleme Uygulamaları değerlendirilmesi için Phantom Doku-simüle

Özet

Near-infrared fluorescence (NIRF) imaging may improve therapeutic outcome of breast cancer surgery by enabling intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status. Using tissue-simulating breast phantoms containing fluorescent tumor-simulating inclusions, potential clinical applications of NIRF imaging in breast cancer patients can be assessed for standardization and training purposes.

Özet

Intraoperatif tümör lokalizasyonu ve meme koruyucu cerrahi (BCS) yetersiz bir sonuç cerrahi sınır durumu sonuç değerlendirilmesinde yanlışlıklar. Optik görüntüleme, özellikle yakın kızılötesi floresan (NIRF) görüntüleme, gerçek-zamanlı ve ameliyat tümör lokalizasyonu için bir araç ile cerraha sağlayarak BCS aşağıdaki pozitif cerrahi sınır sıklığını azaltabilir. Bu çalışmada, NIRF güdümlü BCS potansiyel standardizasyon ve eğitim amaçlı nedenlerle doku taklit meme hayaletleri kullanılarak değerlendirilir.

Normal meme dokusunun kıyaslanabilir optik özellikleri ile meme hayalet meme koruyucu cerrahi simüle etmek için kullanılmıştır. Tümör-taklit floresan boya indosiyanin yeşil (ICG) içeren kapanımlarını önceden tanımlanmış yerlerde fantomlara dahil öncesi ve intraoperatif tümör lokalizasyonu, gerçek-zamanlı NIRF güdümlü tümör rezeksiyonu, NIRF güdümlü için görüntülendicerrahi ölçüde değerlendirme ve cerrahi sınırların postoperatif değerlendirilmesi. Özelleştirilmiş bir NIRF kamera görüntüleme amaçları için olan klinik bir prototip olarak kullanılmıştır.

Tümör-taklit kapanım içeren Meme hayalet taklit ve intraoperatif tümör görüntüleme değerlendirmek için basit, ucuz ve çok yönlü aracı sunuyoruz. Jelatinimsi hayalet insan dokusuna benzer elastik özelliklere sahip olan ve geleneksel cerrahi aletler kullanılarak kesilebilir. Ayrıca, hayalet, sırasıyla, fotonların emilimi ve saçılmasını taklit insan meme dokusuna benzer üniforma optik özelliklerini oluşturmak için hemoglobin ve intralipid içerir. Epi-aydınlatma stratejileri ile derin yerleşimli tümörlerin (girişimsel olmayan) görüntüleme engellemektedir doku, yayıldıklarında zaman NIRF görüntülemenin ana dezavantajı fotonların sınırlı penetrasyon derinliği.

Giriş

Radyoterapi ardından meme koruyucu cerrahi (MKC) T _{1-T 2} meme kanserli ^1,2 ile meme kanseri hastaları için standart tedavi yöntemidir. Ek cerrahi müdahale veya radyoterapi ^3,4,5 gerektiren, BCS uygulanan 20 hastada% 40 pozitif cerrahi sınır ameliyat sonucu ölçüde intraoperatif değerlendirmede yanlışlıklar. Komşu sağlıklı göğüs dokusu rezeksiyonu pozitif cerrahi sınır sıklığını azaltmak olsa da, bu aynı zamanda bir kozmetik sonuç engel ve komorbidite ^6,7 artacak. Roman teknikleri bu nedenle primer tümörün yeri ve cerrahi ölçüde intraoperatif geribildirim sağlamak gereklidir. Optik görüntüleme, özellikle yakın kızılötesi floresan (NIRF) görüntüleme, r öncesi ve intraoperatif tümör lokalizasyonu için bir araç ile cerraha sağlayarak BCS aşağıdaki pozitif cerrahi sınır sıklığını azaltabilireal-zamanı. Son zamanlarda, bizim grup yüksek hassasiyet ⁸ ile primer tümör ve periton metastaz bu tekniğin uygulanabilirliğini gösteren, yumurtalık kanseri hastalarında tümör hedefli floresan görüntüleme ilk-insan yargılanıyor bildirdi. Meme kanserli hastalarda klinik çalışmalara geçmeden önce, ancak, BCS çeşitli tümör hedefli NIRF görüntüleme uygulamaları fizibilite zaten klinik öncesi hayaletleri kullanılarak değerlendirilebilir.

