Tandem Yüksek basınçlı Donma ve Transmisyon Elektron Mikroskobu için Bitki Doku Hızlı Dondurma Değişiklik

Özet

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Özet

1940'larda transmisyon elektron mikroskobu (TEM), biyolojik malzemelerin ultra-yüksek çözünürlüklü görüntüler biyologlara vermektedir beri. Ancak, çünkü aynı zamanda artifakttan ücretsiz numune hazırlama deneyimi talep zahmetli ve zaman alıcı protokoller, TEM kullanıcı dostu bir tekniği olarak kabul edilmez. TEM için numune hazırlanması geleneksel hücresel yapıları korumak için kimyasal tespit kullanılır. Yüksek basınçlı dondurma, bu şekilde selüler genel yapının bütünlüğüne zarar verir buz oluşumunu kısıtlayan çok hızlı soğutma oranlarının, elde etmek için yüksek basınç altında, biyolojik numunelerin cryofixation olan. Yüksek basınçlı dondurma ve dondurularak ikame şu TEM için reçine bölümlerde yüksek kalitede morfolojisini üretmek için tercih edilen yöntemlerdir. Bu yöntemler, genellikle ince kesitlerin TEM için geleneksel işlemler ile bağlantılı etkilerini en aza indirmek. Cryofixation sonra numunenin donmuş suyun sıvı ile değiştirilirDüşük sıcaklıklarda bir organik çözücü, bir ikame olarak adlandırılan bir süreç, dondurularak. Freeze ikame tipik adanmış, pahalı ekipman birkaç gün içinde yapılır. Yeni bir yenilik yerine her zamanki iki gün, işlem üç saat içinde tamamlanması sağlar. Bu, tipik olarak süzülmesini ve kesit önce epoksi reçineleri gömme içeren örnek hazırlama birkaç gün daha fazla takip eder. Burada bitki örneğinin tespit saat içinde gerçekleştirilebilir sağlayan yüksek basınçlı donmayı ve hızlı dondurma ikamesi birleştiren bir protokol mevcut. Protokol kolayca, diğer dokular ya da organizmalar ile çalışmak için adapte edilebilir. Bitki dokuları, çünkü su buzsuz dondurma engel gaz alanları ve suyla doldurulmuş vakuollerin varlığında özel bir endişe vardır. Buna ek olarak, kimyasal sabitleme süreci, doku içinde derine kimyasal maddelerin penetrasyonunu engelleyen hücre duvarları dolayı, bitkiler içerisinde, özellikle uzun. Bitki dokuları, bundan dolayı parçacık halinde olan, taahhüde zorlu, bu protokol, güvenilir ve yüksek kalitede örnekleri üretir ama.

Giriş

Hücre ultrastrüktürü bilgilerimiz birkaç nanometre ¹ aralığında ayrıntıları çözebilir elektron mikroskobu, ağırlıklı olarak geliyor. Numune hazırlama zaman alıcı ve zahmetli protokolleri gerektirir ve uygulayıcısı bazı uzmanlık gerektirir gibi çözünürlükte TEM kadar güçlü olmasına rağmen, kullanıcı dostu olarak kabul edilmez. Numunelerin Geleneksel tespit reçine içinde yerleştirilmesi ve daha sonra, ağır metaller ile boyanır ultra-ince kesitlerin kesit, dehidratasyon içerir, ilave işlemden önce aldehit ve ozmiyum tetroksit kullanımını birleştirmektedir. Ancak, kimyasal sabitleme sonuçta çeşitli hücresel bölmeleri ² etkileyecek zarlarında protein toplama ve lipidlerin ¹ kaybı ve değişiklikleri içeren eserler üretebilir bilinmektedir. Bu eserler büyük ölçüde oda sıcaklığında ^{3, 4, 5,} fiksasyon ve dehidratasyon yavaş hızı atfedilir.

