JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Özet

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host.

Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Giriş

Lenf düğümleri, yabancı ve öz-antijenlere karşı adaptif immün yanıtları başlatılan ve koordine özelleşmiş bölmeleri bulunmaktadır. Burada sunulan prosedür lenf düğümü, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek ve çeşitli moleküllerinin yüzey ekspresyonunu korumak uygun bir lenf düğümü stromal hücrelerin erişmek için kullanılan otomatik mekanik pipetleme ile birlikte kısa bir enzimatik sindirim açıklanmaktadır.

Lenf nodu stromal hücre üç önemli fonksiyonları lenf nodu iskele oluşturacak ve yerine: ilk onlar vücut sıvıları antijenleri, patojenleri ve onların patojen ilişkili moleküler pattern (PAMP) yanı sıra, sitokinler ve tehlike ilişkili moleküler model örnek filtre (Damps) mevcut Vücutta. İkincisi, etkileşim ve adaptif immün yanıtları başlatmak için antijen sunan hücreler (APC) ve lenfositler çekmek ve talimat; ve üçüncüsü, lenfosit 1 homeostası farklılaşması için yapısal bir ortam sağlamak-3. Inflamasyon lenf düğümü, stromal hücreleri büyüme faktörleri, sitokinler ve kemokinlerin üretimi sırasında, dendritik hücreler (DCler) arasındaki etkileşimi düzenlemek ve böylece, T-ve B-hücrelerinin adapte şişme. Bağışıklık tepkilerinin düzenleme, farklı stromal hücre popülasyonları tarafından meydana getirilen kompleks yapısal mimarisine mümkündür.

Lenf nodülü hücreleri, stromal, CD45 negatif hücrelerdir ve fibroblastik ve endotel hücreleri 1 -6 'de CD31 ile gp38 ifadesi ya da ayırt edilebilir. CD31 + kan endotel hücreleri tanımlar (BEC) -, gp38 + CD31 + lenfatik endotel hücreleri (LIK), gp38 tanımlar: - Gp38 + CD31 (fibroblastik retikulum hücreleri de FRC olarak bilinen TRC) T bölgesi retiküler hücreleri tanımlar. Bundan başka, alt-popülasyonlarının tanımlanması diğer lenf nodu stromal hücrelerin varlığını ortaya çıkarmıştır. Gerçekten de, küçük bir perisit benzeri hücre popülasyonu içinde karakterize edilmiştirgp38 - CD31 - nüfus 7. Bu nedenle, izolasyon prosedürü adaptasyonu farklı lenf düğümü stromal hücrelerin fonksiyonel özelliklerinin tanımlanması ve karakterizasyonu için avantajlıdır.

Lenf düğümü hücreleri, stromal sindirim geliştirilmesi önce lenf düğümü stromal hücrelerin doku çalışma bölümü ve mikroskopi kullanılarak yerinde gözlemlerle sınırlıydı protokolleri. Bununla birlikte, yapısal ve fonksiyonel çalışmalar lenf düğümü stromal hücrelerin önemli özellikleri gösterdi. Lenf nodülü hücreleri, stromal yüksek endotelial lenf nodu subkapsüler sinüs lenf ve ilgili-düşük molekül kütlesi, protein nakil kanal sistemi olarak adlandırılan karmaşık bir 3 boyutlu bir yapı oluşturmak üzere podoplanin, kolajen ve hücre dışı matris (ECM), proteinleri ile ilişkili T hücreleri bölgesinde 8 Venüller. DCler, stroma hücreleri ile yakın temas halinde olan ve boru şeklindeki con içine uzanan gözlemlenebilirDuit yapısı sıvı örneklemek ve antijenleri 8 algılamak için. DCler ile lenf düğümü stromal hücreler (Kızılay ve LECS) etkileşimi, kemokinler CCL21 ve CCL19 9,10 serbest bırakılması ve sunum aracılık eder. CCL19 ve CCL21 lenf nodu T hücre bölgesine 4,11 göç etmek DH'leri ve T hücrelerini kolaylaştırılması CCR7 reseptörü tarafından tanınır. Benzer kemokinlerle kullanarak rağmen, DC'ler ve T hücreleri lenf düğümlerine 12 içine farklı göç yolları var. Daha sonra, lenf düğümü ve saf lenf düğümü stromal hücrelerin izolasyonu enzimatik sindirim kullanılarak, fonksiyonel çalışmalar çeşitli lenf nodu stromal hücrelerin rolü DC'ler ve T / B hücreleri 6,13 ile etkileşim yetenekleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. İlk olarak, IFN-γ üreten efektör T hücrelerinin ve lenf düğümü stromal hücreler arasındaki karışma, ikincil lenfoid organların 14-16 T hücre yanıtları ve çoğalmasını azaltmak için gösterilen metabolit nitrik oksit üretimini indükler. İkinci olarak, lenf Kgazel stromal hücreler, IL-10, 17 üretimi ile düzenleyici DC alt kümelerinden farklılaşmasını desteklemek için ve IL-7 6,18 üretilmesi yoluyla saf T hücre homeostazının modüle bildirilmiştir. Üçüncü olarak, lenf düğümü stromal hücrelerde TLR sentezleme stromal hücreler, doku yaralanması sırasında ortaya çıkan bir enfeksiyon ya da kendi kendini moleküllerden türetilmektedir sinyale duyarlı olduğunu göstermektedir. Gerçekten de, TLR3 poli ligandla lenf düğümü stromal hücrelerin tedavisi (I: C) ile sonuçlanan büyük histo-uyumluluk kompleksi sınıf I ve eş-ifade önleyici molekülün PD-L1 upregülasyonu mütevazı bir düzenlenişini uyarmaktadır değil, birlikte uyaran moleküllerin periferal dokuda dramatik değişiklikler ifadesini 19 antijenleri. Çeşitli gruplar, lenf düğümü, stromal hücreleri periferal doku antijenleri ifade eder ve kendinden reaktif T hücrelerinin 19,21-27 indüklenmesidir göstermiştir. Bu nedenle, lenf düğümü hücreleri ve diğer göçmen ve yeniden arasındaki etkileşimleri anlamaksident lenf düğümü hücreleri iltihap sırasında aktivasyonu ya da bağışıklık tepkilerinin bastırılması sağlamak için yeni bir hedef moleküller bulmak için yardımcı olacaktır. Bu nedenle, lenf düğümü yayınlanmış enzimatik ayırma uygulanması gereklidir.