Aşağıdaki Araştırma protokolü floresan tümör taklit kusurları ⁹ ihtiva eden dokuya taklit meme fantom içinde NIRF görüntüleme kullanımını tarif etmektedir. Hayaletler ve ameliyat tümör lokalizasyonu, gerçek-zamanlı NIRF güdümlü tümör rezeksiyonu, cerrahi sınır durumu değerlendirmesi, ve rezidüel hastalığın tespiti simüle etmek için ucuz ve çok yönlü bir araç sağlar. Jelatinimsi hayalet insan dokusuna benzer elastik özelliklere sahip olan ve geleneksel s kullanılarak kesilebilirurgical aletleri. Simüle cerrahi prosedür sırasında, cerrah (aşikar inklüzyon durumunda) dokunsal bilgiler ve operatif alanın görsel muayene ile yönlendirilir. Buna ek olarak, NIRF görüntüleme cerrahi ölçüde gerçek zamanlı ameliyat bir geri besleme cerrahın uygulanır.

Bu NIRF görüntüleme floresan boyaların kullanımını gerektirir vurgulanmalıdır. İdeal olarak, flüoresan boyalar yakın kızılötesi tayf aralığında fotonlar yayarlar kullanılabilir (650-900 nm) dokusu içinde fizyolojik olarak bol moleküller tarafından foton emilimine ve saçılması en aza indirmek için (örneğin hemoglobin, lipidler, elastin, kolajen, ve su) ^10,11. Ayrıca, otofloresan (örneğin, canlı hücrelerin biyokimyasal reaksiyonları nedeniyle dokularda intrinsik aktivitesi flüoresan) en iyi tümör-zemin oranları ¹¹ ile sonuçlanan, yakın kızıl ötesi tayf aralığında en aza indirilir. Eşleştirilmesiyle NIRF tümör küçük kalkan için boyarted kısımları (örneğin, monoklonal antikorlar), flüoresan boyalar hedefli dağıtım ameliyat görüntüleme uygulamaları için elde edilebilir.

Insan gözü yakın kızılötesi tayf aralığında ışık duyarsız olduğu için, yüksek derecede duyarlı kamera cihaz NIRF görüntüleme için gereklidir. Intraoperatif kullanım için çeşitli NIRF görüntüleme sistemleri bugüne kadar ¹² geliştirilmiştir. Bu çalışmada, biz özel bir Münih Teknik Üniversitesi ile işbirliği içinde intraoperatif uygulanması için geliştirilen NIRF görüntüleme sistemi kurmak kullanılır. Sistem renkli görüntüler ve floresan görüntülerin eş zamanlı olarak satın sağlar. Fluoresans görüntüleri doğruluğunu artırmak için, bir düzeltme sistemi dokusunda ışık yoğunluğundaki varyasyonlar için uygulanmaktadır. Ayrıntılı bir açıklama Themelis ve arkadaşları tarafından sağlanır. ¹³