yüksek basınç dondurma (HPF) tarafından cryofixation kimyasal sabitleme kaynaklanan eserler en önler. Cryofixation çalışma prensibi ^7. HPF bir ^azalır, 20 derece, suyun donma noktasını düşüren buz kristallerinin çekirdeklenme ve büyüme yavaşlar ve hücresel bileşen, esasen ⁶ immobilize edilir, böylece bir biyolojik numunede suyun viskozitesini arttırdığına olduğu milisaniye olarak çok yüksek basınçlı (210 MPa veya 2100 bar) altında sıvı azot edilene numunesinin sıcaklık. Düzgün yapılmazsa HPF hücre ultrastrüktürdeki büyük zarar verebilir büyük buz kristallerinin oluşumunu önler. HPF biyolojik çözünen ⁷ tipik konsantrasyonları, 100-200 um kalınlığında örnekleri saptamak için kullanılabilir. HPF, örneğin ^{1, 7, 8} yatan sayısız fizik yorum ve ilkeler vardır.

HPF sonra numuneler -90 ve düşük bir sıcaklıkta (-78.5 ° C enkübe edilirGenellikle birkaç gün boyunca osmiyum tetroksit gibi bir organik çözücü içeren sıvı kimyasal tespit, mevcudiyetinde ° C); 176.. Bu düşük sıcaklıkta, numunedeki su, organik bir çözücü, tipik olarak, aseton veya metanol ^{1, 9} ile değiştirilir. Bu yüzden, bu işlem olarak adlandırılır dondurularak ikamesi (FS) göstermektedir. Numune, daha sonra yavaş yavaş ısıtılır ve bu süre içinde genellikle ozmiyum tetroksit ve uranil asetat ⁹ ile sabitlenir. Düşük sıcaklıklarda çapraz bağlama molekülleri ¹ hareketsiz sabitleme avantajına sahiptir. FS bu yüzden geliştirilmiş bir ince yapı korunmasını sağlar, özellikle oda sıcaklığında, geleneksel kimyasal tespiti ile tespit kıyasla üstün kaliteli, antijenisite daha iyi korunması örneklerini üreten ve bağlanmamış hücre bileşenlerinin ^{10, 11} kaybının azaltılması.

En FS tipik olarak birkaç güne kadar, çok uzun süreler boyunca gerçekleştirilir. Bu durum, özellikle bir trubitkilerin örnekleri ^{12, 13, 14} e. McDonald ve Webb tarafından geliştirilen yeni bir protokol ölçüde birkaç saat ¹⁵ birkaç gün FS süresini azaltır. Süper hızlı FS (SQFS) numuneler 90 dakika içinde işlenirken onların hızlı dondurma ikamesi (QFS) prosedürde, FS, 3 saat boyunca gerçekleştirilir. Bu yöntemlerle üretilen örneklerin kalitesi geleneksel fs protokolleri ile elde edilen değerler ile karşılaştırılabilir olan. Biz HPF sonra bitki örneklerinin sonraki işlemlerde QFS protokolü kabul etmiştir. QFS ve SQFS yerine pahalı piyasada mevcut FS makineleri ortak laboratuvar ekipman kullanımı gibi bu zaman ama para değil, sadece kazanmak için kanıtlanmıştır.