Daha önce yayınlanmış protokoller düşük mekanik stres 6,19,20 ile kollajenaz tabanlı enzimatik sindirim farklı kombinasyonları kullanın. Bununla birlikte, sindirim enzimlerinin veya sindirim enzim farklı bir kombinasyonu ile uzun inkubasyon aktivasyon durumunu analiz etmek ve yeni lenf nodu stromal hücreleri tanımlamak için gereken çeşitli yüzey molekülleri düşürebilir. Stromal hücre analiz türüne bağlı olarak, bağlantı veya Protokol Protokol Fletcher daha uygun olabilir. Tarif edilen prosedürde, biraz daha kısa bir enzimatik sindirim uygun bir lenf düğümü stromal hücrelerin yüzey işaretleyici zararın en aza düşürülmesi için otomatik mekanik ayrıştırma ile bir araya getirilmektedir. Bu işlem, yüksek ölçüde tekrarlanabilir ayrılmasını sağlayan vedüşük değişkenlik ve% 95 daha fazla canlılığı ile lenf nodu stromal hücre popülasyonlarının ayrım. Taze olarak izole edilen lenf nodülü hücreleri, stromal, doğrudan in vitro fonksiyonel deneyleri gerçekleştirmek için, stromal hücreleri hatlarının yüzey markeri ekspresyonu, protein analizi ve transkripsiyon çalışmalar, hem de kurulması için kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu görüntü yayını ve protokol, tüm hayvan prosedürleri Kanton Kurumu, Basel-Stadt, İsviçre tarafından onaylanan hayvan protokole uygun olarak yapılmıştır.