Protokol

1. Tümör-simüle İçermelerin için Silikon Kalıplar oluştur

1. Tümör-taklit kapanım, örneğin, boncuk veya mermerleri için model olarak hizmet edebilir istenilen şekil ve boyutta sağlam öğeleri toplayın.
2. İyice tümör modeli temizleyin. Silikon kalıptan kolay uzaklaştırılmasını sağlamak için, tümör modelleri, yapışma önleyici sprey püskürtme veya vazelin ya da balmumu ince bir tabaka ile kaplanabilir.
3. Pürüzsüz bir yüzeye sahip, ayrı bir ince duvarlı kare (plastik) kutusunda her modeli yerleştirin. Eğer gerekli ise, bir pozisyonda tutmak için kutunun altına modeli fikse. Silikon aşırı miktarda israfını önlemek için tümör modelinin kendisinde biraz daha büyük bir kutu kullanın.
4. Bir karıştırma kabına silikon bileşen A'nın Gerekli miktarda ve 10 silikon bileşen B ekleyin: ağırlıkça 1 oranına sahiptir. Hem de iyice karıştırınız. İsteğe bağlı olarak, vakum pompası silikon karışımının hava kabarcıklarını çıkarmak için kullanılabilir.
5. Yavaşça po, hava kabarcığı engellemek için plastik bir kutu içinde silikon karışımı ur. Silikon karışımı, en iyi sonuçları elde etmek için 45 dakika içinde işleme tabi tutulmalıdır.
6. Silikon karışımı, kalıp kesme ve tümör modelini çıkarmak için en az 6 saat boyunca katılaşmaya edelim. İsteğe bağlı olarak, silikon kalıp o temiz bir araya için uyum sağlayıcı bir zik ​​zak usul içinde kesilebilir. Silikon maksimum gücü 3 gün sonra elde edilir.

2. Tris-tamponlu tuz çözeltisi oluşturma

1. 6.1 g (50 mM) ile 8.8 g Tris ve 800 mi, deiyonize su (150 mM) NaCl eklenerek, Tris-tamponlu tuzlu su (TBS) çözeltisi oluşturur.
2. Hemoglobin (adım 3.3 ve 4.4) oksijen bloke etmek ve bakteri çoğalmasını önlemek için NaN ₃ 1.0 g (15 mmol) ekleyin. DİKKAT: NaN ₃ şiddetli bir zehirdir. Bu cilt ile veya yutulduğunda temas ölümcül olabilir. Bu bileşiğin toksisitesi, bir yetişkin insan için, çözülebilir bir alkali siyanür veya öldürücü dozun ile karşılaştırılabiliryaklaşık 0.7 gramdır. Üretici tarafından sağlanan her zaman olduğu gibi güvenlik yönergelerini izleyin.
3. 7.4 'e pH ayarlamak ve deiyonize su ile 1000 ml hacim getirmek.

3. Floresan kapsama alınan oluştur

1. Eritilmesi ve eritilmiş jelatin yerleştirildiği zaman, floresan boya akmasını önleyecek kusurları 2. adımda jelatin (adım 4.2) ile karşılaştırıldığında, agaroz daha yüksek bir erime noktası 50 mi TBS 2 g agarozun ekleyin. İsteğe bağlı olarak, ilave agaroz miktarı, sırasıyla, yumuşak veya fark edilebilir tümör inklüzyon elde edilmesi için 1 ya da 3 g kadar değiştirilebilir.
2. Kaynama noktası elde edilene kadar, bir mikrodalga kullanarak agaroz çamurun ısıtılması. Agaroz tamamen eriyene kadar iyice karıştırınız.
3. 1.1 g (17 mmol) hemoglobin ve lipid içi% 20 çevreleyen meme eşdeğer dokusundan (aşama 4) optik özelliklerini benzemeye sabit karıştırma altında agaroz karışıma 50 ml TBS içinde eritildi 5 ml ilave edilir.
4. (25 mg, 20.0 ekleme83.8 ml deiyonize su için indosiyanin yeşili flüoresan boya .8 mmol). Boya tamamen çözülür emin olun.
5. Pipetle bu çözeltiden 5.0 mi ve agaroz karışıma ekleyin 14 uM bir nihai konsantrasyon elde edilmiştir. Kendi uygun konsantrasyonu ile, arzu edildiği takdirde, ICG dışında floresan boyalar kullanılabilir.
6. Yavaşça bir şırınga (Şekil 1A) kullanarak sıcak agaroz karışımı ile 1. adımda oluşturduğunuz silikon kalıpları doldurun. Tüm kalıplar dolana kadar bu işlemi tekrarlayın.
7. Floresan inklüzyonlar yaklaşık bir saat boyunca oda sıcaklığında katılaşmaya edelim. Alüminyum folyo ile tüm kalıp kaplayarak ışıktan kapanım koruyun.
8. Katılaşma sonra, yavaşça kalıp açın ve dahil (Şekil 1B) dışarı basın. İsteğe bağlı olarak, dahil yüzeyinde eritilmiş agaroz karışımın küçük damla uygulamak için şırınga ucunu kullanın. Küçük tu aynı yerde bu işlemi birkaç kez tekrarlayarakmor mahmuzlarım infiltratif tümörleri taklit için oluşturulabilir.
9. Alüminyum folyo ile sarılarak ışık ve dehidratasyon agaroz kusurları korumak ve 4 ° C de, nemlendirilmiş bir depolama kabı saklayın.
   Not: bilinen bir konsantrasyonu optimum daha düşük ya da daha yüksek bir floresan boya konsantrasyonlarının kullanımı azalmış olacaktır flüoresan sinyal şiddet olarak sonuçlanmaktadır. Uygun floresan boya konsantrasyonunun üstündeki boya artan konsantrasyonlarda sinyal yoğunluğundaki azalma görünüşte beklenenin aksine söndürülmesi olarak bilinen bir fenomen kaynaklanmaktadır. Optimal konsantrasyon kullanılarak, fantom bir floresan boya maksimum derinliği nüfuz değerlendirilirken zorunludur.