Bitki dokusu sık sık TEM hazırlanmak için çok zorlu. Ortalama olarak, bitki hücreleri, bakteri ya da hayvan hücreleri ya da daha büyüktür. Hidrofobik balmumsu üstderi, kalın hücre duvarları, organik asitler, hidrolazlar ve fenolik içeren büyük c suyla doldurulmuş vaküollerin varlığıiyodu olduğu gibi toplam hücre hacmi ^16% 90 kadar işgal edebilir ve hava ile temas yerlerin bulunması ciddi sistemin ¹⁷ ısı iletkenliği azalır. Bundan başka, bitkilerin durumunda, örnek kalınlığı hemen hemen her zaman 20 um, kimyasal sabitleme amaçlı limiti aşar. Bu kalınlıktaki, suyun düşük ısı iletkenliği, numunenin merkezinde bir dondurma oranı en fazla -10.000 ° C / saniye önler. Bu oran zarar altıgen buz oluşumunu (daha düşük bir yoğunluğa sahip buz kristalleri ve daha büyük 10-15 nm) kaçınmak için gerekli olan ^8. Birlikte, numune ve sonraki FS hem uygun donma bu mevcut sorunlar. Bununla birlikte, cryofixation bitki örneklerinin tespiti için en iyi yöntemdir. İşte bitki doku örneklerinin HPF-QFS için bir protokol sunulmuştur. Bu modeli türleri Arabidopsis thaliana'nın odaklanır, ama aynı zamanda Nicotina benthamiana'nın ile kullanılmıştır. Tipik sonuç HPF-QFS sa ürettiğini göstermektedirzamanın bir kısmını geleneksel HPF-FS karşılaştırılabilir kalitede örnek olarak şunlar verilebilir. Uygun düzenlemeler ile, bu protokol, aynı zamanda, nispeten kalın, diğer biyolojik örnekler için kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: QFS prosedür kullanıcı tarafından aşırı özen ve dikkat gerektirir ve biz uygulanabilir Dikkatler ve Notlar gibi burada bu güvenlik önlemlerini vurgulayın.

HPF Run için 1.Preparation

1. Numune hazırlama başlamadan önce, üreticinin yönergeleri izleyerek yüksek basınçlı dondurucuda açın.
   NOT: Bu protokolde kullanılan BBA birimi Wohlwend Kompakt 02 ünite (Şekil 1A) ve HPF başlaması için çalışır önce start-up prosedürünün bir-ve-bir buçuk saat yaklaşık bir sürer.
   1. Wohlwend Kompakt 02 Yüksek Basınç Dondurucu Açma.
      1. "1" den "0" ana şalteri çevirerek aracı çalıştırınız.
      2. Makineye basınçlı hava bırakın.
      3. Makineye sıvı nitrojen bırakın.
      4. Basın "SİSTEM KURU YUKARI" düğmesine basın.
      5. 30 dakika sonra, "sisteminin gelişmesini basınM KURU YUKARI "butonuna tekrar.
      6. Basın "ON / OFF" düğmesine enstrüman açmak için.
      7. "AZOT" düğmesine basın.
      8. Düğmesinin "IN DRIVE" zaten yaktı olsa bile makine 20 dakika soğumasını bekleyin.
      9. Yukarı düğmesine ışıkları "IN DRIVE".
      10. Düğmesinin "IN SÜRÜCÜ" tuşuna basın.
      11. "AUTO" tuşuna basınız.
      12. "SİSTEM HAZIR" düğmesi yanar.
      13. Basınç odasına, sıcaklık ve basınç sensörünün ve pimle kilitlemek.
      14. "JET AUTO" düğmesine basın. Arzu edildiği gibi basınç artışı ve sıcaklık azalması olduğunu kontrol eder Bu adım; aslında bir deneme. Sıcaklık ve basınç keskin bir artış gösterdiği keskin damlası (Şekil 1B) beklenmektedir.
      15. Iki JET döngüleri yürütmek.