1. Lenf düğümleri Hazırlama ve Sindirim

  1. Isıtma plakası ile bir manyetik karıştırıcı üzerinde 37 ° C bir cam kapta Ön-ısıtma su.
  2. Aşağıdaki gibi temel Orta hazırlayın: DMEM ortamı (piruvat olmadan),% 2 FCS ile takviye edilmiş, 1.2 mM CaCl2 ve pen / strep (penisilin 100 birim, streptomisin, 100 ug).
  3. Kullanmadan önce tüm diseksiyon aletleri sterilize edin.
  4. CO 2 boğulma başına lenf nodu donör fareler Euthanize ve aseptik lenf düğümleri teşrih. Çevreleyen yağ teşrih etmeyin. NOT: Bu protokol periferik cilt-lenf düğümünde (inguinal, brakiyal, aksiller) için optimize edilmiştir.
  5. 2 ml buz soğukluğunda bazik ortam ihtiva eden steril bir Petri kabı, lenf düğümleri yerleştirin.
  6. Lenf nodu ca Disrupt1 ml şırınga sabit iki 25 G iğne kullanılarak psule.
  7. 1 mg / ml kollajenaz IV, 40 ug / ml DNAz I ile takviye edilmiş 750 ul Temel ortamı içeren 5 ml'lik bir polipropilen yuvarlak dipli tüp içinde kesintiye lenf nodu doku aktarın
  8. Her bir tüp bir manyetik karıştırıcı, steril ekleyin.
  9. 37 ° C ile çanak içinde yer tüpün artık su ısıtılır ve 30 dakika boyunca yavaş bir hızda (1 tur / sec) tüplerini karıştırın.
  10. Isıtma plakası ile manyetik karıştırıcı gelen tüp çıkarın ve lenf nodu fragmanları halledelim.
  11. Dikkatle "non-stromal hücre" zenginleştirilmiş süpernatant kaldırmak. NOT: T, B, dendritik hücreler ve CD45 analizi ise - gp38 - CD31 - öngörülen, "non-stromal hücreler" kısmını kaydedin.
  12. Yıkama 750 ul ortam maddesi ile bazik lenf düğümü dokusu kalmıştır. NOT: Bu adım, bağışıklık yetkin fareler ile çalışan sadece gereklidir.
  13. Lenf nodu fragmanları halledelim.
  14. Kaldırolmayan stromal hücre-yüzen fraksiyonu.
  15. 750 ul temel orta 3,5 mg ile takviye lenf nodu fragmanları Ekle / ml kollajenaz D ve 40 ug / ml Dnase I.
  16. Lütfen 37 ° C de içeren beher içinde yer tüpün artık su ısıtılır.
  17. Yavaş yavaş karıştırılırken buna 5 dakika boyunca lenf nodu dokusu Digest.
  18. Pipetleme ve çok kanallı otomatik pipet kullanılarak maksimal hızda, 10 döngü boyunca 700 ul karıştırılarak Ayrık lemf nod dokusu parçalan olabilir. NOT: Bu sindirim geliştirmek için lenf nodu doku bozar.
  19. 37 ° C'ye ısıtılmış su ile tekrar beher tüpü yerleştirin.
  20. Yavaş yavaş karıştırılırken buna 10 dakika daha Özet lenf nodu dokusu parçalan olabilir.
  21. Pipetleme lemf nod dokusu parçaları parçalamak ve bir çok kanallı otomatik pipet kullanılarak maksimal hızda, 99 çevrim için karıştırılması.
  22. Tek bir hücre süspansiyonu bakımı için, 0.5 M EDTA, 7.5 ul ekleyin.
  23. Boru itibariyle ayrılmış lemf nod dokusu parçalantting ve çok kanallı otomatik pipet kullanılarak maksimal hızda, 99 çevrim için karıştırılması.
  24. 750 ul temel orta ekleyin ve 70 mikron naylon örgü ile hücrelere geçerler.
  25. Santrifüj Hücre süspansiyonu 1500 xg'de 5 dakika, 4 ° C.
  26. Stromal hücreler, bundan başka analizler için de kullanılabilir.

Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin 2. Boyama

  1. Başarılı bir şekilde TRC LEC BEC DN hücreleri tanıyan anti-CD45, anti-podoplanin (gp38), anti-CD31 antikorlarının bir kombinasyonu kullanılır.
  2. Anti-gp38-PE (1: 200), anti-CD31-APC (1: 200), 100 ul HBSS içinde 2 ihtiva eden: Canlı / Ölü izleyici, bir anti-CD45-FITC (200 1) ile sindirilmiş lenf düğümü dokusu inkübe karanlıkta en az 20 dakika, 4 ° C,% FCS için.
  3. % 2 FCS ihtiva eden HBSS 500 eklenmesinin Hücreleri yıkamak
  4. Santrifüj Hücre süspansiyonu 1500 xg'de 3 dakika, 4 ° C.
  5. % 2 FCS içeren HBSS 100 ul yeniden askıya.
  6. Equipp bir akış sitometresinde boyalı hücrelerin çalıştırınAşağıdaki optik ile ed: uyarma kadar üç lazer ile kaynak: mavi (488 nm, hava soğutmalı, 20 mW katı hal), kırmızı (633 nm, 17 mW HeNe), mor (405 nm, 30 mW katı hal) .
  7. Kapısı CD45 - hücreler hematopoietik hücreleri hariç.
  8. Kapısı mayoları (FSC-W) ve canlı hücreleri (CANLI / DEAD izci) ikilileri ve ölü hücreleri hariç.
  9. , LEC (gp38 + CD31 +), BEC (gp38 - CD31 +) ve DN (gp38 - CD31 -) hücreleri (Şekil 1) - CD31 vs Arsa gp38 TRC (gp38 + CD31) görselleştirmek için.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Mevcut protokol nedeniyle bir çok kanallı otomatik pipet ile mekanik çözümlemesiyle kısa bir sindirim süre (45 dk maksimum) ile Bağlantı ve ark., 6, 2007 tarafından yayınlanan bir modifiye sindirim protokoldür. Buna ek olarak, işlem, daha standart, farklı lenf düğümü stromal hücrelerin yüzey markerlerinin bozulmasını en aza indiren ve aynı anda birden fazla numunenin kullanılması mümkün olur.