Meme Phantom 4. Oluştur

1. Istenen boyut ve miktar, örneğin, cam ya da plastik çanak meme hayaletleri oluşturmak için bir kupa şekilli bir kalıp elde edilir. Kalıp kalıbına yapışmasını jelatin formu önlemek için pürüzsüz bir yüzeye sahip olmalıdır. Bir kalıp volüm500 ml e yeterli büyüklükte meme hayaletleri yaratacaktır.
2. 500 ml'lik bir hacme sahip bir göğüs hayalet oluşturmak için, 500 ml'lik TBS (aşama 2) ila jelatin 250 blum 50 g ekleyin. Sabit karıştırma altında 50 ° C'ye kadar jelatin çamurun ısıtılması.
3. Jelatin tamamen eriyene sonra, jelatin kanşım yavaş yavaş soğumaya bırakın ve bir sıcak su banyosu kullanılarak 35 ° C'lik sabit bir sıcaklıkta muhafaza.
4. Sürekli karıştırma altında, sırası ile, dokuda fotonun absorpsiyonuna ve saçılması simüle etmek için 5.5 g (85 mmol), sığır hemoglobin ve 25 ml% 20 lipid içi ekleyin.
5. En az 1 saat boyunca 4 ° C'de kupa şekilli kalıp Prechill. Daha sonra, agaroz tümör taklit dahil (Şekil 1C), önceden tanımlanmış derinliğine karşılık gelen bir seviyeye kadar kalıp içinde jelatin dökün. Jelatin karışım bir saat 30 dakika boyunca 4 ° C'de katılaşmaya edelim.
6. Sertleştikten sonra, yüzeyi üzerinde bir tümörle taklit floresan agaroz dahil konumuna fantom ve geçici bir küçük iğne ile dahil sabitleşmek. Üç tümör taklit floresan dahil olanlar en fazla tek bir meme hayali olarak dahil edilebilir. Yeterli boşluk (en az 5 cm) tek tek tümör-simüle inklüzyon (Şekil 1D) arasında tutulmalıdır.
7. Kırılma eserler yaratmadan her iki katmana bağlanması için izin veren, kalan kalıp hacmindeki sıcak jelatin karışımın geri kalan kısmı dökün. Kalıp üzerindeki floresan tümör taklit inklüzyon işaretleyin. Fantom 4 ° C'de O / N katılaşmaya edelim.
8. Bir kez katılaşmış, kapanım geçici sabitlenmesi için kullanılan iğneleri çıkarmak ve yavaşça kalıbın (Şekil 1E) meme hayalet çıkarın. Alüminyum folyoyla sararak ışık ve dehidratasyon meme hayalet koruyun ve 4 ° C'de nemlendirilmiş bir saklama kabı içinde saklayın.

ure 1 "fo: İçerik-width =" 5in "src =" / files / ftp_upload / 51776 / 51776fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil floresan tümör taklit kusurları ihtiva eden meme hayaletleri oluşturma 1. Sıralı aşamaları. Arzu edilen şekil ve boyutta silikon kalıp oluşturulduktan sonra, kalıplar bir şırınga (A) ile eritilmiş agaroz karışımı ile doldurulur. Büyüklüğü ve şekli, farklı tümör-simüle inklüzyonlar çalışmada (B) 'de üretildi. Daha sonra, erimiş jelatin karışım ince bir tabaka halinde özel bir kaplanmış ahşap meme kalıbın (C) dökülür. Sertleştikten sonra, tümör taklit inklüzyonlar, geçici olarak sabitlenmiş bir konuma sahip ve erimiş jelatin karışımı (D) başka bir katman ile kaplıdır. Sertleştikten sonra, meme fantom yavaşça kalıbın (D) ilave edilir. Fantom sonra taklit çeşitli NIRF görüntüleme uygulamaları (F) için uygulanabilir.ref = "/ files / ftp_upload / 51776 / 51776fig1highres.jpg" target = "_blank"> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

5. NIRF Kamera Sistemi Seti

1. Intraoperatif uygulama için NIRF kamera sistemi, meme kanseri cerrahisinde hedeflenen NIRF görüntüleme simülasyonu için gereklidir. Gerçek zamanlı ameliyat NIRF görüntülemesi için birkaç NIRF görüntüleme sistemleri araştırma kullanımı için şu anda kullanılabilir. Bu cihazlar arasında bazı farklılıklar olmasına rağmen, hepsi (floresan tümör inklüzyon uyarılması için) bir uyarı ışığı kaynağı ve fotonların tespiti için çok hassas bir görüntüleme cihazı içerir.
2. Yeterli bir dalga boyunda bir uyarım ışık kaynağı kullandığınızdan emin olun. ICG içeren tümör taklit kapanım için, 750 ve 800 nm arasında fotonlar yayar bir uyarım ışık kaynağı (örneğin, lazer) kullanın. Alternatif bir floresan boya kullanıldığında, emisyon dalga boyu ma uygun ayarlanmalıdır nufacturer talimatları.
3. Durumda NIRF kamera sistemi, istenmeyen arka plan sinyallerini filtrelemek doğru filtre kullanıldığından emin olmak için bir emisyon filtre içerir. ICG içeren tümör taklit kapanım için, 800 ve 850 nm arasında bir emisyon filtresi kullanın. Alternatif floresan boyalar üreticinin talimatlarına bağlı olarak, farklı emisyon filtreleri gerektirebilir.
   NOT: uyarma ve aşırı doygun görüntüleri önlemek için emisyon dalga boyları arasında sıfır örtüşme vardır emin olun. Ayrıca, görüntü elde etme süresi optimal floresan görüntü elde etmek için ayarlanmalıdır gerekebilir. Derin yerleşimli floresan kapanım ya da zayıf floresan sinyalleri durumunda, görüntü alma süresi min için birkaç saniye kadar artmış olabilir. Yüzeysel katkılar ya da kuvvetli floresan sinyalleri durumunda, elde etme süresi gerçek zamanlı video hızı fluoresans görüntüsü sağlamak için bir kaç milisaniye azaltılabilir.

Meme Kanseri Cerrahisinde NIRF Görüntüleme Uygulamaları E "> 6. Simülasyon

1. Kendi kabından doku taklit meme hayalet alın ve düz bir nonfluorescent bir yüzeye yerleştirin. Sonraki, tümör taklit kapanım çıkarılması için yeterli bir çalışma mesafe bırakarak, meme fantom yukarıdaki NIRF görüntüleme cihazı yerleştirin.
2. NIRF görüntüleme ve / veya fantom meme palpasyonu kullanarak tümör taklit floresan dahil yerelleştirilmesine. Hiçbir floresan sinyal tespit edilebilir durumda, içerme ya algılama veya görüntü alma süresi artırılmalıdır için fantom çok derin konumlandırılmış.
3. Dahil lokalize sonra, fantom meme insizyon ve konvansiyonel cerrahi aletler kullanarak gerçek zamanlı NIRF-gözetiminde tümör taklit dahil kaldırın. Alternatif olarak, dahil standart-bakım simüle etmek için görsel denetim ve meme fantom palpasyonuyla sadece rehberlik kesilebilir.
4. Doğrudan uzaklaştırılmasından sonrayetersiz eksizyonu belirten kalan floresan faaliyet için tümör-simüle dahil, görüntü cerrahi kavite.
5. Hiçbir fluoresan sinyali kalana kadar kalan aktivite flüoresan durumda, doğrudan NIRF rehberliğinde dahil kalan kısmının kesip.
6. Eksize fantom fragmanları Görüntü NIRF güdümlü makroskopik sınır durumu değerlendirmesini simüle etmek. Plaklar buna göre 5 mm plaklar ve görüntü - soz, 3 hayalet doku dilim. Cerrahi sınır içine ulaşan floresan sinyali pozitif cerrahi sınır varlığını gösterir.

Sonuçlar

Bu çalışmanın sonuçları, daha önceden başka bir yerde ⁹ bildirilmiştir.

Bizim veri NIRF görüntüleme meme kanseri hastalarında NIRF rehberliğinde meme koruyucu cerrahi simüle, doku taklit meme fantomlarda floresan tümör-simüle kalıntıları tespit uygulanabilir olduğunu göstermektedir. Bizim hayalet modeli kullanarak, uygulanabilir olması (Şekil 2) intraoperatif tümör lokalizasyonu, NIRF güdümlü tümör rezeksiyonu, cerrahi kavite kenarl...

Tartışmalar

Biz entegre tümör simüle kapanımlar ile meme şeklinde fantomlarda kullanımı yoluyla NIRF-güdümlü BCS potansiyel klinik uygulamaları simüle. İntraoperatif tümör lokalizasyonu, NIRF güdümlü tümör rezeksiyon, cerrahi ölçüde değerlendirme ve cerrahi sınırların postoperatif değerlendirme tüm özel-inşa NIRF kamera sistemi kullanılarak uygun bulunmuştur. Floresan tümör taklit kapanım noninvaziv tespiti 2 cm veya daha az bir derinlikte fantom dokudaki konumlandırılmış kapanım için tek u...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine hemoglobin	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	H2500	Simulates absorption of photons in tissue
Intralipid 20%	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	I141	Simulates scattering of photons in tissue
Silicone A translucent 40 (2-components poly-addition silicone)	NedForm, Geleen, The Netherlands		Package consists of components A and B, that should be mixed one on one (A:B=10:1).  Link to manufacturers page: http://tinyurl.com/ncjq7jx
Gelatine 250 Bloom	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	48724	Construction of breast-shaped phantoms
Agarose	Hispanagar, Burgos, Spain		Construction of tumor-simulating inclusions
Tris	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	T1503
HCl	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	258148
NaCl	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	S9888
NaN3	Merck, Darmstadt, Germany	822335	CAUTION: severe poison. The toxicity of this compound is comparable to that of soluble alkali cyanides and the lethal dose for an adult human is about 0.7 grams.
Examples of NIRF imaging devices for intraoperative application:
T2 NIRF imaging platform	SurgVision BV, Heerenveen, The Netherlands		Customized NIRF imaging system used in the current study. More details available at www.surgvision.com
Photodynamic Eye	Hamamatsu Photonics Deutschland GmbH, Herrsching am Ammersee, Germany	PC6100	www.iht-ltd.com
FLARE imaging system kit	The FLARE Foundation Inc, Wayland, MA, USA		www.theflarefoundation.org
Fluobeam	Fluoptics, Grenoble, France		www.fluoptics.com
Artemis handheld camera	Quest Medical Imaging BV, Middenmeer, the Netherlands		www.quest-mi.com
Examples of NIRF fluorescent dyes for intraoperative application:
Indocyanine green	ICG-PULSION,  Feldkirchen, Germany	PICG0025DE	Clinical grade fluorescent dye for NIRF imaging used in the current study. More details available at www.pulsion.com
IRDye 800CW NHS Ester	LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA	929-70021	www.licor.com