Receivi 2. Hazırlıkng Donmuş numuneler

1. Sahipleri tamamen (Şekil 1C) kaplıdır, böylece sıvı nitrojen ile kriyotüpe sahiplerine içeren yalıtılmış kutusu doldurun, (Güvenlik Uyarılarını bakınız).
   NOT: Sıvı azot tutarken Kullanım KKE cryogloves ve gözlük dahil.
2. Sıvı azot (Şekil 1C) olarak alüminyum tüp yuvalarına FS orta içeren flakon uygun sayıda yerleştirin. Dört diskler için bu protokol ile tek bir örnek içeren her bir tek cryovial yerleştirilebilir.
   NOT: Şişeler elmas uçlu kâtip ve çok yumuşak kurşun kalem gibi keskin bir aletle ile etiketlenmiş olmalıdır.
   1. QFS esnasında sabitleyici aseton ^9% 1 OsO ₄ ve% 0.1 uranil asetat kullanır. Sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve cryovials deposuna 1,5 ml hacimde dağıtılması, büyük hacimde çözelti hazırlayın.
      NOT: OSO ₄ ve Uranil asetat işleme için Güvenlik Uyarılarını izleyin.
      NOT: OsO ₄ ve Uranil asetat tehlikeli kimyasallar ve kapalı burunlu ayakkabılar, laboratuvar önlüğü ve eldiven gibi uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyerek davlumbaz ele alınmalıdır.
      NOT: QFS için örnek tutmak için kullanılan cryovials tüpler OSO ₄ sızmasını önlemek için QFS sırasında mühürlü kalmasını sağlamak için sert bir O-ring olmalıdır.
3. Hamur pürüzsüz olana kadar bir kürdan veya diğer bir araç ile,% 10 metanol, kabaca eşit hacimde fırıncı mayası karıştırılarak maya hamurunu hazırlayın. Maya macun, hücre dışı bir dondurarak saklama koruyucusu gibi hareket eder ve numune taşıyıcıya numune etrafında alanı doldurmak için kullanılır. Macunun miktarı numune sayısına bağlıdır; 10 numune veya daha az macun (1 mi), bir mikrosantrifüj tüpü içinde karıştırılmıştır de kullanılabilir.

Örneklerinin 3. Yüksek basınçlı Donma

1. Bitkinin ilgi çekici bir yaprak (veya başka doku) çıkarın ve yavaşça Denta bir parça üzerine yerleştirinl balmumu veya diğer kesme yüzeyi. Yapraktan dışarı bir örnek kesmek için, 2.0 mm ya da istenilen büyüklükte bir zımba kullanarak. Forseps bir çift ile hafifçe örnek Kulp ve mümkün olduğunca hızlı bir şekilde çalışır.
2. Bir mikroskop altında çalışarak, A Tipi numune taşıyıcı 0.2 mm yan yaprak disk yerleştirmek ve maya macun tamamen kapsamaktadır. Disk tamamen dolu olduğundan emin olun ve hamur ince bir fırça (Şekil 2) ile macun düzleştirilir tutucunun kenarı ile aynı seviyededir.
3. Numune tutucu içindeki taşıyıcı yerleştirin. Tip B numune taşıyıcı, düz bir yüzeye aşağı örnek örtün.
   NOT: örnek tutucu Kuru ve oda sıcaklığında olmalıdır.
4. , Numune tutucu örnek alın makineye takın ve bir veya iki saniye içinde tamamlanacaktır "JET OTO" düğmesine basarak bir donma döngüsü başlatmak.
5. Mümkün olduğunca çabuk Çalışma, makineden tutucusunu çıkarın ve samp tutan ucu yerleştirinle HPF makinesinin üzerinde yalıtılmış bir kutu ile sıvı azot içine. Bunların soğuk sıvı azot içinde forseps iki çift ipuçları bırakın.
   NOT: dondurulduktan sonra, taşıyıcılar sadece sıvı azot soğutmalı forseps ile ele alınmalıdır. Sıcak (oda sıcaklığı) forseps sık cryotechniques başarısızlık nedenidir.
6. FS ortamı ihtiva eden bir cryovial açın ve kutunun yan kapağı yerleştirin. Sıvı nitrojen soğutmalı bir çift forseps yardımıyla yavaşça disk sıvı azot ya da buharında sürekliliği garanti altına, örnek tutucudan dışarı diski çıkarın. Sıvı azot buharında çalışan, bir ön-soğutulmuş forseps ile FS tüpü tutmak ve FS flakon tutucu yerleştirmek için diğer kullanın. Geri FS şişenin kapağını takın. Değil kapanı şişe içinde herhangi bir sıvı azot yapın.
   NOT: QFS için cryovials herhangi bir sıvı azot şişelerde tuzak olduğundan emin olmak için numuneler aktarılması. Sıvı azot ısınma ve herhangi Trappe sırasında 700 kat genişletird sıvı azot, bu süre içinde patlamasına yol açabilir.
7. İstenen tüm numuneleri dondurulmamalıdır kadar tekrarlayın 3,1-3,7 adımları. Örneğin aynı türünü içeren birden fazla yaprak diskleri maddesi aynı şişe içinde yerleştirilebilir. Örnek tutucu kurutuldu ve dondurma çalışmalar arasında, oda sıcaklığına getirildi gerektiğini not edin. Hızlı Bunu yapmak için, bir fön makinesi ile ısıtın ve dokunma ile onun sıcaklığını izlemek.

Freeze Değişiklik 4. Hazırlık

1. Tamamen 10 dakika boyunca ya da çekirdek kaynama duruncaya kadar sıvı azot içinde alüminyum ısıtıcı blok bırakın. Bu devam ederken, FS odası (Şekil 3) olarak kullanılan kabın alt kuru buz (1-2 cm) 'lik bir tabaka yerleştirin. Plastik bir kap veya buz kovası ezilmiş kuru buz veya topaklar ile birlikte, FS için kullanılabilir.
2. Hızlı bir şekilde ısıtıcı bloğun orta satırlar halinde sıcaklık probu ile birlikte numuneleri içeren cryovials yerleştirin. Emin olun ki üzerinde kapaklarıFS medya FS sırasında akmaması böylece flakon sıkıca vidalanır. Sıcaklığı kaydetmeye başlarsınız.
   1. Bu tüpün alt kısmını ulaşacak şekilde, bir dondurarak saklama viali üst kısmından, bir termokupl yerleştirerek sıcaklık probu olun. Reçine ile tüpün kapağını böylece hiçbir sıvı sızıntısı üzerinden sıkıca kapatın. Her QFS çalışma başında 1.5 ml aseton ile tüp doldurun.
3. Yalıtımlı cryogloves veya büyük forseps kullanarak, ısıtıcı blok tüm sıvı nitrojen dökmek. Kriyotüplerin dışarı dökmek için değil dikkat edin.
   NOT: Sıvı azot tutarken Kullanım KKE cryogloves ve gözlük dahil.
4. QFS bölmesi içinde kuru buz tabakası üzerine şişeleri içeren blok yerleştirin. Blok tüpler yatay yalan böylece yerleştirilmiş ama hafif yukarı doğru eğim ile emin olun. Doğru cryovials kullanıldığında, herhangi bir sızıntı olmalıdır.
5. FS tüpler sahiptir, böylece gerekli olmamasına rağmen, kuru buz ile QFS haznesi paketibloğun üst kapağı. Oda üzerindeki kapağı yerleştirin.

5. Hızlı FS

NOT: OSO ₄ bir kaçak yanlışlıkla başka önlemlere rağmen meydana durumunda bir davlumbaz QFS çalıştırması yapın.

1. Bir çeker ocak içinde, bir eklemli döner bir karıştırıcı üzerinde QFS odasına yerleştirin ve 120 dakika boyunca 125 rpm'de döndürün. Bu süre boyunca, bloğun sıcaklığı, yaklaşık -80 ° C'ye kadar yavaş yavaş artırmalıdır. Ajitasyon daha FS bileşenlerinin karışma sağlar.
   NOT: Bir çeker ocak içinde karıştırıcı ve bir davlumbaz kapı pozisyonuna yerleştirilmesi QFS uygulama boyunca numune tutarlı ısınma sağlamak için çalıştıkları her QFS için aynı olmalıdır.
2. Odasından kuru buz çıkarın ve bir saat daha çalkalamaya devam edilir.
   Not: sıcaklığı yaklaşık -15 ° C ila -20 ° C'ye kadar artmalıdır.
3. QFS odasından örnekleri ve sıcaklık probu çıkarın ve üzerine yerleştirinBaşka bir 10-15 dakika boyunca oda sıcaklığında bir çalkalayıcı, dek oda sıcaklığına ulaşır. Sıcaklığını Kaydı durdur.
4. FS sırasında, HÖF makineyi kapatın.
   1. HPF makine nitrojen ile doldurulur esnasında sıvı azot tankın musluğu kapatın.
   2. "AZOT" düğmesine basın.
   3. Kırmızı "PİSTON AŞAĞI" ışık sönene kadar bekleyin.
   4. "ON / OFF" tuşuna basınız.
   5. Basın "SİSTEM KURU YUKARI" düğmesine basın.
   6. Makineye basınçlı hava kaynağını kapatmak için kullanılır.
   7. 12 saat sonra en az, (herhangi bir nem kurumasını sağlamak için) "0", "1" den ana şalteri çevirerek makineyi kapatın.

6. Post FS İşleme

1. Dikkatle zehirli atıklar için uygun bir konteynere plastik transferi pipetler ve yer ile FS ortamı çıkarın.
   NOT: OsO ₄ ve Uranil asetat tehlikeli kimyasallardırkapalı-parmaklı ayakkabı, laboratuvar önlüğü ve eldiven gibi uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyerek ve davlumbaz ele alınmalıdır.
2. Yıkama numuneler% 100 aseton ile dört kez. İlk iki yıkar toplayın ve zehirli atık konteynerine yerleştirmek.
3. Ince forseps kullanarak, sahiplerinden doku örneklerini kaldırmak. Bu yapıldığı gibi aseton ile ıslak örnekleri tutmak ve kırma örnekleri önlemek için çok hafifçe çalışır.
   NOT: Bu sıradışı değildir ve aslında maya paste bu noktada uzak örneklerinden düşmek için yararlı olabilir. Yaprak dokusu hala yeşil iken maya macun genellikle çok koyu kahverengi.
4. Aseton içeren cryovials örnekleri alınmalıdır. Her zamanki protokollere göre TEM için numune hazırlama (infiltrasyon ve gömme) ile devam edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Aşağıda sunulan sonuçlar HPF için bir Wohlwend İlkeler 02 (Şekil 1A) kullanılarak elde edilmiştir. Bu aletin önemli bir avantajı, numune taşıyıcılar ve taşıyıcılarıyla kullanım kolaylığıdır. Diğer aletleri kullanırken, McDonald iki kullanıcı diğer dondurulması yapar ve FS transfer ⁹ cryovials ederken örneklerini hazırlamakta numune hazırlığı ve HPF, bir yürütmek gerektiğini önerir. Ancak, Wohlwend taşıyıcılar ve tutucu bir tek kullanıcının bağ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada sunulan protokolün başarısı kullanıcıya büyük ölçüde bağlıdır. İlk olarak, gelişmiş hazırlık gerekli tüm maddeler kolaylıkla edinilebilir ve bütün bir HPF-QFS çalıştırmak tamamlamak için yeterli miktarda olmasını sağlamak için gereklidir. İkinci olarak, kullanıcı ve böylece doku yerli durumda değişiklikleri en aza indirerek, örnek işlemlerine en aza indiren bir verimli bir şekilde adım-adım için hareket, hızlı bir şekilde çalışmalıdır. Örnekleri dondurulmuş ve...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine	Technotrade International, Inc	HPF02	With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display  of freezing parameters
Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers	Technotrade International, Inc	290
Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A	Technotrade International, Inc	241-200
Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B	Technotrade International, Inc	242-200
Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20	Chart
Baker's yeast			The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production
Tooth picks
Thermocouple data logger EL-USB-TC	OMEGA Engineering Inc.	OM-EL-USB-TC	Replacement battery purchased separately
Temperature probe	Electron Microscopy Sciences	34505
Heater block 12/13 mm
Rotary shaker	Fisher Scientific	11-402-10
Leaf punch - Harris Uni-core 2.00	Ted-Pella Inc.	15076
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	72660
Cryogenic vials 2 ml	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Methanol
Blow dryer
Dry ice
Liquid nitrogen
Acetone
Forceps			Several pairs