Collagenasein IV ve Kollagenaz D Fletchers protokolü...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Lenf nodu stromal hücrelerin çalışması nedeniyle son zamanlarda yayımlanmış iki sindirim protokolleri 6,13 gelişimine bir araştırma odağı haline geldi. Her iki protokol tek bir lenf düğümü stromal hücreler elde etmek için yeterli, ancak sindirim enzimlerinin kullanılması ve sindirim zaman içinde farklılık gösterir. Stromal hücreler ve onların yüzey belirteçleri enzimatik sindirim ve mekanik strese karşı hassas olduğu için, optimize edilmiş bir protokol gereklidir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

The authors declare they have no competing financial interests.

Teşekkürler

The authors thank Sanjiv Luther and colleagues for helpful discussions in establishing the current lymph node digestion protocol. This work was supported by SNF grants PPOOA-_119204 and PPOOP3_144918 to S.W.R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMLifeTechnologies-Gibco41965-039
FCSFinal concentration 2%
CaCl2Sigma499609Final concentration 1.2 mM
Collagenase IVWorthington Biochemical Corporation>160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml
Collagenase DRoche11088882001use at 3.5 mg/ml
DNAse IRoche 11284932001use at 40 µg/ml
Stiring magnetsFAUST5 mm long-2 mm ø
Polystyrene round bottom tubes 5 mlFalcon-BD Bioscience
Magnetic stirrer with heating functionIKA-RCT-standard9720250
Petri dishes 100 mm, sterileTPP6223201
25 G needlesTerumo
anti mouse CD45 AbBiolegendClone 30-F11
anti mouse CD11c AbBiolegendClone N418
anti mouse Podoplanin AbBiolegendClone 8.1.1
anti mouse CD31 AbBiolegendClone MEC13.3

Eppendorf Xplorer plus, Multichannel		Eppendorf4861 000.821/8301.250 µl max. volume
anti mouse CD140aBiolegendClone APA5
anti mouse CD80BiolegendClone 16-10A1
anti mouse CD40BiolegendClone 1C10
anti mouse I-AbBiolegendClone AF6-120.1
anti mouse CD274 (PD-L1)BiolegendClone 10F.9G2
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kitInvitrogenL10119

Referanslar

  1. Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
  2. Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell - Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).
  3. Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nature Reviews Immunology. 10 (12), (2010).
  4. Bajénoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
  5. Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes. The Journal of experimental medicine. 200 (6), 783-795 (2004).
  6. Link, A., et al. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nature Immunology. 8 (11), 1255-1265 (2007).
  7. Malhotra, D., et al. Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks. Nature Immunology. 13 (5), 499-510 (2012).
  8. Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of experimental medicine. 192 (10), 1425-1440 (2000).
  9. Sixt, M., et al. The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node. Immunity. 22 (1), 19-29 (2005).
  10. MartIn-Fontecha, A., et al. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming. The Journal of experimental medicine. 198 (4), 615-621 (2003).
  11. Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (23), 12694-12699 (2000).
  12. Braun, A., et al. Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration. Nature Immunology. 12 (9), 879-887 (2011).
  13. Fletcher, A. L., et al. Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells. Frontiers in immunology. 2, 35(2011).
  14. Lukacs-Kornek, V., et al. Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes. Nature Immunology. 12 (11), 1096-1104 (2011).
  15. Siegert, S., et al. Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide. PLoS ONE. 6 (11), e27618(2011).
  16. Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. Regulation of T cell priming by lymphoid stroma. PLoS ONE. 6 (11), e26138(2011).
  17. Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells. Immunity. 21 (6), 805-816 (2004).
  18. Onder, L., et al. Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation. The Journal of experimental medicine. 210 (3), 465-473 (2013).
  19. Fletcher, A. L., et al. Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. The Journal of experimental medicine. 207 (4), 689-697 (2010).
  20. Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends in Immunology. 32 (1), 12-18 (2011).
  21. Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
  22. Lee, J. -W., et al. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).
  23. Nichols, L. A., et al. Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol. 179, 993-1003 (2007).
  24. Gardner, J. M., et al. Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science. 321, 843-847 (2008).
  25. Gardner, J. M., et al. Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells. Immunity. 39, 560-572 (2013).
  26. Magnusson, F. C., et al. Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity. Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).
  27. Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm nolojiSay 90lenf nodulenf nodu stromal h crelersindirimizolasyonenzimlerfibroblastik retik ler h crelenfatik endotel h crekan endotel h cre

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır